基因表达与调控的研究技术
基因表达与调控在癌症中的作用研究
基因表达与调控在癌症中的作用研究癌症是全球范围内一个严重的健康问题，每年有数百万人被诊断出患上该疾病。
其发病率和死亡率的上升趋势已经引起了全球的关注。
因此，了解癌症发生的原因和机制对于制定预防和治疗策略具有非常重要的意义。
基因表达与调控在癌症中的作用研究是当前癌症生物学研究的热点之一。
基因表达是指DNA序列的信息被转录粘贴成mRNA的过程，同时mRNA转录成蛋白质的过程称为翻译。
基因表达的过程本身是复杂的。
在这个过程中，许多调节因子包括转录因子、miRNA和长链非编码RNA介导对mRNA稳定性和翻译率的调节。
基因表达与调控在癌症的组织特异性和细胞分化中起着重要作用。
最近研究表明，在癌症中，基因表达水平的改变，主要取决于DNA突变和外部因素的作用，如化学物质的暴露、病毒感染等。
这些因素在癌症发生和发展的过程中起着关键作用。
在癌症中，基因表达发生的异常主要表现为三种类型：染色体结构的改变、基因变异和表观遗传变化。
其中染色体结构的改变包括常染色体上的缺失、重复、倒位、易位等。
基因变异是指发生在基因序列中的改变，包括点突变、缺失、插入和倒置等。
而表观遗传变化是指DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等的修饰。
这些异常改变导致了基因表达水平的异常，从而影响癌症细胞的增殖、转移和移行能力等，最终影响了癌症的发展。
基因表达与调控在癌症中的研究不仅有助于我们深入了解癌症的机制，还为新一代癌症诊断和治疗方法的深入研究提供了更多的思路。
研究人员通过应用现代技术研究癌症中基因的表达水平和功能的改变，可以在分子层面上解析癌症发生的机制。
他们还通过使用CRISPR/Cas9技术进行基因组编辑，切断恶性肿瘤细胞中突变基因的学习，从而实现了治疗癌症的效果。
研究人员同时也通过组学方法来检测表观遗传变化和RNA表达谱的变化。
在这方面，RNA测序技术是非常实用的，可以用于检测差异表达基因和RNA剪切的异常。
这些技术不仅可以提供癌症从生物学角度的研究，还可以为开发新的靶向治疗方法提供更有利的方案。
什么是基因调控技术？
什么是基因调控技术？基因调控技术是一种能够精准地调节生物体基因表达的技术。
在科学界的研究中，基因调控技术被广泛应用于研究生物发育、疾病治疗等领域。
实际上，基因调控技术的运用范围已经越来越广泛，展现出了其强大的研究价值与应用前景。
接下来，我们将从多个方面介绍基因调控技术相关知识。
一、基因调控技术是什么？基因调控技术是一种能够改变基因表达水平的技术，从而调控生物体代谢活动和细胞功能的一种新型技术。
可以通过多个途径对基因进行调控，例如：在基因上引入抑制或促进因子，改变基因的剪接方式，改变基因序列等等。
这些方法都能够在不改变基因序列的情况下改变基因表达水平，从而影响生物体的发育、代谢和免疫等重要生物功能。
二、基因调控技术的应用基因调控技术有很多应用，它可以被运用在许多领域。
其中一个主要的应用领域是基因治疗。
基因治疗是一种治疗疾病的新型方法，它能够通过改变患者体内的基因组活动来治疗疾病。
目前基因治疗在治疗遗传疾病、癌症等方面已经显示出了很好的效果。
另一个应用领域是精准医学。
通过基因调控技术，我们可以实现对个体基因信息的高精度分析和个性化诊疗。
这种方式可以让医生针对不同的患者制定出针对性的治疗方案，从而提供更好的疾病预防和治疗效果。
除此之外，基因调控技术还可以应用于传染病研究、农业科技、生产生物学等多个领域。
可以预见，在未来的发展中，基因调控技术将会在多个领域发挥出更多巨大的作用。
三、基因调控技术的争议尽管基因调控技术有着非常广阔的应用前景，但它仍然存在着一些争议。
首先，基因调控技术对基因修饰的精确度问题始终是争议的热点。
虽然现在已经有了很多基因编辑技术，但它们仍然可能会引起一些意想不到的、不良的变异效应。
