酵母表面展示T载体构建及目的蛋白的表面展示
酵母菌表面展示操作步骤之表面展示载体整合
酵母菌表面展示操作步骤之表面展示载体整合表面展示载体在酵母菌表面展示技术中起着至关重要的作用。
表面展示载体是指在酵母菌表面特异性展示目标蛋白的分子工具，通过将目标蛋白与载体蛋白融合，并通过特定的信号序列将其导向酵母菌表面，实现目标蛋白在细胞外可见的表面展示。
本篇文章将针对表面展示载体整合的操作步骤进行详细介绍。
1. 选择适合的表面展示载体：首先，根据实验需要和目标蛋白的性质选择适合的表面展示载体。
常见的表面展示载体包括酵母菌表面抗原（Agα）载体和冷冻冰芯抗原（Lip)载体等。
这些载体通常具有表面可见性高、易操作和高表达效率等特点。
2. 构建表面展示载体：将目标蛋白的编码基因与表面展示载体的载体基因进行连接，通常使用重组DNA技术进行连接。
通过选择适当的限制性内切酶和连接酶，可以将两个基因顺利连接，并形成表面展示载体。
3. 将表面展示载体转化至酵母菌：使用化学法或电穿孔法将表面展示载体转化至酵母菌中。
化学法通常通过将表面展示载体混合物与酵母菌细胞一起处理，而电穿孔法则是利用高压电场将表面展示载体导入酵母菌细胞内。
4. 选择正取克隆：通过选择酵母菌转化后的克隆或分析转化克隆来筛选正取克隆。
一般采用划线法在培养基上萃取单个克隆，并通过PCR或Western blot等方法验证表面展示载体的整合情况。
5. 表面展示载体整合验证：使用Western blot或流式细胞术等方法对正取克隆进行验证，检测目标蛋白的表达情况。
通过比较正取克隆与对照组（没有转化表面展示载体的酵母菌）的表达水平，确认目标蛋白的表面展示载体已经成功整合至酵母菌表面。
6. 体外检测目标蛋白：通过培养正取克隆的酵母菌，采用细胞裂解和纯化技术，获得目标蛋白。
通过Western blot、分析纯化蛋白质的活性或抗原性等方法对目标蛋白进行检测和验证。
在进行酵母菌表面展示操作时，需要注意以下几点：a. 严格控制转化的表面展示载体的用量，避免过多或过少的载体浓度影响到目标蛋白的表达水平。
酵母菌表面展示操作步骤的主要过程
酵母菌表面展示操作步骤的主要过程酵母菌表面展示是一种常用的实验技术，用于在酵母菌表面展示外源蛋白或多肽。
这种技术可以应用于生物研究、药物开发和基因工程等领域。
下面将详细介绍酵母菌表面展示的主要操作步骤。
1. 构建酵母菌表面展示载体首先，需要设计和构建酵母菌表面展示载体，该载体通常由酵母菌表面展示蛋白（例如Agα1蛋白）与目标蛋白/多肽之间的连接区域组成。
这个连接区域可以是多样化的，根据实验需求选择不同的区域进行连接。
2. 选择合适的宿主酵母菌株根据实验需要，选择合适的宿主酵母菌株进行表面展示。
Saccharomyces cerevisiae是常用的酵母菌株，其具有良好的遗传转化特性和对多肽展示的高效能力。
3. 将表面展示载体转化入酵母菌将设计好的表面展示载体通过遗传转化技术转化入酵母菌株中。
转化方法一般包括化学法、电穿孔法和冲击法等。
通过转化，可以将表面展示载体导入酵母菌细胞内，使其在细胞表面显示。
4. 确定表面展示蛋白的表达通过检测和筛选，确认表面展示载体已成功表达在酵母菌细胞表面的蛋白。
可以采用免疫荧光染色、酵母小片染色和Western blot等技术方法进行验证。
5. 进行表面展示蛋白的定性定量分析对表面展示的蛋白进行定性定量分析是评估酵母菌表面展示效果的关键步骤。
定性分析可以使用免疫荧光染色、流式细胞术等技术来确认目标蛋白在酵母菌表面的存在。
定量分析可以通过Western blot或ELISA等方法来测定目标蛋白的表达水平。
6. 进行蛋白/多肽的筛选与优化根据目标蛋白的特性，可以进行蛋白/多肽的筛选与优化。
通过调整不同参数，如显示载体的选择、培养条件的优化等，可以提高酵母菌表面展示系统的表达效果。
7. 应用实验将酵母菌表面展示系统应用到具体的实验中。
比如，可以利用该系统筛选潜在药物靶点，通过与外源蛋白/多肽的相互作用来分析蛋白结构与功能等。
