《分子克隆中所用酶》PPT课件
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基因操作工具酶PPT课件
α- 32P-dATP
EcoR I 酶切末端
同位素标记的EcoR I 酶切末端
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3.3 Taq DNA聚合酶
显著特点：热稳定性。70℃反应2h残留活性90 %； 93℃ 反应 2 h残留活性60% ；94℃ 反应 2 h残 留活性40%。
应用：（1）对DNA的特定片段进行体外扩增； （2） DNA序列测定。
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2 DNA连接酶
2.1 定义及功能 2.2 种类及作用机理 2.3 使用时的注意事项
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2.1 定义及功能
DNA连接酶（DNA ligase）： 可使一段DNA 3`-OH末端和5`-P 末端
形成3`,5`-磷酸二酯键，把两DNA片段 连在一起封闭双链上形成的切口的酶。
OH P
5`
• 若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个 字母（大写）
• 若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先 后顺序用罗马字母表示。
例如：EcoRⅠ 从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为 EcoRⅠ， 其中E 代表属名（Escherichia)，co 代表种名（coli)， R 代表株系（RY13），Ⅰ 代表该菌株中首次分离到。
应用：缺口平移法制备DNA分子杂交探针
缺口
DNase I DNA聚合酶 I
DNA聚合酶 I dNTP*
缺口
缺口平移法制备DNA分子探针 Back
3.2 Klenow聚合酶
活性： 5`→3`聚合活性，3`→5` 外切酶活性，无5`→3`
外切酶活性。 用途： （1）填补或标记DNA的3`隐蔽末端； （2）催化合成cDNA第二链； （3）DNA序列测定
5-7 bp非对称序 列
分子克隆技术常用的工具酶
经修饰的DNA不再被限制酶降解。
已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在 对应II类限制酶名称前加一个M表示。
如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲
基化(GAm6ATTC)的酶
识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至 少有3种：
①敏感的，甲基化后不能再切割；
DNA用的乙醇。
2）甲基化
识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会 阻碍限制酶的酶解活性。 受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。
所用符号为：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C为C5-甲基胞嘧啶。
3）底物性状
随底物的不同而活性发生改变
仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网，至2003年 04月19日, REBASE (The Restriction Enzyme Database) 收集的 编号已有7096种；其中Ⅱ类酶有3845种．
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等， 一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。
②不敏感的．甲基化后仍可切割；
③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性
5' A T
||| |
3' T A C G dTTTP
5'
5’ 5’
引物
2）核酸外切酶活性
5’ A G C T T C A G G A T A
(-) 放线菌素D (-)
DNA合成
RNA
DNA(前病毒)
RNA
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在 对应II类限制酶名称前加一个M表示。
如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲
基化(GAm6ATTC)的酶
识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至 少有3种：
①敏感的，甲基化后不能再切割；
DNA用的乙醇。
2）甲基化
识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会 阻碍限制酶的酶解活性。 受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。
所用符号为：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C为C5-甲基胞嘧啶。
3）底物性状
随底物的不同而活性发生改变
仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网，至2003年 04月19日, REBASE (The Restriction Enzyme Database) 收集的 编号已有7096种；其中Ⅱ类酶有3845种．
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等， 一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。
②不敏感的．甲基化后仍可切割；
③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性
5' A T
||| |
3' T A C G dTTTP
5'
5’ 5’
引物
2）核酸外切酶活性
5’ A G C T T C A G G A T A
(-) 放线菌素D (-)
DNA合成
RNA
DNA(前病毒)
RNA
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
分子克隆用酶基因与蛋白质工程课件
提取(尽可能大)
用限制性内切酶酶切DNA
凝胶电泳分开DNA片段
把DNA片段转移到滤膜上
利用标记的探针检测特定的DNA片段 （Southern 杂交）
结果分析。
图右表示了植物A叶绿体基因 组小部分DNA的限制图以及植 物 A 和 另 外 2 个 材 料 (B 和 C). 的RFlP形式．如果植物A与祖 先种相比变化很小，那么假 定它发生了2个突变．突变1， 在 13Kb 片 段 上 出 现 一 新 的 限 制 性 位 点 ， 产 生 9Kb 和 4Kb 的 片段．突变2，在形成植物C 的过程中，一个限制性位点 消失，产生11Kb片段，6Kb和 5Kb的消失．基于这一系列变 化，就可列出系统发育图(图 左).
