酿酒酵母表面展示表达系统及应用
酿酒酵母表面展示表达系统及应用PPT课件
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凝集素展示表达系统
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凝集素展示表达系统
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凝集素展示表达系统
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絮凝素展示表达系统
絮凝素Flo1p 是一种新兴的展示系统,它是酿酒酵母细 胞表面类似凝集素的细胞壁蛋白。 • 目前，已经形成了两种类型的絮凝素展示系统 ： • 一是GPI 系统 ；根据目的蛋白的特性和实验目的确定截去 Flo1p 肽段的长度,然后,目的蛋白的C 端融合到锚定序列 上。 • 二是利用Flo1p 的絮凝结构域的黏附能力创建一个表面展 示系统。
酿酒酵母表面展示表达系统及应 用
报告人：刘顺
2010.11.10
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主要内容 1 概念
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两种系统
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应用
4
优缺点
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一、概念
酿酒酵母表面展示表达系统： 一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，
即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融 合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制（糖基磷脂酰肌醇，GPI锚定）， 使靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面，之后用葡聚 糖酶抽提细胞壁目的蛋白。
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GPI 系统
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絮凝结构域系统
Байду номын сангаас
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应用
近几年来，酿酒酵母细胞表面展示表达系统迅速发 展并在多个领域获得应用，展现出广阔的发展前景。 1、作为生物催化剂展示表达各种酶蛋白：
淀粉分解酶、纤维素分解酶、脂酶 2、环境治理中展示表达金属蛋白 3、蛋白质分子的相互作用及组合蛋白库的构建 4、可作为生物传感器的荧光蛋白的展示表达 5、免疫学中的应用
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酵母菌表面展示操作步骤的观察和评估
酵母菌表面展示操作步骤的观察和评估酵母菌表面展示是一种常用的实验方法，用于研究酵母菌的表面蛋白质在细胞膜上的展示和定位。
本文将详细介绍酵母菌表面展示的操作步骤，并对实验结果进行评估。
步骤一：构建酵母表面展示载体首先，选择合适的酵母菌株作为工作菌株。
常用的酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和盐酸毛癣菌(Pichia pastoris)等。
其次，选择适当的表面展示载体。
常用的表面展示载体包括酵母菌PLD1基因和诱导剂酵母菌的pYES2载体等。
从酵母基因库中提取目标基因的DNA序列，并将其连接到表面展示载体上。
最后，通过酵母基因转化技术将表面展示载体转化到酵母菌中，形成表面展示的酵母菌株。