8. 结果分析和展示对实验结果进行分析和展示。
可以使用统计学方法对数据进行分析，并将结果以图像、图表和文献形式展示出来。
酵母菌表面展示操作步骤的过程介绍
酵母菌表面展示操作步骤的过程介绍酵母菌表面展示是一种基因工程技术，通过将目标蛋白质或多肽序列与酵母菌表面展示系统结合，实现对这些蛋白质或多肽的展示和筛选。
这种技术被广泛应用于药物研发、抗体筛选、酶工程、蛋白质相互作用研究等领域。
以下是酵母菌表面展示的操作步骤：1. 构建表面展示载体：选择合适的酵母菌表面展示系统，并根据需要构建表达载体。
常见的酵母菌表面展示系统包括酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），大肠杆菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），大肠杆菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），大肠杆菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），大肠杆菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酿造酵母鲜酪公田展示库（例如CCAGG）。
2. 克隆目标基因：将目标基因（需要展示和筛选的蛋白质或多肽）插入构建的表达载体中。
常用的克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶联制和DNA连接等。
3. 转化酿酒酵母：将构建好的表达载体导入酿酒酵母中。
转化方法可以采用电穿孔、化学转化或冷冻复苏法等。
4. 培养酵母菌：将转化后的酵母菌接种到含有适当选择性培养基的培养基上，并在适合的温度下培养。
培养基中的选择性物质可以选择对含有目标蛋白质的菌落进行筛选。
5. 筛选目标蛋白质：根据需要对酵母菌进行筛选。
常用的筛选方法包括抗体或配体结合、酶活性分析、细胞亲和力或细胞表型选择等。
6. 测试和验证：对筛选出的目标蛋白质进行测试和验证。
可以使用多种方法，如Western blot、ELISA、流式细胞术、活细胞荧光显微镜等。
酵母菌表面展示的核心操作步骤
酵母菌表面展示的核心操作步骤酵母菌表面展示是一种常用的生物工程技术，通过改变酵母细胞表面的特定蛋白质结构，实现对目标蛋白质的展示。
这项技术在药物研发、生物治疗、食品工业等领域具有广泛的应用前景。
在进行酵母菌表面展示实验时，需要遵循一系列的操作步骤，以确保实验的准确性和成功率。
以下是酵母菌表面展示的核心操作步骤：1. 酵母菌培养：首先，准备适当的培养基，用于酵母菌的培养。
将培养基倒入培养皿或试管中，经过无菌处理后，接种已经活化的酵母菌菌种。
将培养皿或试管放入恒温培养箱中，在适当的温度下进行培养，通常为30℃。
2. 酵母菌菌种扩增：将酵母菌菌种从培养基中提取，用无菌的培养基进行多次传代培养，以扩大菌种数量。
在传代培养过程中，确保每次传代时选择适当的培养基和培养条件，以维持酵母菌的生长和健康状态。
3. 载体构建：选择适当的载体，将目标蛋白质的编码序列与酵母菌表面展示相关的信号肽序列连接，构建融合蛋白表达的载体。
通过限制性内切酶切割，将目标基因插入载体的相应位点，构建融合蛋白表达载体。
4. 酵母菌转化：将构建好的载体转化至酵母菌中。
通常使用电穿孔法或化学法将载体导入酵母菌细胞，使其发生转化。
转化后，将转化菌涂覆于含有适当选择抗性基因的培养基上进行筛选，以获得具有插入载体的酵母菌株。
5. 表达蛋白的培养：选取含有插入载体的酵母菌株进行蛋白表达培养。
在控制培养条件的基础上，进行适当的培养时间和温度设置，保证目标蛋白质有效表达。
6. 蛋白质检测与分析：通过酵母菌表面展示的特殊技术，检测和分析目标蛋白质是否成功地表达在酵母菌表面。