其次，基因调控技术还引发了生物伦理这一方面的问题。
这种技术可能会促进基因优化，但如果在未来被应用到人类身上，就可能会导致一些不可预见的、不良的影响。
这是一个十分棘手的问题，并且需要我们加以妥善处理和探讨。
基因表达调控机制的研究进展及趋势
基因表达调控机制的研究进展及趋势随着基因技术的快速发展，越来越多的科学家开始关注如何理解和利用基因信息。
基因表达调控机制就是其中的重要组成部分。
基因表达指的是基因转录成RNA的过程，而基因表达调控则是指何时和如何触发这个过程。
它涉及到如何控制基因的开关，让它们在适当的时候以适当的方式表达出来。
下面将介绍一些基因表达调控机制的研究进展与趋势。
1. 序列特异性调控在基因表达调控中，序列特异性调控是指基于DNA序列的特异性的调控方式。
这种调控方式主要发挥作用的是转录因子，它们可以结合到DNA上的特定区域，从而调控基因表达。
研究发现，转录因子的数量是非常庞大的，它们还可以相互作用和调节。
此外，最近还出现了一些新的序列特异性调控机制，如CRISPR-Cas9系统和TALENS技术，在基因编辑和基因治疗方面有着广阔的应用前景。
2. 后转录调控在前转录调控过程中，DNA被转录成RNA，然后RNA通过翻译转化成蛋白质。
而后转录调控就发生在RNA转录的后期。
这种调控方式主要涉及到RNA的后期处理，如剪接、多聚腺苷酸尾巴加工和RNA降解。
已经发现一些后转录调控因子，在肿瘤发生和发展中扮演着关键角色。
3. 染色质调控染色质是由DNA和一些调控元件组成的复杂结构，是基因表达的重要调节因素。
染色质调控机制主要包括乙酰化、甲基化和去甲基化等化学修饰方式，以及类胰蛋白、CpG岛和miRNA等特定元素的调控。
乙酰化和甲基化是已经被广泛研究的染色质调控机制。
研究表明，染色质结构的改变可以引起基因表达的改变。
因此，染色质调控机制对于理解基因表达调控的分子机制具有重要意义。
4. RNA干扰调控RNA干扰是一种基于RNA片段的基因调控方法。
它可以通过RNA介导的调控途径来抑制和启动基因的表达。
RNA干扰调控主要依靠反义RNA和小分子RNA来实现。
反义RNA是指与mRNA相互作用、干扰mRNA翻译成蛋白质，从而抑制目标基因表达的RNA分子；而小分子RNA则可以通过靶向mRNA的特定区域，降解或抑制 mRNA的翻译过程，从而调控基因表达。
基于转录组测序的基因表达调控研究
基于转录组测序的基因表达调控研究基因是生命的基础单位，它们编码我们身体运转必须的功能和特征，因此对于基因的研究一直是生命科学领域研究的重点。
转录组测序作为一种高通量、高精度的测序技术，可以全面深入的分析和研究基因表达调控的机制，目前已经被广泛应用于生命科学中。
本文主要介绍基于转录组测序的基因表达调控研究。
一、转录组测序简介转录组测序（RNA-seq）是一种通过高通量测序技术来分析RNA样本中各种转录本的数量和结构的方法。
随着高通量测序技术的不断发展，转录组测序成为了我们分析基因组的一个强有力的工具。
传统的基因表达分析方法绝大多数都是基于芯片技术，采用测序来分析基因表达模式的优势在于测序得到的结果更为精确，能够比较复杂的基因表达情况，如发现不同的剪接形式、基因扩增和基因表达的可变性等问题。
二、基因表达调控研究基因表达调控（gene expression regulation）是指调节基因发挥其作用的过程，由于细胞需要根据不同的环境适应发生的变化，因此基因表达调控是多样化，也非常复杂。
现阶段了解基因表达调控的研究主要分为两个层面，即转录水平和转录后水平。
转录水平研究强调mRNA在转录时和剪接时的调控，可以从以下两个方面进行研究：基因的启动转录复合物形成以及转录因子的作用和影响；转录后水平研究则更加强调RNA和其他RNA分子之间的相互作用以及RNA的翻译效率。