步骤二：诱导表面展示在培养基中加入适当的诱导剂，例如甘露醇或果糖，用以诱导目标基因的表达。
将转化后的酵母菌株在含有诱导剂的培养基中培养一段时间，通常为24-48小时。
步骤三：收获酵母菌细胞收获诱导后的酵母菌细胞，并用适当的缓冲液洗涤菌体。
为了确保酵母菌细胞处于最佳状态，可以使用显微镜观察菌体形态，并进行密度调整。
步骤四：观察酵母菌表面展示使用适当的染色剂或荧光标记剂，对酵母菌细胞进行染色，以观察表面展示效果。
可以选择荧光显微镜或流式细胞仪等设备进行观察和检测。
步骤五：评估酵母菌表面展示评估酵母菌表面展示的效果可以从多个方面进行。
首先，观察表面展示的酵母菌细胞形态和分布情况。
正常的表面展示细胞应该呈现均匀的分布和较大的细胞形态。
其次，可以通过染色或标记剂的强度来评估表面展示效果。
荧光强度越高，表示表面展示的目标基因越充分。
此外，还可以通过抗体识别和流式细胞仪等技术来评估表面展示效果。
通过与特定抗体的结合，可以确定目标基因是否成功展示在酵母菌的表面。
综上所述，酵母菌表面展示操作步骤的观察和评估是一个非常重要的实验过程。
通过逐步执行实验步骤，我们能够观察到展示效果，评估展示效果的有效性以及基因的分布情况和形态。
酿酒酵母表面展示表达系统及应用
凝集素展示表达系统
凝集素展示表达系统
凝集素展示表达系统
絮凝素展示表达系统
絮凝素Flo1p 是一种新兴的展示系统,它是酿酒酵母细 胞表面类似凝集素的细胞壁蛋白。 • 目前，已经形成了两种类型的絮凝素展示系统 ： • 一是GPI 系统 ；根据目的蛋白的特性和实验目的确定截去 Flo1p 肽段的长度,然后,目的蛋白的C 端融合到锚定序列 上。 • 二是利用Flo1p 的絮凝结构域的黏附能力创建一个表面展 示系统。
• 其中分别由AGα1、AGa1／AGa2和Flo1表达异源蛋白的 凝集素和絮凝素酵母细胞展示表达系统应用较多。
凝集素展示表达系统
α凝集素和ａ凝集素是酵母细胞壁上的两种甘露糖 蛋白，它们在酿酒酵母的交配型α（ＭＡＴα ）和 交配型ａ（ＭＡＴａ）单倍体细胞之间介导细胞 与细胞的性粘附，使细胞融合形成双倍体 。
二、两种系统
•
酿酒酵母细胞壁主要由外层的甘露糖蛋白和内层的葡
聚糖骨架组成，两者通过共价健相连。外层甘露糖蛋白有
两种类型：
• 一种是通过非共价健与酵母细胞壁松散相连并能被ＳＤＳ 提取出来的低分子量蛋白；
• 一种是必须被葡聚糖酶酶解细胞壁的β-１，3-和β-１，６葡聚糖层后才能被ＳＤＳ抽提的高分子量蛋白，包括凝集 素、絮凝素、Sed1p、Cwp1p、 Cwp 2p和Tip1p、Tir1p 、Srp1p等。后者的结构中大多都含有GPI锚定区域
主要内容
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概念2两种系统来自3 应用4优缺点
一、概念
酿酒酵母表面展示表达系统： 一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，
即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融 合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制（糖基磷脂酰肌醇，GPI锚定）， 使靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面，之后用葡聚 糖酶抽提细胞壁目的蛋白。
酵母表达系统在药物研发中的应用研究
酵母表达系统在药物研发中的应用研究酵母表达系统是一种利用酵母菌将外源基因表达的技术。
它广泛应用于药物研发中，是一种重要的基础研究方法。
下面就来探讨一下酵母表达系统在药物研发中的应用研究。
一、酵母表达系统的基本原理酵母表达系统是利用酿酒酵母菌，将外来基因导入到酵母菌中，使其表达外源蛋白质。
外源基因通常以质粒的形式封装进入酵母细胞中，而通常采用的质粒是pYES2、pESC、pGADT等。
这些质粒都具备不同的特定序列，这些序列可以使酵母表达系统实现不同的功能。
在酵母菌表达外源蛋白的过程中，其主要遵循四个步骤:转录、翻译、修饰和定位。