常用的分析方法包括流式细胞术、ELISA、Western blot等。
7. 优化与改进：根据实验结果进行进一步的优化与改进。
根据需求，可能需要改变培养条件、优化载体的构建等，以提高酵母菌表面展示技术的效果。
总结：酵母菌表面展示是一项重要的生物工程技术，通过一系列精确的操作步骤，能够实现对目标蛋白质的表达和展示。
酵母菌表面展示的操作步骤
酵母菌表面展示的操作步骤酵母菌表面展示的操作步骤：酵母菌表面展示技术是一种基因工程技术，用于在酵母菌表面显示外源蛋白。
这项技术具有广泛的应用前景，可以用于疫苗研发、抗原表位筛选、酶工程等领域。
以下是酵母菌表面展示的一般操作步骤：1. 制备酵母菌工作库：首先，选择适合表面展示的酵母菌株，如Saccharomyces cerevisiae或Pichia pastoris等。
然后，将目标蛋白的编码序列与酵母菌表面展示载体进行连接，得到重组质粒。
将重组质粒导入酵母菌细胞中，经过适当的培养和筛选，得到酵母菌工作库。
2. 构建表面展示的载体：将目标蛋白的编码序列与表面展示载体连接，通常采用DNA重组技术，将目标蛋白编码序列与表面展示载体的启动子、终止子以及分泌信号序列等序列连接起来。
确保连接正确无误后，得到表面展示载体。
3. 将表面展示载体转化入酵母细胞：将表面展示载体导入酵母细胞，可以采用化学法转化或者电击法转化。
在转化过程中，需要添加适当的选择性培养基，筛选转化成功的酵母菌克隆。
4. 诱导表面展示蛋白的表达：将转化成功的酵母菌接种至培养基中，培养一定时间，使酵母菌开始生长。
在适当的时间点，添加诱导剂，如酒石酸或甘油等，刺激酵母菌产生表面展示蛋白。
5. 检测表面展示蛋白的表达：采用免疫学检测方法，如免疫印迹、免疫荧光等，检测表面展示蛋白的表达情况。
可以使用特异性抗体来识别表面展示蛋白，并观察其在酵母菌表面的分布情况。
6. 验证表面展示蛋白的功能：针对表面展示蛋白的功能特性，进行相应的活性鉴定实验。
例如，对于展示的酶类蛋白，可以进行酶活测定；对于展示的抗原蛋白，可以进行抗原性测试。
总结：酵母菌表面展示技术是一种重要的基因工程技术，通过将外源蛋白表面展示在酵母菌细胞上，实现了对蛋白的高效表达和功能验证。
通过以上的操作步骤，可以成功制备出表面展示蛋白的酵母菌工作库，并通过免疫学检测和功能验证来验证表面展示蛋白的表达和功能。
酵母菌表面展示实验培养步骤
酵母菌表面展示实验培养步骤酵母菌表面展示实验是一种常见的生物学实验方法，用于研究酵母菌表面展示蛋白质的特性和功能。
通过表面展示，研究人员可以更好地理解蛋白质的结构、功能和相互作用，从而为疾病治疗和药物开发提供重要的信息。
以下是酵母菌表面展示实验的一般步骤：1.选择合适的酵母菌株：通常选择适合表面展示的酵母菌株，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或毕赤酵母（Pichia pastoris）。
对于不同的研究目的，可能会选择不同的酵母菌株。
2.构建表面展示载体：将目标蛋白质的编码基因插入表面展示载体中。
表面展示载体通常包括信号肽序列、连接子和表面展示结构域。
信号肽序列负责将蛋白质定向送达到酵母细胞内质网，连接子用于连接信号肽和表面展示结构域。
3.转化酵母细胞：将构建好的表面展示载体导入酵母细胞中。
常用的转化方法包括电击转化、化学转化或冷冻转化等。
转化后的细胞需要在含有合适选择性培养基的条件下进行筛选和培养。
4.诱导表面展示：在培养酵母细胞的过程中，通过添加适当的诱导剂或调整培养条件，使目标蛋白质表面展示。
这一步骤通常需要根据具体实验要求进行优化和调整。
5.采集表面展示蛋白质：培养一定时间后，通过离心等方法采集含有表面展示蛋白质的酵母细胞。
采集后的酵母细胞需要进行后续处理，如洗涤、裂解等。
6.分离和纯化表面展示蛋白质：通过适当的分离和纯化方法，将采集的酵母细胞中的表面展示蛋白质从其他细胞组分中分离出来。