II类限制性内切酶的切割 位点在识别序列中，有的在 对称轴处切割，产生平末端 DNA片段
有的切割位点在对称轴一侧， 产生带有单链突出末端的 DNA片段，称为粘性末端.
3、甲基化酶（Methylase） 与识别位点
原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护 宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
2. 37℃水浴保温2-3小时，使酶切完全。 3. 每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混匀以
停止反应，置于冰箱保存备用。 4. 取5-10l酶切液进行琼脂糖凝胶电泳分析。
DNA片段和质粒载体的连接 及用酶
二、T4-DNA连接酶
带有非互补突出端的片段的连接
载体与DNA片段分别 用两种不同的限制性内 切酶进行消化可产生带 有非互补的粘性末端， 这也是最容易可克隆的 DNA片段。该种粘性末端 的连接载体DNA和外源 DNA的分子数比（浓度比 ）通常为为1:1。
6、限制性内切酶酶切实验步骤
用限制性内切酶酶切DNA
凝胶电泳分开DNA片段
把DNA片段转移到滤膜上
利用标记的探针检测特定的DNA片段 （Southern 杂交）
结果分析。
图右表示了植物A叶绿体基因 组小部分DNA的限制图以及植 物 A 和 另 外 2 个 材 料 (B 和 C). 的RFlP形式．如果植物A与祖 先种相比变化很小，那么假 定它发生了2个突变．突变1， 在 13Kb 片 段 上 出 现 一 新 的 限 制 性 位 点 ， 产 生 9Kb 和 4Kb 的 片段．突变2，在形成植物C 的过程中，一个限制性位点 消失，产生11Kb片段，6Kb和 5Kb的消失．基于这一系列变 化，就可列出系统发育图(图 左).
II类限制性内切酶的切割 位点在识别序列中，有的在 对称轴处切割，产生平末端 DNA片段
有的切割位点在对称轴一侧， 产生带有单链突出末端的 DNA片段，称为粘性末端.
3、甲基化酶（Methylase） 与识别位点
原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护 宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
2. 37℃水浴保温2-3小时，使酶切完全。 3. 每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混匀以
停止反应，置于冰箱保存备用。 4. 取5-10l酶切液进行琼脂糖凝胶电泳分析。
DNA片段和质粒载体的连接 及用酶
二、T4-DNA连接酶
带有非互补突出端的片段的连接
载体与DNA片段分别 用两种不同的限制性内 切酶进行消化可产生带 有非互补的粘性末端， 这也是最容易可克隆的 DNA片段。该种粘性末端 的连接载体DNA和外源 DNA的分子数比（浓度比 ）通常为为1:1。
6、限制性内切酶酶切实验步骤
分子克隆常用工具酶ppt课件
;.
49
RNA聚合酶
催化RNA体外合成反应 依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 不依赖 DNA 的RNA聚合酶
;.
50
反转录酶(reverse transcriptase)
反转录酶具有5′→3′的DNA聚合酶活性，以RNA为模板聚合cDNA链,同时又具有3′ →5′和5′ →3′的 RNA 外切核酸酶活性。AMV和MLV。
DNA末端转移酶 DNA terminal transferase
降解酶 S1 nuclease S1
主要功能 在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割
将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成 一个整体 通过向 3‘ 端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂 口，即5’→3‘ DNA 聚合酶活性与 3'→5'及5'→3'-外切酶活性 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5'-OH末端上
因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。
;.
