《分子克隆中所用酶》PPT课件
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核糖核酸酶(Rnase)专门水解断裂RNA分子, 脱氧核糖核酸酶(DNase)特异水解断裂DNA分子 。
按水解断裂核酸分子的不同方式核酸酶分为两种类 型：
核酸外切酶(exonuclease) :从核酸分子的末端开始， 一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链。
核酸内切酶(endonuclease):从核酸分子 内部切割磷 酸二酯键使之断裂形成小片段。
III型：有专一的识别顺序。它在识别顺序下游约25bp处 几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则
是任意的。
II型：识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内或附近的固 定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的
核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA 片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合 DNA分子。
限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特 定核苷酸序列，并在识别位点或其附近切割DNA双链的 核酸内切酶。
主要是从原核生物中分离纯化出来的。 据统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各 种不同的微生物当中，分离出了2300种以上、可识别230 种不同的DNA序列。目前已经发现3500种以上，而且商 业化的有250种之多．
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15百度文库
E coR I的识别顺序为：
5’……GAA | TTC……3’ 3’……CTT | AAG……5’
垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC 或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。
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recognition sequence
5＇ GTT AAC 3＇ 3＇ CAA↓TTG 5＇
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2. 限制酶的命名
现在通用的命名原则是：第一个字是细菌属名的第一个字母， 第二、三个字是细菌种名的前二个字母，这些字母都用斜体字 母；接下去是细菌菌株的第一个字母，用正体字母书写。如果 同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ 、Ⅲ……来代表。现在列表举例说明如下
5＇ G↓AATTC 3＇ 3＇ CTTAA↑G 5＇
5＇ A↓AGCTT 3＇ 3＇ TTCGA↑A 5＇
5＇ G↓GATCC 3＇ 3＇ CCTAG↑G 5＇
5＇ C↓TGCAG 3＇ 3＇ GACGT↑C 5＇
enzymes Hpa Ⅰ blunt end EcoRⅠ 5’protruding end HindⅢ 5’protruding end BamHⅠ 5’protruding end PstⅠ 3’protruding end
限制作用和修饰作用都是由寄主控制，统称为寄主控制的限制 与修饰现象。
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978 年诺贝尔生理学和医学奖
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限制作用的本质是限制酶的切割反应，修饰作用的本质则是甲基 化酶的甲基化作用。
Hsd R:编码限制酶；hsd M:编码甲基化酶；hsd S：表达产物协 助上述两种酶识别特殊的作用位点。
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第一节限制性内切酶Restriction Enzyme (RE) 1.限制性内切酶的发现
Lurva和Human（1952）以及Bertani和Weigle（1953）发现了λ 噬菌体的限制作用，即在一种宿主细胞生长良好的λ噬菌体， 但在另一种宿主细胞中生长很差。
修饰作用：第二个寄主菌株赋予λ噬菌体非遗传的变化，使之 再感染时能够有效生长，而没有再次受到限制的现象。
第三章 工具酶
基因工程使用的工具酶具有一个重要特征： 每一种酶都具有自身特定的功能。有的像" 手术刀"，可以进行DNA分子的特定切割；有 的像"粘合剂"，可以促进DNA分子之间的粘 合和连接；有的像"砌砖机"，可以合成完整 的双链DNA分子。
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核酸酶:通过切割相邻的两个核苷酸残基之间 的磷酸二酯键，使核酸分子多核苷酸发生水解断 裂的酶。
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4. Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性：
4.1Ⅱ型限制性内切酶的识别序列
绝大多数的Ⅱ型核酸内切限制酶，都能够识别由4 一6个核苷酸对组成的特定的核苷酸序列，我们称 这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而限制 酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此识别 序列又称内切酶的靶子序列。
识别序列通常具有二重旋转对称轴，序列呈回文结 构（palindromic structure）。即有一个中心对称 轴，从这个轴朝二个方向“读”核苷酸顺序都完全 相同。
BamHⅠ
Escherichia Coli
RY13
EcoRⅠ
Haemophilus influeuzae
Rd
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HindⅢ
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3.限制酶的种类
根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为I、 II、III三种类型.