常用的方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。
7.鉴定和分析表面展示蛋白质：使用适当的技术手段，如免疫印迹、质谱分析等，对纯化的表面展示蛋白质进行鉴定和分析。
这些方法可以确定蛋白质的分子量、结构和相互作用等特性。
需要注意的是，酵母菌表面展示实验是一个复杂的过程，每个步骤都需要仔细优化和调整。
实验者需要具备一定的实验技巧和相关知识，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，实验过程中也要注意实验室的安全操作规范，保证个人和实验室的安全。
酵母菌表面展示操作步骤及操作要点
酵母菌表面展示操作步骤及操作要点酵母菌表面展示是一种常用的实验技术，它能够直接将目标分子或多肽等表面展示在酵母菌表面，从而实现相关蛋白的鉴定、筛选和研究。
在本文中，我将介绍酵母菌表面展示的详细操作步骤及需要注意的操作要点。
操作步骤：1. 酵母菌的预培养：将所需的酵母菌菌株接种到培养基中，在30°C的恒温振荡培养器中培养过夜。
确保菌液的浓度适合后续的操作步骤。
2. 质粒构建：根据实验目的，设计质粒并构建。
一般采用重组DNA技术，将目标基因插入到合适的表达载体中，以便在酵母菌表面展示。
重组质粒可以通过化学转化或电转化的方式导入酵母菌中。
3. 酵母菌的转化：用构建好的质粒转化酵母菌。
将适量的酵母菌菌液取出，与质粒混合并通过热激转化或电激转化等方法将质粒导入酵母菌中。
转化后将菌液在培养基上培养一段时间以增加酵母菌数量。
4. 组织鉴定及筛选：用适当的选择性培养基(如缺少某种氨基酸、碱基或胁迫因子的培养基)进行培养，以筛选出表达了目标蛋白的酵母菌。
同时，利用特定抗体或荧光标记等方法进行酵母菌表面展示蛋白的定位与鉴定，确保目标蛋白被成功表面展示。
5. 表面展示蛋白的鉴定与确认：通过Western blot、流式细胞术等方法对表面展示蛋白进行鉴定与确认。
同时，也可以利用荧光素酶、酶提示法或荧光显微镜等技术手段对目标蛋白进行定量和定位分析。
操作要点：1. 严格控制实验条件：酵母菌的培养温度、培养时间和培养基的配方等都会影响到表面展示效果，务必要严格控制实验条件。
2. 质粒的构建：构建质粒时，要仔细选择合适的限制性内切酶用于酵母菌质粒的线性化，以便在质粒导入到酵母菌时的高效转化。
此外，注意合理选择启动子、引物和基因信使RNA结构等细节设计。
3. 质粒的合适选择：根据所需展示蛋白的性质和功能需求，选择适合的表达质粒。
考虑到酵母菌的表达水平、细胞毒性和选择性筛选等因素。
4. 菌种的合理培养：培养酵母菌时要维持适宜的菌液浓度，以确保后续实验步骤的可操作性。
酵母菌表面展示操作步骤详解
酵母菌表面展示操作步骤详解酵母菌表面展示是一种常用的生物学实验技术，在生物医学研究、蛋白质表达和酵母遗传工程领域广泛应用。
它通过将目标蛋白质或肽链与酵母菌表面蛋白结合，使其在酵母菌表面展示出来，方便研究人员进行后续的功能研究和免疫学筛选等。
下面将详细介绍酵母菌表面展示的操作步骤：1. 构建酵母表面展示载体：选择合适的载体是酵母表面展示实验的首要步骤。
常用的载体包括pYEX、pCTCON、pCTTEV和GFP等。
根据需要选择具有相应表达子和突变体的载体，或进行进一步定制化设计。
2. 转化酵母菌：将构建好的载体导入酵母菌中，使用双杂交法（yeast two-hybrid）或化学转化法等方法进行转化。
确保得到的菌落包含目标载体，并通过PCR或测序确认插入片段的正确性。
3. 培养和预处理：将转化后的酵母菌接种在富含复合碳源的选择性培养基中，培养过程中定期检测菌落的生长情况。
使用含有抗生素的培养基可以筛选出带有目标载体的酵母菌。
4. 诱导表达：根据实验需要，在酵母菌的生长阶段适当的时间点诱导目标蛋白的表达。
一般可以使用变温、添加特定诱导剂或调节培养基pH值等方法。
5. 收获菌液：在诱导表达后，通过离心和洗涤的方式收获酵母菌。
注意避免杂质的污染，保证获得纯净的菌体。