当前将转录水平和转录后水平结合起来进行的研究具有非常重要的意义，因为这种综合研究能够更全面地了解基因的表达调控情况。
三、转录组测序在基因表达调控研究中的应用（一）基因差异表达分析通过测序可以得到一个基因在不同组织、不同组织中不同时间段等条件下的表达量信息，这些数据可以分析出基因差异表达量、差异可变剪切、新基因发现和基因扩增等信息。
基于差异表达的基因的界定，我们可以进一步分析基因的功能和通过基因表达调控网络的结构进一步研究它在该生物体的生物过程中的作用。
植物分子生物学中的基因表达调控
植物分子生物学中的基因表达调控在植物分子生物学领域，研究者们致力于了解植物中的基因表达调控机制。
通过研究这些机制，我们可以更好地理解植物的生长、发育以及对环境的响应。
本文将探讨植物基因表达调控的基本原理以及相关的研究方法和应用。
一、基因表达调控的基本原理基因表达调控是指植物细胞中基因信息的转录和翻译过程受到内外环境因素的调控，从而实现基因的表达或沉默。
植物基因表达调控的主要机制包括转录调控、转录后调控以及表观遗传调控。
1. 转录调控：转录调控是指在基因转录过程中，一系列转录因子和其他调控蛋白结合到基因启动子上，调节基因的转录水平。
这些转录因子可以促进或抑制基因的转录，从而控制基因的表达。
2. 转录后调控：转录后调控是指已经被转录成mRNA的RNA分子在转录后发生的调控过程。
这些转录后调控包括RNA剪接、RNA修饰、RNA转运和RNA降解等，可以改变mRNA的稳定性和转录后处理，从而调节基因的表达。
3. 表观遗传调控：表观遗传调控是指在基因表达过程中，DNA和蛋白质之间相互作用形成的表观遗传标记对基因的表达进行调控。
这些表观遗传标记包括DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质结构等，可以影响染色体的结构和可及性，从而控制基因的表达。
二、研究方法和技术为了深入研究植物基因表达调控的机制，研究者们利用了多种方法和技术。
以下是一些常用的研究方法：1. 基因组学研究：通过对植物基因组进行测序和分析，可以鉴定出植物基因的序列和组织特异性表达等信息。
基因组学的发展使我们可以全面了解植物基因的组成和结构。
2. 转录组学研究：转录组学研究通过对植物转录过程的全面分析，可以揭示基因的表达模式以及转录因子的调控网络。
最常用的转录组学方法包括RNA测序技术（RNA-seq）和芯片技术。
3. 蛋白质组学研究：蛋白质组学研究可以揭示植物蛋白质的组成、结构和功能。
蛋白质组学的方法包括质谱分析、蛋白质互作研究和蛋白质修饰分析等。
4. 遗传学研究：遗传学研究通过研究植物的突变体或基因敲除植物，可以揭示基因在植物生长和发育中的功能和调控机制。
基因的表达和调控
基因的表达和调控基因是生命的基础单位，它们通过对细胞产生影响来决定生物的性状和功能。
基因的表达是指在细胞内通过转录和翻译过程将基因序列转化为蛋白质的过程。
而基因的调控则是控制基因表达的过程，确保在不同的细胞类型和环境条件下，基因能够以特定的方式表达出来。
1. 基因表达的过程基因表达的过程可以分为两个主要步骤：转录和翻译。
转录是指基因的DNA序列通过RNA聚合酶酶的作用，转录成RNA分子的过程。
翻译则是指RNA分子通过核糖体的作用，翻译成蛋白质的过程。
转录是基因表达的第一步，它发生在细胞核中。
转录过程中，RNA 聚合酶酶会识别和结合到DNA的启动子区域，然后开始在DNA模板链上合成RNA链。
RNA链的合成是以单链形式进行的，它与DNA模板链相互对应，A对U、C对G等。
转录过程中还需要其他转录因子的参与，它们协助RNA聚合酶酶的结合和转录的进行。
翻译是基因表达的第二步，它发生在细胞质中。
转录生成的RNA 分子被称为信使RNA（mRNA），它包含了基因编码的信息。
翻译过程中，mRNA通过核糖体与转运RNA（tRNA）相互作用，将氨基酸按照特定的顺序连接成蛋白质的链。