其中，转录和翻译过程非常类似于真核细胞的情况，最终将形成蛋白质。
但是，由于酿酒酵母是一种真核细胞，因此它的蛋白质修饰和定位过程与真核细胞的过程也非常接近。
二、酵母表达系统在药物研发中的应用1. 基因筛选酵母表达系统是基因筛选的一种常用方法。
基因筛选是通过对外源基因随机插入到酵母细胞中，然后判断是否会导致生长缺陷或特定表型的改变。
这种方法常用于寻找与信号转导、代谢途径和基因调控等过程相关的基因。
2. 蛋白结构研究人类的某些蛋白在体内的折叠会受到转录后修饰的影响，出现拓扑结构的变化会对其功能产生很大影响。
利用酵母表达系统就能够在短时间内对蛋白质结构进行研究。
通过酵母菌表达外源蛋白的方法，可以使加入原蛋白质的一段序列在折叠时进行彻底的探究，便于寻找相应的结构域。
3. 药物筛选在药物研发中，酵母表达系统也常被用于药物筛选。
通过酵母表达外源蛋白的方法，可以筛选出一种或多种能够调控目标蛋白的物质，从而对药物进行优化。
例如，先在酵母菌中表达目标蛋白，在检测其功能后，针对它的活性位点进行筛选最优化的化合物。
这就是所谓的基于蛋白的药物发现。
三、酵母表达系统的优势和局限酵母表达系统在药物研发中有着广泛的应用，这是因为它具有许多优点。
首先，酵母表达系统简单、成本低。
其次，酵母表达系统样品预备时间短，能够快速得到高度纯净的蛋白质。
酿酒酵母孢子表面展示系统的构建及应用
而父 于利 ｆ ¨ 涨 酵 母孢 子 来 进 行
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酿 涧 酵母 以酣 酸盐 为唯 一或 卡婴碳源 ， 并 辅 以 缺乏氮 源等 特定 条什 下 ， 就会 以孢 子， ｆ ｆ 的力 式 进行
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Ｇ Ｐ Ｏ， Ｅ ． Ｃ １ ． １ ． ３ ． ２ １ ） 能够 々一 地 催化 Ｌ 一 ３ 一 磷 酸 汕 的氰 化 ， ， 卜成 磷 峻 二 羟 丙 酮 （ （ １ ｉ ｈ ｙ （ １ ｒ ０ ｘ ｙ ａ （ ０ ｎ ｅ ｐ ｈ （ ｐ ｈ ａ ｔ ｅ ，Ｄ Ｈ Ａ Ｐ ） Ｇ Ｐ Ｏ普 遍 存 在 于 链 球 菌 、 乳 酸 、 大
摘 要 旨在 建 立 １种酿 酒 酵 母 孢 子 表 面 展 示 系统 ， 并 将 其 应 用 于 稀 有糖 合 成 。 表 面 展 示 系 统 是 运 用 微 生 物 自 身功 能 把 外 源 蛋 白或 多肽 展 示 在 细 胞 表 面 ， 文 中用 磷 酸 甘 油 氧 化酶 （ Ｇ ｆ Ｏ） 来 验 证 酿 酒 酵 母 孢 子 表 面展 示 糸 统 的 可 行性 将 编 码 肺 炎链 球 诗 束 源 的 （ Ｐ ０的基 因 ｇ ｏ ， ｏ 与信 号 肽 序 列 （ ｓ ｓ ） 融 合后连接 到载体 ｐ Ｒ Ｓ ４ ２ ４ 一 Ｔ Ｅ Ｆ ｐ ｒ上 ， 将 重组质 粒 ｐ Ｒ Ｓ ４ ２ ４ 一 Ｔ Ｅ Ｆ ｐ ｒ — 一 ｇ Ｏ ｏ转 化至 酿 酒 酵母 野 生 型 及 缺 陷 型 菌 株 中并 进 行 产 孢 ， 通 过 荧 光观 察 、 ｗ ｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 分惭 以及 酶 活测 宅 ， 表 明酿 酒 酵 母 缺 陷 型孢 子 可 以 实 现 蛋 白的 表 面 展 示 通过对 Ｇ Ｐ Ｏ孢子表征， 表明Ｇ Ｐ Ｏ孢 子
酿酒酵母表面展示表达系统及应用
。Ｇ Ｐ Ｉ 锚定区域与细胞蛋白的 Ｃ 端共价相 ?
连， 为蛋白与细胞膜提供稳定的连接。Ｇ Ｐ Ｉ 锚定蛋白的 Ｃ 端包含疏水多肽， 当细胞蛋白被合成， 前体蛋白通过 ? 羧基末端的疏水序列锚定在内质网膜上， 其余蛋白则 位于内质网的内腔中。在极短的时间内， 疏水序列在 Ｐ Ｉ 锚置换， 转酰氨基酶作用下 ω位点裂开并同时被 Ｇ 然后蛋白被运输到高尔基体再通过分泌途径分泌至细 胞膜外。在蛋白水解酶作用下， 分泌信号序列被切除， Ｉ Ｐ Ｌ Ｃ从细胞膜上释放以 Ｇ Ｐ Ｉ 锚定形式与 细胞蛋白被 Ｐ ?