6. 洗涤和固定：将酵母菌通过洗涤去除附着在细胞表面的杂质，例如未结合的蛋白、培养基组分和细胞外DNA等。
可以使用PBS（磷酸盐缓冲液）进行洗涤，多次重复以确保彻底清洗。
随后，使用适当的试剂固定酵母菌，例如4%的乙醛或细胞固定化学试剂。
7. 目标蛋白检测/筛选：通过免疫染色、荧光显微镜观察或流式细胞术等方法，监测和筛选出表达和展示目标蛋白的酵母菌。
根据实验要求使用相应的探针或抗体对目标蛋白进行特异性检测。
8. 功能研究：根据目标蛋白的特性和实验设计，可以进行一系列的功能研究。
例如，通过细胞表面与其他分子（蛋白、肽等）的相互作用来研究蛋白的功能、传递信号和相互作用网络。
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酵母表面展示T载体构建及目的蛋白的表面展示摘要：构建一种能对PCR产物进行直接克隆并展示于酵母表面的新型T载体。
根据酵母表面展示载体pYD1多克隆位点序列设计出利用两端带有Xcm I 内切酶酶切位点的含有黄色荧光蛋白基因的Xcm I酶切盒，通过Nhe I和Xho I 酶切位点插入到pYDl裁体上形成质粒pYD-YFP，并对其进行酶切鉴定和DNA 测序分析，再经Xcm l酶切后形成两端带有dT的表面展示T载体。
利用PCR 扩增两个含有荧光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-DsRed的基因并直接克隆到所构建的T载体中，检测其表达功能。
酶切鉴定和DNA测序结果显示PCAD-CFP和PSR-DsRed正确插入载体上，分别转化至酿酒酵母EBY100中，激光共聚焦显微镜下观察到相应的荧光的酵母，表明克隆有融合蛋白基因片段的载体成功在酵母细胞中进行表面展示，证明了所构建的酵母表面展示T载体具有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。
关键词：T栽体：酵母表面展示；真核表达：Xcm I酶切盒酵母表达系统具有培养成本低廉、便于大规模培养和培养周期短等特性，同时又具有真核生物的蛋白翻译后修饰功能，近年来逐渐用于药用和食用蛋白的生产。
酵母表面展示技术（yeastsurface display system）在20世纪90年代初开始兴起，是-种将外源蛋白质进行固定化表达的真核展示系统.广泛应用于蛋白质的相互作用、抗体研制、蛋白分子定向等领域，特别在生物乙醇生产过程中起到关键作用，包括淀粉酶、纤维素酶等酶蛋白均已进行表面展示。
a凝集素和α凝集素是锚定在细胞壁上的甘露糖蛋白，介导单倍体交配型（MATa）和（M ATα）的识别和粘附。
最常见酵母表达系统为a凝集素展示系统和α凝集素展示系统，a凝集素由两个亚单位Agalp和Aga2p组成，由于Agalp亚基通过与细胞壁上的β葡聚糖的共价连接而锚定在细胞壁，Aga2p和Agalp两个亚基通过两对二硫键相连，因此a展示系统是将a凝集素的Aga2p亚基与目的蛋白进行融合，在信号肽的引导下实现酵母的表面展示。
α凝集素展示系统则将目的蛋白与α凝集素融合，从而将其展示于酵母细胞表而。
其中酵母表而展示主要采用的宿主菌是酿酒酵母（Sacclzaromyces cerevisiae），已被FDA列为CRAS （Generally regarded as safe）原材料.酿酒酵母表面展示能够把日的蛋白与凝集素功能结构域融合，将目的蛋白表达并定位于酵母细胞膜的表面，不但易于纯化鉴定，并且酵母具有真核生物的翻译后修饰体系，能表达具有一定活性的真核生物的蛋白。
相比细胞内表达的酶.酵母表面展示可多次生产展示于细胞表面的蛋白，并且在廉价的培养基中培养可达到很高的细胞密度，适应工业生产需求，省去酶的纯化和固定化等繁琐步骤。
构建酵母表而展示载体是蛋白质进行酵母表面展示的基础，PCR产物克隆需耗费大量的时间与精力在表达载体的构建、质粒的提取和重组子的鉴定上，而利用T载体可对PCR产物进行快速有效的克隆，因此有必要构建一个可直接对PCR产物进行克隆和表达的酵母表面展示T载体，特别是进行大量的PCR产物克隆时，可以极大减少实验操作的步骤。