6
核酸水解酶类
核酸内切酶核酸 外切酶
核酸合成酶类
DNA聚合酶RNA聚合 酶DNA连接酶
核酸修饰酶类
磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
;.
7
用于核酸操作的常用工具酶
➢ 限制性核酸内切酶 ➢ DNA连接酶 ➢ DNA聚合酶 ➢ 核酸酶 ➢ 核酸修饰酶
;.
24
II 型限制性核酸内切酶酶解反应体系
;.
25
“星”活性Star activity
“星”活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端ppH值等，会使一些 核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。
在名称右上角加一个星号(*)表示,•如EcoRⅠ*：AATT ；EcoRⅠ：GAATTC 必须采用规范的实验步骤, 应用推荐的反应条件。
第一章 分子克隆工具酶 基因工程 教学课件
5’-TAGGGATAA↓CAGGGTAAT-3’ ↑TATT
• I-PpoI：来自于多头绒胞菌Physarum polycephalum 基因内含子
5’- CTCTCTTAA↓GGTAGC -3’ ↑AATT
第二节
DNA 甲 基 化 酶
一. 甲基化酶的种类与识别顺序
1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
二、限制性内切酶的分类
• I 型 ：识别特定序列，切割位点在距识 别位点至少1000 bp处随机切割 EcoB：TGA(N)8TGCT, EcoK: AAC(N)6GTGC
• II 型：识别特定序列并在识别位点处或 附近切割
• III 型：识别特定序列，切割位点在距识 别位点3’端25~27bp处随机切割 EcoP1：AGACC EcoP15：CAGCAG
• 限制酶反应条件：DNA（DNA的纯度与 甲基化程度）、限制酶、反应缓冲液（ Tris-Cl、NaCl、Mg2+）、反应时间与温 度
• 限制酶星反应: 在变化的条件下，限制酶 识别序列特异性降低 EcoRI: GAATTC EcoRI*: AATT
七、其它特异性的限制酶
• Omega核酸酶（I-SceI） 由酿酒酵母线粒体rRNA基因中的内含子 编码，用于rRN的胞嘧啶和腺嘌呤 发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：
在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限
制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同，可
不同。
如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同
HpaI H
pa
/I
Haemophilus. Parainfluenzae
• I-PpoI：来自于多头绒胞菌Physarum polycephalum 基因内含子
5’- CTCTCTTAA↓GGTAGC -3’ ↑AATT
第二节
DNA 甲 基 化 酶
一. 甲基化酶的种类与识别顺序
1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
二、限制性内切酶的分类
• I 型 ：识别特定序列，切割位点在距识 别位点至少1000 bp处随机切割 EcoB：TGA(N)8TGCT, EcoK: AAC(N)6GTGC
• II 型：识别特定序列并在识别位点处或 附近切割
• III 型：识别特定序列，切割位点在距识 别位点3’端25~27bp处随机切割 EcoP1：AGACC EcoP15：CAGCAG
• 限制酶反应条件：DNA（DNA的纯度与 甲基化程度）、限制酶、反应缓冲液（ Tris-Cl、NaCl、Mg2+）、反应时间与温 度
• 限制酶星反应: 在变化的条件下，限制酶 识别序列特异性降低 EcoRI: GAATTC EcoRI*: AATT
七、其它特异性的限制酶
• Omega核酸酶（I-SceI） 由酿酒酵母线粒体rRNA基因中的内含子 编码，用于rRN的胞嘧啶和腺嘌呤 发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：
在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限
制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同，可
不同。
如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同
HpaI H
pa
/I
Haemophilus. Parainfluenzae
分子克隆工具酶_图文(精)
第二章分子克隆工具酶DNA 重组技术中对核酸的“精雕细刻”主要用酶作为工具。
60年代末，70年代初科学家们陆续发现了DNA 连接酶、T4DNA 连接酶、Ⅱ型限制性核酸内切酶Hin fI 和Eco RI、反转录酶等，才使他们能对DNA 分子进行剪切、连接等基因操作，故称这些酶为工具酶。
到目前为止，世界上发现的工具酶种类和数量繁多，现将重组DNA 分子技术中常的工具酶简介如下。
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）在重组DNA 技术中有重要地位，在此较详细介绍。