２ ］ 葡聚糖共价相连并被转运至细胞壁外 ［ 。可在许多真 ［ ３ ］ 核生物的质膜蛋白中发现 Ｇ Ｐ Ｉ ， 其结构高度保守。酵
生物活性的复杂蛋白。
１ 酵母细胞表面展示表达系统构成
１ ． １ 载 体 一个成功的表达载体应满足 ４个条件： （ １ ） 具有信 号肽序列， 使已经表达的融合蛋白能够被分泌至细胞 外； （ ２ ） 具有较强的定位结构使融合蛋白固定于细胞表 ３ ） 与外源蛋白融合后， 载体蛋白的定 面而不能脱落； （ 位特性和外源蛋白的生物活性不会改变； （ ４ ） 在宿主菌 株中能稳定存在， 不会被细胞壁膜之间和培养基中的
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ ０ ８ ， ２ ８ （ １ ２ ） ： １ １ ６～ １ ２ ２
酿酒酵母表面展示表达系统及应用
郭 钦１ 张 伟２ 阮 晖１ 何国庆１ （ １浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州 ３ １ ０ ０ ２ ９ ２温州医学院 温州 ３ ２ ５ ０ ３ ５ ）
３ 酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用
酵母菌表面展示操作步骤之表面展示实验设计和结果分析
酵母菌表面展示操作步骤之表面展示实验设计和结果分析酵母菌表面展示是一种常用的技术手段，利用该技术可以将目标蛋白质在酵母菌表面展示出来，实现对蛋白质功能和相互作用的研究。
本文将介绍酵母菌表面展示实验的设计和结果分析步骤。
一、实验设计1. 酵母菌品种选择：根据需要展示的蛋白质类型和所要研究的功能，选择合适的酵母菌品种。
常用的酵母菌品种有Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）和Pichia pastoris（毕赤酵母）。
2. 表达载体选择：根据需求选择合适的表达载体，常用的有pCTCON、pCTCON2、pPICZ和pET等。
需要根据载体的特点进行合理设计，了解载体能否适应目标蛋白质的表达和展示。
3. 构建重组质粒：将目标蛋白质的编码序列克隆到选择的表达载体中。
可以利用PCR、限制性内切酶切割、连接酶反应等方法完成质粒构建。
4. 酵母菌转化：将构建好的重组质粒导入酵母菌中。
常用的转化方法有质粒导入法、电转化法和化学转化法等。
5. 筛选表达阳性克隆：通过选择性培养基或适当的筛选标记，筛选出表达目标蛋白的酵母菌阳性克隆。
二、结果分析1. 表达确证：通过Western blot、ELISA等蛋白质检测方法，对筛选出的阳性克隆进行蛋白质表达确证。
可以使用特异性抗体对目标蛋白质进行特异性检测。
2. 表面展示检测：通过流式细胞术、荧光显微镜观察等方法，对表达阳性的酵母菌进行表面展示检测。
可以利用荧光标记的抗体或成像技术对表面展示的目标蛋白质进行定性和定量分析。
3. 蛋白质功能研究：利用表面展示的酵母菌，进行蛋白质功能研究。
可以通过蛋白质-蛋白质相互作用实验、底物结合实验等方法，研究目标蛋白质在酵母菌表面的功能。
4. 应用研究：根据实验结果，对酵母菌表面展示技术的应用进行评估和探索。
可以进一步研究目标蛋白质在医药、工业生产等领域的应用潜力。
总结：酵母菌表面展示技术是一种功能研究常用的实验手段，通过合理的实验设计和结果分析，可以获得高效的表面展示效果和可靠的实验数据。
酵母表面展示技术及其应用
根据4段重复序列的位置不同,利用Flo1 蛋白C端含有GPI锚定附着信号的区域 , 建立了6个锚定长度不同的GPI展示系统。 根据目的蛋白的特性和展示目的选用锚 定长度不同的GPI展示系统,将目的蛋白 的C端融合到锚定序列上。
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二、酵母展示系统类型
絮凝结构域锚定系统
cell-surface
应用 Application
受体 Receptor
筛选特异配体 、研究抗体结合位点
Protein recognition
抗原 Antigen
未知功能的目的基因产物 Unknown functional
product of target gene 特定病理过程相关蛋白 Protein related to specific pathological process
三、酵母表面展示技术优点
04
a-凝集素系统中外源蛋白通过二硫键与细胞壁相连, 因此可用还原 剂将二硫键打断,使目的蛋白从细胞表面解离，分离纯化方便。
05 对展示在细胞表面的单个克隆的突变特性、酶的活性无需进行蛋 白质的水溶性表达和纯化,可以直接在全细胞基础上测定，活性测 定方便。
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四、酵母表面展示技术应用
α-凝集素 (Agα)系统