本文克服了常规构建表达载体操作繁琐的缺点，以酵母表面展示载体pYDl 为基础，通过向载体pYDl插入含有黄色荧光蛋白基因的Xcm I酶切盒，再切除黄色荧光蛋白基因来构建酵母表面展示T载体，并利用荧光蛋白基因检测该表面展示载体的克隆和表达功能。
1 材料与方法1.1材料1.l.l 菌株和载体克隆载体pMD-18T购自日本Takara公司；pDsRedl-Nl、pEYFP-Cl、pECFP-Cl、pYD-l载体购自美国Invitrogen公司，大肠杆菌JM107和酿酒酵母EBY100由本实验室保存。
1.1.2主要试剂Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购于日本rllakara公司；限制性核酸内切酶Nhe I、Nde I、Xho I、BamH I、Xcm I为美国NEB（北京）公司产品；所有PCR反应的引物（表1）及测序均在北京华大基因公司合成。
1.2方法1.2.1 Xcm I酶切盒的合成以含有黄色荧光蛋白基因的质粒pEYFP-Cl为模板，使用的引物pYDTl和pYDT2（表1），进行PCR扩增，扩增含有黄色荧光蛋白基因位点的Xcm I酶切盒，长度约760 bp，扩增程序为：预变性94℃ 5 min；94℃30 s，55℃50 s，72℃10 min，进行30个循环，72 ℃延伸7 min。
PCR产物进行l%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收后，通过T4 DNA连接酶连接至pMD-18T裁体，重组载体命名为pMD-YFP，并送往华大基因公司进行序列测定，分析克隆基因序列组成及其阅读框架的正确性。
1.2.2 酵母表面展示T载体pYD-T的构建及鉴定用限制性内切酶Xho 1和Nhe l酶切pMD-YFP后进行电泳，切胶回收切出的小片段，连接到经由同样的限制性内切酶酶切pYDl质粒上，获得的重组质粒命名为pYD-YFP，质粒及多克降位点序列图谱见图l。
将pYD_YFP转入大肠杆菌JM107感受态细胞中，涂布于含50 μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃培养过夜后挑取单菌落提取质粒.对酶切鉴定正确的质粒再进行DNA测序分析将DNA测序正确的pYD-YFP转化至酵母EBY100感受态细胞，铺于SD/Trp-平板上培养，挑取直径为2～3 mm的酵母EBYIOO单菌落于于10 mL，酵母SD/Trp’液体培养基（含2%乳糖）中进行诱导表达.30℃，200 r/min条件下培养48～72 h。
取诱导后的酵母菌液300μL，1 000 r/min离心5 min，去上清液，用lmL无菌水洗涤并重悬菌体，由于原载体pYD-PYDl是酿酒酵母表而展示载体、改造后的载体上插入带有YFP基因的酶切盒片段，YFP蛋门通过锚定蛋白展示到酵母细胞壁上，因此在505 nm激发光下通过激光共聚焦显微镜可直接观察到相应的荧光，证明了载体pYD-YFP的正确性。
质粒pYD-YFP经Xcm I酶切后，回收载体部获得酵母表而展示T载体。
1.2.3 酵母表面展示T载体pYD-T克隆目的基因本文利用多头绒泡菌（Physarum，poly-cephalun）的两个蛋白肉桂醇脱氢酶PCAD （Gen-Bank登陆号：KF861979.1）和PSR蛋白（GenBank登陆号：FJ917746）对pYD-T的功能进行验证。
使用引物TCADP1、CAD-CFPP2和CFPP3通过重叠PCR将PCAD与青色荧光蛋白eCFP的两个基因连接构成融合基冈PCAD- CFP。
另外使用引物pSR -TPl .pSR -DsRedP2和DsRedP3通过重叠PCR 将PSR和红色荧光蛋门DsRed两个基因连接构成融合基因PSR-DsRed，以上两个融合基因基因片段3’端均引入一个BamH I酶切位点。