tRNA携带着特定的氨基酸，根据mRNA上的密码子来配对，从而在核糖体上合成蛋白质。
2. 基因调控的机制基因表达不仅仅受到转录和翻译的过程影响，还受到复杂的调控网络的控制。
基因调控是通过一系列的调控因子和信号分子来实现的。
调控因子可以是蛋白质或非编码RNA，它们可以与DNA序列特定的区域相互作用，促进或抑制基因的表达。
基因调控的机制非常多样，包括启动子的甲基化、染色质重塑、转录因子的结合等。
甲基化是一种化学修饰过程，通过添加甲基基团到DNA分子上，可以改变DNA的结构和可访问性，从而影响基因的转录活性。
染色质重塑则是通过改变与DNA紧密结合的蛋白质的构象，使得基因区域更容易被转录复合物访问。
此外，还有许多转录因子和辅助蛋白质参与到基因调控的过程中。
普通生物学中的基因表达调控
普通生物学中的基因表达调控基因是生物体传递遗传信息的基本单位，而基因的表达调控则决定了生物体的发育、适应和功能。
在普通生物学中，基因的表达受到许多调控因素的影响，包括转录因子、表观遗传修饰和环境刺激等。
本文将探讨普通生物学中的基因表达调控。
一、转录因子调控基因表达转录因子是一类能够结合在DNA上的蛋白质，它们能够调控基因的转录过程。
转录因子的结合位点通常位于基因启动子区域，通过结合位点上的转录因子来激活或抑制基因的转录。
一个基因通常可以被多个转录因子调控，它们的结合和组合方式形成了基因表达的调控网络。
例如，在果蝇发育过程中，转录因子Bicoid通过结合在hare酮酸的位点上，激活一系列的下游基因的转录。
这些下游基因进一步调控胚胎的前后轴发育，形成不同的体节段。
二、表观遗传修饰影响基因表达除了转录因子，表观遗传修饰也是基因表达调控的重要一环。
表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA的作用等。
这些修饰可以影响染色质的结构和紧密度，从而影响基因的可及性和转录活性。
在哺乳动物中，DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰形式。
DNA甲基化是通过DNA甲基转移酶将甲基基团添加到DNA分子上，进而影响基因的转录活性。
DNA甲基化的模式可以在细胞分化中形成细胞记忆，决定细胞的特化命运。
三、环境刺激对基因表达的调控环境刺激是基因表达调控中一个重要的调控因素。
生物体需要通过调整基因表达来适应环境的变化。
例如，在植物的应答机制中，光照是一个重要的环境刺激。
光照可以激活特定的转录因子，进而影响植物的光合作用和生长发育。
光照调控基因表达的机制在植物学中被广泛研究，对于改良作物的耐旱性和光合效率具有重要意义。
四、基因表达调控的应用对基因表达调控的深入研究不仅可以帮助我们理解生物体的发育和适应机制，也为科学家们开发新的治疗方法和生物技术应用提供了理论基础。
在癌症治疗中，研究人员已经开始利用基因表达调控的方法来恢复被癌症细胞异常表达的基因。
RNA介导的基因表达和调控研究
RNA介导的基因表达和调控研究是生物学领域中一个热门的研究方向。
这个领域的研究主要是探究RNA在基因表达和调控过程中所扮演的角色。
这项研究不仅可以帮助人们更好地理解基因表达和调控的机制，还有助于对未知疾病进行深入研究，并提供新的治疗方法。
RNA是一种重要的生物分子，它在基因表达和调控中扮演着重要的角色。
RNA分为mRNA、rRNA、tRNA、小RNA等多种类型。
其中mRNA是基因表达和调控中最为重要的一种RNA。
它是基因信息的转录产物，可以被翻译为蛋白质。
mRNA的翻译过程是一个复杂的调控过程，在这个过程中有许多的RNA分子参与其中。
这些RNA分子不仅可以调控mRNA在翻译过程中的表达，还可以参与到其他的基因调控过程中。
这些RNA分子包括siRNA、miRNA、piRNA等多种类型。