α-凝集素由Ag α1基因编码, 仅有1个核心亚基。其C端的320个氨 基酸残基 (富含丝氨酸和苏氨酸的支持区及GPI锚定蛋白附着信号 区 )与细胞壁葡聚糖共价结合,使其锚定在细胞壁上。目的蛋白的C 端与α-凝集素的N端融合,实现目的蛋白的细胞表面展示。
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二、酵母展示系统类型
展示的融合蛋白相对分子质量范围大，分子数量多；研究发现相
02 对分子质量在0.93×106 Da 和136×106 Da之间的分子均可展示 于酵母菌表面,且每个酵母表面可展示104～105 个分子。
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• 其中分别由AGα1、AGa1／AGa2和Flo1表达异源蛋白的 凝集素和絮凝素酵母细胞展示表达系统应用较多。
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凝集素展示表达系统
α凝集素和ａ凝集素是酵母细胞壁上的两种甘露糖 蛋白，它们在酿酒酵母的交配型α（ＭＡＴα ）和 交配型ａ（ＭＡＴａ）单倍体细胞之间介导细胞 与细胞的性粘附，使细胞融合形成双倍体 。
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问题和展望
优点 1、可克隆较大外源蛋白 2、对表达的外源蛋白质进行有效的折叠、糖基化和形成二硫键,并与葡
聚糖共价结合，耐SDS 抽提 3、酵母生产快,容易培养，展示蛋白能稳定地在子代细胞中表达 4、表达的蛋白可用荧光激活细胞分选仪(FACS) 进行灵敏而方便地检测
和筛选 缺点： 1、天然活性不够，表达的蛋白可能不完整 2、表达量也不够,而且酒精往往会抑制生长 3、多拷贝载体不稳定，整合载体则拷贝数低，表达的蛋白量少
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二、两种系统
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酿酒酵母细胞壁主要由外层的甘露糖蛋白和内层的葡
聚糖骨架组成，两者通过通过非共价健与酵母细胞壁松散相连并能被ＳＤＳ 提取出来的低分子量蛋白；
• 一种是必须被葡聚糖酶酶解细胞壁的β-１，3-和β-１，６葡聚糖层后才能被ＳＤＳ抽提的高分子量蛋白，包括凝集 素、絮凝素、Sed1p、Cwp1p、 Cwp 2p和Tip1p、Tir1p 、Srp1p等。后者的结构中大多都含有GPI锚定区域
酿酒酵母表面展示表达系统及应 用
报告人：刘顺
2010.11.10
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主要内容 1 概念
2
两种系统
3 应用
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优缺点
A
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一、概念
酿酒酵母表面展示表达系统： 一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，
即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融 合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制（糖基磷脂酰肌醇，GPI锚定）， 使靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面，之后用葡聚 糖酶抽提细胞壁目的蛋白。
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GPI 系统
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应用
近几年来，酿酒酵母细胞表面展示表达系统迅速发 展并在多个领域获得应用，展现出广阔的发展前景。 1、作为生物催化剂展示表达各种酶蛋白：
淀粉分解酶、纤维素分解酶、脂酶 2、环境治理中展示表达金属蛋白 3、蛋白质分子的相互作用及组合蛋白库的构建 4、可作为生物传感器的荧光蛋白的展示表达 5、免疫学中的应用
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凝集素展示表达系统
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絮凝素展示表达系统
絮凝素Flo1p 是一种新兴的展示系统,它是酿酒酵母细 胞表面类似凝集素的细胞壁蛋白。 • 目前，已经形成了两种类型的絮凝素展示系统 ： • 一是GPI 系统 ；根据目的蛋白的特性和实验目的确定截去 Flo1p 肽段的长度,然后,目的蛋白的C 端融合到锚定序列 上。 • 二是利用Flo1p 的絮凝结构域的黏附能力创建一个表面展 示系统。