将pYD-T载体用限制性内切酶Xcm l酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳后回收载体部分，得到两端带有突同T的线性化T载体，分别连接PCAD-CFP和P.SR-D.s Red，获得的重绀载体分别命名为pYD-PSR-DsRed和pY D—PCAD一CFP，融合蛋白表面展示示意图见图2。
将连接好的重组载体转入大肠杆菌JM107感受态细胞中，涂板37℃培养过夜。
挑取长势良好的单菌落接种于LB液体培养基中培养，提取质粒DNA进行酶节鉴定。
1.2.4 酵母表面展示T载体pYD-T表达功能验证将pYD -PSR-DsRed和pYD - PCAD一CFP重组载体分别转化至酿酒酵母感受态细胞中，操作过程参见文献，将菌液铺于SD/Trp-培养板，30℃培养3 d，通过菌液PCR筛选阳性转化子。
将阳性转化子接种于酵母SD/Trp-液体培养基（含2%乳糖）中，30 ℃，200 r/min培养48—72 h取适量的菌液在激光共聚焦显微镜下观察拍照。
2 结果与分析2.1 酵母表面展示T载体pYD-T载体的构建将Xcm I酶切盒片段克隆到pMD-18T载体中形成重组载体pMD-YFP.用限制性内切酶Nhe I和Xho I酶切鉴定，结果见图3泳道1、2、3，酶切出的片段与Xcrn I酶切盒长度相近，约为760 bp。
Xcm I酶切盒片段通过Nhe I和Xha I 位点插入酵母表而展示表达载体pYD-l中，得到载体pYD-YFP重组，酶切鉴定结果见图3泳道4 ，5；图3泳道6为重组载体pMD-YFP经过Xcm I酶切出YFP 皋因后，回收载体部分获得酵母表面展示T载体pYD-T。
DNA测序结果表明所构建的真核表达载体含有完整的黄色荧光蛋白位点及酶切盒，证明pYD-YFP载体构建成功。
pYD-YFP质粒转化至酿酒酵母EBY 100后经SD诱导培养基诱导72 h后.在激光共聚焦显微镜下拍摄到的细胞表面展示的YFP蛋白，图4中均能清晰看到酵母表面展示呈现为绿光，这是因为带有黄色荧光蛋白基因的酵母在青光的激发下呈现两种光的合成光.即为绿色，部分酵母表面的绿色呈光圈状，这说明Xcm I酶切盒中黄色荧光蛋白YFP已经在酵母细胞膜上展示。
2.2 酵母表面展示T载体pYD-T克隆功能的鉴定目标基因片段用PCR扩增方法在5’或3’端引入一个与T载体的3’或5’端所对应相同的限制性内切酶位点（该限制性内切酶位点务必确保在PCR片段中或者在T载体有且仅有一个），本文在PCAD-CFP和PSR-DsRed基因片段3’端引入一个BamH I酶切位点，与载体5’端的BamH I酶切位点相对应.连接目的基因的PCR产物与T载体构成重组载体，利用所设的限制性内切酶进行单酶切鉴定。
本研究使用BamH I进行单酶切，如果能切出与目标基因长度大小相近的片段，即可鉴定为正向连接，若没有切出相应大小的DNA片段，则是反向连接，因为实际上反向连接时应该切出约为20 bp左右的片段，由于片段太小电泳后兀法直接观察到，图5、6显示BamH I酶切后得到与重叠PCR产物大小相近的条带，表明CAD-CFP和PSR-DsRed均载体pYD-T正向连接，DNA测序结果同样证明了重组载体pYD-CAD-CFP和pYD-PSR-DsRed构建正确。
2.3 酵母表面展示T载体pYD-T的展示功能验证将重组载体pYD-CAD-CFP和pYD- PSR -DsRed转化至酿酒酵母BY100感受态细胞中，挑取单菌落后接种至在SD/Trp-液体培养基（含20乳糖）中，30 ℃中震荡培养3d后在激光共聚焦显微镜下的观察展示结果，分别用558nm和405nm激发光检测，可以看到酵母的表面发出明亮的红光、青光，见图7、8结果显示目标蛋白主要分布在酵母细胞的表面，形成明显的青色或红色光圈，证明CAD-CFP、PSR-DsRed融合蛋白已经成功在酵母表而展示。