siRNA是一种大小为21-25nt的RNA分子，它主要参与到RNA干扰机制中。
RNA干扰是一种通过RNA序列特异性的RNA分子介导的基因表达和调控方式，在这个过程中RNA分子可以靶向性地降低对应基因的表达。
siRNA通常是由外源性RNA分子诱导产生，它可以通过RNA依赖性RNA聚合酶(Dicer)切割产生。
miRNA也是一种大小为21-25nt的RNA分子，它在基因表达和调控中扮演着重要的角色。
miRNA通过与mRNA特定的序列结合来靶向性地下调它们的表达。
miRNA可以通过RNA聚合酶(Drosha和Dicer)产生，也可以通过外源性RNA的转录产生。
piRNA是一种大小为26-31nt的RNA分子，它在基因表达和调控中扮演着重要的角色。
piRNA在转座子调控、激活特定的基因和保护基因组完整性等方面具有重要作用。
piRNA通常是在精巢中产生的，它可以通过RNA聚合酶产生。
除了以上提到的RNA分子，还有许多其他类型的RNA分子也参与到基因表达和调控过程中，例如长非编码RNA(lncRNA)、小核RNA(snRNA)、小Cajal体RNA(scaRNA)等。
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缺点
SSH技术对其实材料要求多
SSH技术得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不再是全场cDNA 所研究材料的差异不能太大
差异显示技术(differential display,DD)
差异显示(differential display,DD)是1992年由美 国波斯顿Dena-Faber 癌症研究所的Liang Peng 博士 和Arthur Pardee 博士建立的筛选基因差异表达的有 效方法。是将mRNA反转录技术和PCR技术二者结 合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，因此也称为 DDRT-PCR。每一种细胞组织（同一组织细胞经不 同的处理）都有其特异表达的不同于其他组织细胞 的基因普，即特异的RNA指纹图谱。
Rsa I 酶切
cDNA 末端接头连接
E
实验流程
由RNA合成 cDNA
Rsa I 酶切
A, B, C, D cDNA 末端接头连接
E
末端补齐 第一次消减杂交 第二次消减杂交 末端补齐 第一次PCR扩增 第二次PCR扩增 E E 富集差异表达基因
21
A B C
D
实验流程
由RNA合成 cDNA A B C D 第一次消减杂交
差减杂交技术原理
差减杂交（SH）具有富集作用，有利于克隆 低丰度基因esentationaldifferenec analysis, RDA)
抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization SSH)
Driver cDNA （过量）
Tester cDNA with Adaptor 2R
A B C D
ห้องสมุดไป่ตู้
A
B
C D
实验流程
由RNA合成 cDNA Tester杂交液 （Adaptor 1） A B C 第一次消减杂交 D 第二次消减杂交 末端补齐 第一次PCR扩增 第二次PCR扩增 富集差异表达基因 A, B, C, D D A B C Tester杂交液 （Adaptor 2R） Driver cDNA （加热变性）
Rsa I 酶切
cDNA 末端接头连接
E E
第二次消减杂交 加入共用PCR引物 末端补齐 A, D: 不能被扩增 第一次PCR扩增 第二次PCR扩增 富集差异表达基因 C: 线性扩增 B: 扩增受到抑制
EE
5’ 3’
3’ 5’
实验流程
由RNA合成 cDNA
Rsa I 酶切
cDNA 末端接头连接
EE