第一节限制性核酸内切酶核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。
很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶，能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶，最常见的是甲基化酶，能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化，从而避免受内切酶水解，外来核酸没有这种特异的甲基化修饰，就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制一修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。
这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。
1.1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease1.1.1 限制性核酸内切酶的概念是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸水解酶。
它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
到目前为止，已经分离出可识别230种不同DNA 序列的Ⅱ型限制性核酸内切酶达2300种以上。
在限制性核酸内切酶作用下，侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 碱基甲基化，在此修饰酶的保护下，则可免受限制性核酸内切酶的降解。
分子克隆工具酶-13级幻灯片
Байду номын сангаас
甲基化酶的种类 在E.coli中，大多数都有3个位点特异性的DNA甲基化酶
Dam甲基化酶
可在GATC序列中腺嘌呤N6位置上引入甲基
当需要在敏感位点上完全切割DNA时，可利用damE.coli扩增并提取DNA Dcm甲基化酶
识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C 的C5 位置上引入甲基
EcoKⅠ甲基化酶
用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的 DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。
限制酶的种类 Ⅰ型酶 (种类很少，只占1%) 三亚基双功能酶，分子量较大，反响需Mg2+、 ATP 有特异识别位点但没有特异切割位点 Ⅱ型酶 (占90%以上) 分子量较小，反响只需Mg2+； 识别位点是一个回文对称构造，切割位点在回文对 称构造上； 多数Ⅱ型酶切割DNA后形成粘性末端 Ⅲ型酶 (种类更少，不到1%) 二亚基双功能酶，能识别特定顺序，在该顺序的3’ 端24~26 bp处切开DNA，切割位点没有特异性。
同尾酶 可产生一样的黏性突出末端的酶统称为同尾酶。 同尾酶切割DNA得到的产物可进展互补连接。 EcoRⅠ： G↓AATTC Apo I: R↓AATTY Mfe I: C↓AATTC
稀切酶 有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限 制酶称为稀切酶。 在基因操作中使用稀切酶可以获得大的片段。
四、线性DNA末端对酶切的影响
DNA末端长度的影响 限制酶切割DNA时，识别序列两端必须有一定数量
的核苷酸，否那么难以发挥切割活性。
一般在识别序列末端有3 ~ 4个碱基对时能满足常
规的酶切需要。
位点偏爱(site preference) 某些限制酶对不同位置的同一识别序列表现出不同 的切割效率，这种现象称作位点偏爱。
甲基化酶的种类 在E.coli中，大多数都有3个位点特异性的DNA甲基化酶
Dam甲基化酶
可在GATC序列中腺嘌呤N6位置上引入甲基
当需要在敏感位点上完全切割DNA时，可利用damE.coli扩增并提取DNA Dcm甲基化酶
识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C 的C5 位置上引入甲基
EcoKⅠ甲基化酶
用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的 DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。
限制酶的种类 Ⅰ型酶 (种类很少，只占1%) 三亚基双功能酶，分子量较大，反响需Mg2+、 ATP 有特异识别位点但没有特异切割位点 Ⅱ型酶 (占90%以上) 分子量较小，反响只需Mg2+； 识别位点是一个回文对称构造，切割位点在回文对 称构造上； 多数Ⅱ型酶切割DNA后形成粘性末端 Ⅲ型酶 (种类更少，不到1%) 二亚基双功能酶，能识别特定顺序，在该顺序的3’ 端24~26 bp处切开DNA，切割位点没有特异性。
同尾酶 可产生一样的黏性突出末端的酶统称为同尾酶。 同尾酶切割DNA得到的产物可进展互补连接。 EcoRⅠ： G↓AATTC Apo I: R↓AATTY Mfe I: C↓AATTC