I型：能识别专一的核苷酸顺序，在距识别点数千碱基处 随机切割DNA分子中的双链。
EcoRI
E： 表示大肠杆菌属名第一个字母 co： 表示种名头两个字母 R： 表示菌株名第一个字母
I： 表示该菌中第一个被分离出来的酶。
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细菌原名
几种限制性内切酶命名原则举例
细菌种名
菌株名称 限制酶名称
Arthrobacter Luteus
AluⅠ
Bacillus
amyloliquefaciens H
当有DNA入侵细菌时，修饰酶修饰宿主自身的DNA，使之打上标记 ，避免自身的DNA被限制性内切酶分解；限制酶降解外来的DNA，自 身DNA由于修饰酶的甲基化而受到保护。
限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制–修饰系 统
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第一节限制性内切酶Restriction Enzyme (RE)
识别序列在DNA分子中出现的频率 :
如果四种碱基按完全随机分布的原则，则某种限制性内切
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工具酶
常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ 反转录酶
切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端
cDNA合成
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
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一把特殊的剪刀 _______限制性内切酶
按水解断裂核酸分子的不同方式核酸酶分为两种类 型：
核酸外切酶(exonuclease) :从核酸分子的末端开始， 一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链。
核酸内切酶(endonuclease):从核酸分子 内部切割磷 酸二酯键使之断裂形成小片段。
III型：有专一的识别顺序。它在识别顺序下游约25bp处 几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则
是任意的。
II型：识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内或附近的固 定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的
核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA 片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合 DNA分子。
限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特 定核苷酸序列，并在识别位点或其附近切割DNA双链的 核酸内切酶。
主要是从原核生物中分离纯化出来的。 据统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各 种不同的微生物当中，分离出了2300种以上、可识别230 种不同的DNA序列。目前已经发现3500种以上，而且商 业化的有250种之多．
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E coR I的识别顺序为：
5’……GAA | TTC……3’ 3’……CTT | AAG……5’
垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC 或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。
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recognition sequence
5＇ GTT AAC 3＇ 3＇ CAA↓TTG 5＇
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2. 限制酶的命名
现在通用的命名原则是：第一个字是细菌属名的第一个字母， 第二、三个字是细菌种名的前二个字母，这些字母都用斜体字 母；接下去是细菌菌株的第一个字母，用正体字母书写。如果 同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ 、Ⅲ……来代表。现在列表举例说明如下
5＇ G↓AATTC 3＇ 3＇ CTTAA↑G 5＇
5＇ A↓AGCTT 3＇ 3＇ TTCGA↑A 5＇
5＇ G↓GATCC 3＇ 3＇ CCTAG↑G 5＇
5＇ C↓TGCAG 3＇ 3＇ GACGT↑C 5＇
enzymes Hpa Ⅰ blunt end EcoRⅠ 5’protruding end HindⅢ 5’protruding end BamHⅠ 5’protruding end PstⅠ 3’protruding end
限制作用和修饰作用都是由寄主控制，统称为寄主控制的限制 与修饰现象。
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978 年诺贝尔生理学和医学奖
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限制作用的本质是限制酶的切割反应，修饰作用的本质则是甲基 化酶的甲基化作用。
Hsd R:编码限制酶；hsd M:编码甲基化酶；hsd S：表达产物协 助上述两种酶识别特殊的作用位点。
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第一节限制性内切酶Restriction Enzyme (RE) 1.限制性内切酶的发现
Lurva和Human（1952）以及Bertani和Weigle（1953）发现了λ 噬菌体的限制作用，即在一种宿主细胞生长良好的λ噬菌体， 但在另一种宿主细胞中生长很差。
修饰作用：第二个寄主菌株赋予λ噬菌体非遗传的变化，使之 再感染时能够有效生长，而没有再次受到限制的现象。
第三章 工具酶
基因工程使用的工具酶具有一个重要特征： 每一种酶都具有自身特定的功能。有的像" 手术刀"，可以进行DNA分子的特定切割；有 的像"粘合剂"，可以促进DNA分子之间的粘 合和连接；有的像"砌砖机"，可以合成完整 的双链DNA分子。
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核酸酶:通过切割相邻的两个核苷酸残基之间 的磷酸二酯键，使核酸分子多核苷酸发生水解断 裂的酶。
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4.1Ⅱ型限制性内切酶的识别序列
绝大多数的Ⅱ型核酸内切限制酶，都能够识别由4 一6个核苷酸对组成的特定的核苷酸序列，我们称 这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而限制 酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此识别 序列又称内切酶的靶子序列。
识别序列通常具有二重旋转对称轴，序列呈回文结 构（palindromic structure）。即有一个中心对称 轴，从这个轴朝二个方向“读”核苷酸顺序都完全 相同。
BamHⅠ
Escherichia Coli
RY13
EcoRⅠ
Haemophilus influeuzae
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3.限制酶的种类
根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为I、 II、III三种类型.
I型：能识别专一的核苷酸顺序，在距识别点数千碱基处 随机切割DNA分子中的双链。
EcoRI
E： 表示大肠杆菌属名第一个字母 co： 表示种名头两个字母 R： 表示菌株名第一个字母
I： 表示该菌中第一个被分离出来的酶。
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细菌原名
几种限制性内切酶命名原则举例
细菌种名
菌株名称 限制酶名称
Arthrobacter Luteus
AluⅠ
Bacillus
amyloliquefaciens H
当有DNA入侵细菌时，修饰酶修饰宿主自身的DNA，使之打上标记 ，避免自身的DNA被限制性内切酶分解；限制酶降解外来的DNA，自 身DNA由于修饰酶的甲基化而受到保护。
限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制–修饰系 统
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识别序列在DNA分子中出现的频率 :
如果四种碱基按完全随机分布的原则，则某种限制性内切
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工具酶
常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ 反转录酶
切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端
cDNA合成
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
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一把特殊的剪刀 _______限制性内切酶