真核生物中，从个体的生长、发育、衰老、死亡， 到组织的分化、凋亡以及细胞对各种生物、理化因子的 应答，本质上都涉及基因的选择性表达。高等生物大约 有30 000个不同的基因，但在生物体内任意细胞中只有 10%的基因得以表达，而这些基因的表达是按时间和空 间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异 表达。其包括新出现的基因表达与表达量有差异的基因 表达。生物体表现出的各种特性，主要是由于基因的差 异表达引起的。由于基因差异表达的变化是调控细胞生 命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生 理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为 分析生命活动过程提供重要信息。
基本步骤：
首先提取待测组和对照组样品的mRNA，合成双 链cDNA；用DpnⅡ酶切两组双链cDNA进行消化。两 端接上单链接头1，补平后，用含接头1序列的引物 PCR扩增，再用DpnⅡ去除双链cDNA两端的接头1； 只给予待测组双链cDNA两端再接上单链接头2。将 待测组与对照组cDNA杂交，杂交反应体系中只有待 测组自身杂交形成的双链cDNA才两端都带接头2， 补平，用含有含有接头2序列的引物PCR扩增，待测 样品中特有的DNA序列两条链含接头2，因此成指数 增长，而只有一端带接头2的杂交体只能被线性扩增。 将此杂交产物再进行第二轮酶切、加接头、杂交和 PCR扩增，重复两次后，可确保从实验组中彻底去除 与对照组共有的序列。
5’ 3’
3’ 5’
加入巢式PCR引物 第一次消减杂交 第二次消减杂交 末端补齐 第一次PCR扩增 第二次PCR扩增 富集差异表达基因
23
非特异性表达基因得到极大的扣除， 高效地富集了差异表达基因。
SSH 是目前为止较为简单有效的寻找差 异基因的方法, 其主要优点:
①灵敏度高 ; 一般说来 , 经过 SSH, 稀有丰度的 cDNA 能富集 1000 倍~5000 倍, 这种富集作用使得低至每细胞一个拷贝的分 子也有可能被检出; ②提高了基因克隆的效率 ; 由于使用 4 碱基内切酶使得基因 ( 组) 的复杂程度降低, 大大提高了信息量, 在一次SSH 试验中 可同时分离出上百个差别表达的基因; ③假阳性率低; ④操作简单, 速度快, 效率高;一次SSH 可以同时分离到几十甚 至几百个差异表库。
早期，从mRNA转录水平筛选差异表达基因的方法是差别筛选技 术和差减杂交法，但二者存在灵敏度低、工作量大、周期长及 步骤繁琐的问题。
哈佛大学医学院 Liang 和 Struss 博士发明了mRNA 差异显示技 术，即DDRT—PCR(differ—ential display of mRNA by PCR)。
抑制 PCR 是利用链内复性优 先于链间复性的原理，使非目 标序列片段两端的长反向重复 序列在复性时产生“锅柄样” 结构或“发夹结构”而无法于 引物配对，从而选择性的抑制 非目标序列的扩增。
抑制性消减杂交—原理
杂交动力学
不同丰度的单链DNA得到均衡
抑制性PCR
目的基因得到富集
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杂交动力学
抑制差减杂交技术运用了杂交二级动 力学原理,即高丰度的单链cDNA在退 火时产生同源杂交的速度快于低丰度 的单链cDNA,在试验组(tester)和驱动 组(driver)的cDNA变性后再复性的过 程中,原来在丰度上有差别的单链 cDNA达到均一化。
1994年，Erric Haay等将这种方法正式命名为差异显示反转录 聚合酶链式反应 (mRNA Differential Display PCR) ，简称 DDRT—PCR
mRNA差异显示技术的原理：