稀切酶 有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限 制酶称为稀切酶。 在基因操作中使用稀切酶可以获得大的片段。
四、线性DNA末端对酶切的影响
DNA末端长度的影响 限制酶切割DNA时，识别序列两端必须有一定数量
的核苷酸，否那么难以发挥切割活性。
一般在识别序列末端有3 ~ 4个碱基对时能满足常
规的酶切需要。
位点偏爱(site preference) 某些限制酶对不同位置的同一识别序列表现出不同 的切割效率，这种现象称作位点偏爱。
第一章 分子克隆工具酶 基因工程 教学课件
CH3
用于cDNA的连接
RE 甲基 化酶
RE
CH3
与载体相连
RE 人工 接头
CH3 RE RE
CH3
第三节 DNA连接酶
一、DNA连接酶的特点
• DNA连接酶广泛存在于各种生物体内， 其催化的基本反应是：
3’-将ODHN共A价双结链合上形的成相3邻’-碱5’磷基酸的二5’-酯PO键4和
DNA连接酶不能够连接两条单链DNA分子或 环化单链DNA。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋 DNA骨架上的切口（nick）
• 限制酶反应条件：DNA（DNA的纯度与 甲基化程度）、限制酶、反应缓冲液（ Tris-Cl、NaCl、Mg2+）、反应时间与温 度
• 限制酶星反应: 在变化的条件下，限制酶 识别序列特异性降低 EcoRI: GAATTC EcoRI*: AATT
七、其它特异性的限制酶
• Omega核酸酶（I-SceI） 由酿酒酵母线粒体rRNA基因中的内含子 编码，用于rRNA的剪切
AhaⅡ, FnuDⅡ, HhaⅠ
M.HpaⅡ
CmCGG
AhaⅡ,AvaⅠ,AvaⅡ,HpaⅡ,ScrFⅠ
M.HphⅠ
TmCACC
HinfⅠ, HphⅠ, Sau3AⅠ
M.MspⅠ
mCCGG
BamHⅠ, MspⅠ
M.PstⅠ
CTGCmAG
AluⅠ, PstⅠ
M.TaqⅠ
TCGmA
AluI, AvaⅠ, EcoRV, HinCⅡ, HinfⅠ,
3. 甲基化酶的用途
１） 改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成 ２） 在建立基因时，可先使DNA分子部分甲基化，然
后再用限制酶切
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识别序列在DNA分子中出现的频率 :
如果四种碱基按完全随机分布的原则，则某种限制性内切
III型：有专一的识别顺序。它在识别顺序下游约25bp处 几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则
是任意的。
II型：识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内或附近的固 定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的
核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA 片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合 DNA分子。
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2
工具酶
常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ 反转录酶
切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端
cDNA合成
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
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3
一把特殊的剪刀 _______限制性内切酶
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E coR I的识别顺序为：
5’……GAA | TTC……3’ 3’……CTT | AAG……5’
垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC 或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。
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recognition sequence
5＇ GTT AAC 3＇ 3＇ CAA↓TTG 5＇
5＇ G↓AATTC 3＇ 3＇ CTTAA↑G 5＇
5＇ A↓AGCTT 3＇ 3＇ TTCGA↑A 5＇
5＇ G↓GATCC 3＇ 3＇ CCTAG↑G 5＇
5＇ C↓TGCAG 3＇ 3＇ GACGT↑C 5＇
enzymes Hpa Ⅰ blunt end EcoRⅠ 5’protruding end HindⅢ 5’protruding end BamHⅠ 5’protruding end PstⅠ 3’protruding end
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2. 限制酶的命名