mRNA差异显示技术的主要原理是利用cDNA反转录技术,PCR 扩增和高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，来显示PCR产物 的差异。其中，反转录技术中使用了一系列能与mRNA的Poly （A）尾巴相结合的锚定寡聚脱氧核苷酸引物oligoT12MN。 锚定引物与 mRNA 的Poly（ A） + 的两个碱基，在反转录酶的 作用下可以启动mRNA群体反转录。
酶降解差减杂交(enzymaticdegradingsubtraction, EDS)
接头捕获差减杂交(linker capture subtraction LCS)
代表性差异分析(representational difference analysis, RDA) 代表性差异分析（RDA）用于筛选两个样本中 基因组DNA之间的差异基因片段。在此基础上又发 展为cDNA-RDA技术，用于筛选差别表达基因。 基本原理： 其原理是将差减杂交与PCR 结合, 根据以双链 DNA 为模板进行PCR 扩增时产物呈指数扩增, 而以 单链DNA 为模板则呈线性扩增的原理, 首先提取待测 组和对照组的总RNA 或mRNA, 反转录成cDNA, 用识 别4 个碱基的内切酶(如Dpn Ⅱ)充分消化, 然后进行 PCR, 使两组cDNA片段得以富集, 接着连续进行若干 次差减杂交, 去除共有基因。最后利用PCR技术富集 实验组特异表达基因的cDNA片段。
研究基因差异表达的主要技术有 差别杂交
(differential hybridization) ，扣除（消减）杂交
(Subtractive hybridization) ， mRNA差异显示技术 (mRNA differential display reverse transcription PCR,DDRT-PCR) ，抑制消减杂交法(suppressial substractive hybridization ,SSH) ， 代表性差异分
优势： （1）高效性，与传统的差减富集相比，更加敏感，可 以筛选出低拷贝的差异基因； （2）可靠性，结果重复性好，假阳性率非常低。有人曾
结合cDNA-RDA和膜杂交筛选，对比正常人口腔黏膜上皮和HPV 永生化的口腔上皮细胞系，获得了384个差异表达的克隆，并证 实其中含69种差异基因。
cDNA-RDA技术的局限性在于： （1）得到的差异片段是平均为300~600bp的小片段。 （2）由于cDNA较基因组DNA短，消化后可造成cDNA 序列两端信息量丢失。 （3）完全无酶切位点的片段无法参与RDA筛选。 （4）在极低拷贝差异基因的筛选上进行了改进，但仍 有不足。
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抑制性消减杂交—特点
采用两次消减杂交和两次PCR，保证了高特异性； 通过杂交操作，可以获得低丰度差异表达基因； 操作简便，实用有效，全过程仅需3 - 4天。
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实验流程
由RNA合成 cDNA
Rsa I 限制性内切酶酶切
cDNA 末端接头连接 第一次消减杂交 第二次消减杂交 末端补齐 第一次PCR扩增 第二次PCR扩增 富集差异表达基因
3‘
3‘ 5’
M N TTTTTTTTTTTT 5’ 不同长度的 dNTP、Taq聚合酶 延长 PCR产物 M N TTTTTTTTTTTT 5’ M’N’AAAAAAAAAAA 3’ 变性、退火、延伸 电泳 显示 回收差异条带，再扩增， 克隆测序，同源比对
析 (Represential display analysis ,RDA) ，交互扣
除RNA差别显示技术(RSDD) ，以及基因表达系列
分析和电子消减
差减杂交(subtractive hybridization,SH)