现在通用的命名原则是：第一个字是细菌属名的第一个字母， 第二、三个字是细菌种名的前二个字母，这些字母都用斜体字 母；接下去是细菌菌株的第一个字母，用正体字母书写。如果 同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ 、Ⅲ……来代表。现在列表举例说明如下
限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特 定核苷酸序列，并在识别位点或其附近切割DNA双链的 核酸内切酶。
主要是从原核生物中分离纯化出来的。 据统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各 种不同的微生物当中，分离出了2300种以上、可识别230 种不同的DNA序列。目前已经发现3500种以上，而且商 业化的有250种之多．
EcoRI
E： 表示大肠杆菌属名第一个字母 co： 表示种名头两个字母 R： 表示菌株名第一个字母
I： 表示该菌中第一个被分离出来的酶。
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细菌原名
几种限制性内切酶命名原则举例
细菌种名
菌株名称 限制酶名称
Arthrobacter Luteus
AluⅠ
Bacillus
amyloliquefaciens H
核糖核酸酶(Rnase)专门水解断裂RNA分子, 脱氧核糖核酸酶(DNase)特异水解断裂DNA分子 。
按水解断裂核酸分子的不同方式核酸酶分为两种类 型：
核酸外切酶(exonuclease) :从核酸分子的末端开始， 一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链。
核酸内切酶(endonuclease):从核酸分子 内部切割磷 酸二酯键使之断裂形成小片段。
限制作用和修饰作用都是由寄主控制，统称为寄主控制的限制 与修饰现象。
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978 年诺贝尔生理学和医学奖
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限制作用的本质是限制酶的切割反应，修饰作用的本质则是甲基 化酶的甲基Байду номын сангаас作用。
Hsd R:编码限制酶；hsd M:编码甲基化酶；hsd S：表达产物协 助上述两种酶识别特殊的作用位点。
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4. Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性：
4.1Ⅱ型限制性内切酶的识别序列
绝大多数的Ⅱ型核酸内切限制酶，都能够识别由4 一6个核苷酸对组成的特定的核苷酸序列，我们称 这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而限制 酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此识别 序列又称内切酶的靶子序列。
识别序列通常具有二重旋转对称轴，序列呈回文结 构（palindromic structure）。即有一个中心对称 轴，从这个轴朝二个方向“读”核苷酸顺序都完全 相同。
当有DNA入侵细菌时，修饰酶修饰宿主自身的DNA，使之打上标记 ，避免自身的DNA被限制性内切酶分解；限制酶降解外来的DNA，自 身DNA由于修饰酶的甲基化而受到保护。
限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制–修饰系 统
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第一节限制性内切酶Restriction Enzyme (RE)
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4
第一节限制性内切酶Restriction Enzyme (RE) 1.限制性内切酶的发现
Lurva和Human（1952）以及Bertani和Weigle（1953）发现了λ 噬菌体的限制作用，即在一种宿主细胞生长良好的λ噬菌体， 但在另一种宿主细胞中生长很差。
修饰作用：第二个寄主菌株赋予λ噬菌体非遗传的变化，使之 再感染时能够有效生长，而没有再次受到限制的现象。
第三章 工具酶
基因工程使用的工具酶具有一个重要特征： 每一种酶都具有自身特定的功能。有的像" 手术刀"，可以进行DNA分子的特定切割；有 的像"粘合剂"，可以促进DNA分子之间的粘 合和连接；有的像"砌砖机"，可以合成完整 的双链DNA分子。
精品医学
1
核酸酶:通过切割相邻的两个核苷酸残基之间 的磷酸二酯键，使核酸分子多核苷酸发生水解断 裂的酶。
BamHⅠ
Escherichia Coli
RY13
EcoRⅠ
Haemophilus influeuzae
Rd
精品医学
HindⅢ
13
3.限制酶的种类
根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为I、 II、III三种类型.
I型：能识别专一的核苷酸顺序，在距识别点数千碱基处 随机切割DNA分子中的双链。