酵母表达体系
酵母表达系统
4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策
载体稳定性 基因剂量 整合位点 甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性
1）载体稳定性
同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化：
选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 ，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚
2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。 体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达 毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点 的低
2）分泌表达产物过糖基化
（二） 甲醇酵母表达系统
甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母表达系统的优缺点 甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 甲醇酵母表达系统的应用
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。 毕赤酵母（Pichia pastoris) 汉森酵母（Hansenula ploymorpha) 假丝酵母（Candia boidinii)
组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活 性与药代稳定性均有影响。 *糖链组成
O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸 基团
4、酿酒酵母表达系统的缺陷
1）表达水平普遍不高 A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp） B、所采用的强启动子调控不严谨 C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵
酵母表达(1)
酵母表达引言酵母是一类单细胞真核生物，被广泛应用于生物学研究中。
酵母表达系统是指利用酵母细胞表达外源基因的技术，被广泛应用于蛋白质的高效表达和产量大规模生产。
本文将介绍酵母表达系统的原理、优势和应用。
原理酵母表达系统的核心原理是将外源基因导入酵母细胞，并通过酵母细胞的转录、翻译和修饰机制，使外源基因在酵母细胞中得到表达和功能发挥。
通常情况下，酵母表达系统主要采用酵母菌属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)作为宿主细胞。
1.酵母转录机制：酵母细胞的基因表达主要通过RNA聚合酶Ⅱ进行转录，产生mRNA分子。
2.酵母翻译机制：酵母细胞通过核糖体进行翻译，将mRNA翻译成蛋白质。
3.酵母修饰机制：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等。
优势相比其他常用的表达系统，酵母表达系统具有一系列的优势：1.高效表达能力：酵母表达系统能够实现高水平的外源基因表达，产量可达到克级。
2.翻译后修饰：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，使蛋白质得到正确的糖基化等修饰。
3.生长条件简单：酵母菌生长条件相对简单，可以在常规培养基中进行培养，对培养条件的要求相对较低。
4.可溶性蛋白质表达：酵母细胞具有较强的蛋白质折叠和修饰能力，能够高效地表达可溶性蛋白质。
应用酵母表达系统广泛应用于以下领域：1.蛋白质研究：酵母表达系统可用于大规模蛋白质表达和纯化，为蛋白质的结构、功能和相互作用研究提供了高效的工具。
2.药物筛选：酵母表达系统可用于药物靶点鉴定和药物分子筛选，加速药物研发过程。
3.疫苗研究：酵母表达系统可用于疫苗候选抗原的高效表达和产量大规模生产。
4.代谢工程：酵母表达系统可用于代谢工程领域，利用酵母细胞对外源代谢产物的高效合成能力，实现产生复杂化合物的目标。
5.生物制药：酵母表达系统已经被广泛应用于生物制药领域，用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。
酵母菌的遗传工程和表达系统
酵母菌的遗传工程和表达系统酵母菌是一种常见的单细胞真菌，广泛存在于自然界中。
由于其易于培养、生长速度快、基因组较小、剪接机制类似于哺乳动物细胞等优点，酵母菌成为了功能基因组学、代谢工程学、蛋白质工程学等领域中的重要模型生物。
而酵母菌的遗传工程和表达系统则为这些研究提供了基础和保障。
酵母菌的遗传工程主要包括基因克隆、拷贝数调控、基因敲除、基因组编辑、基因表达调控、代谢通路调控等方面。
其中，基因克隆是构建目的基因载体的重要步骤，一般通过 PCR 扩增或基于荧光报告基因的克隆方法来实现。
而拷贝数调控则指通过操纵载体的拷贝数，达到目的蛋白在酵母细胞中表达量的控制。
酵母菌具有高度重组能力以及泛素降解酶机制，因此基因敲除和基因组编辑等操作在酵母菌中较为容易实现。
基因表达调控则是酵母细胞酿酒业中的重要应用，通过调节转录、翻译后修饰等环节来实现产品的调控。
代谢通路调控则是通过调节酵母菌内一系列代谢酶的表达量或活性来增加特定产物的产量。
酵母菌的表达系统则包括基于质粒的表达和基于基因组的表达两种方式。
质粒表达是将目的基因克隆至质粒中，然后将质粒转化至酵母细胞中，通过调控拷贝数和选择适当的启动子及终止子等措施实现表达。
而基因组表达则是将基因克隆至某一位点上，在酵母菌表达生命周期较长的时期内带来更稳定的表达效果，尤其适用于连续表达大规模生物分子的场合。
同时，可以采用多个方面的策略来处理表达过程中可能出现的问题，从而进一步优化表达效率和表达质量。
例如在 translational initiation 上加入特定元件、利用内质网信号肽将蛋白定向到内质网，从而利用内质网发生的翻译后修饰增加表达质量等等。
总之，酵母菌的遗传工程和表达系统为现代生物技术研究和产业化提供了重要的平台，无论从理论研究还是实践应用的角度来看，都具有广泛的前景和应用价值。
我们期待，基于酵母菌的遗传工程和表达系统将吸引更多的生物学家、遗传学家、代谢工程师、蛋白质化学家等多个领域的专家和研究人员的关注，一起推进这一新兴领域的发展和进步。
酵母表达系统在药物研发中的应用研究
酵母表达系统在药物研发中的应用研究酵母表达系统是一种利用酵母菌将外源基因表达的技术。
它广泛应用于药物研发中，是一种重要的基础研究方法。
下面就来探讨一下酵母表达系统在药物研发中的应用研究。
一、酵母表达系统的基本原理酵母表达系统是利用酿酒酵母菌，将外来基因导入到酵母菌中，使其表达外源蛋白质。
外源基因通常以质粒的形式封装进入酵母细胞中，而通常采用的质粒是pYES2、pESC、pGADT等。
这些质粒都具备不同的特定序列，这些序列可以使酵母表达系统实现不同的功能。
在酵母菌表达外源蛋白的过程中，其主要遵循四个步骤:转录、翻译、修饰和定位。
其中，转录和翻译过程非常类似于真核细胞的情况，最终将形成蛋白质。
但是，由于酿酒酵母是一种真核细胞，因此它的蛋白质修饰和定位过程与真核细胞的过程也非常接近。
二、酵母表达系统在药物研发中的应用1. 基因筛选酵母表达系统是基因筛选的一种常用方法。
基因筛选是通过对外源基因随机插入到酵母细胞中，然后判断是否会导致生长缺陷或特定表型的改变。
这种方法常用于寻找与信号转导、代谢途径和基因调控等过程相关的基因。
2. 蛋白结构研究人类的某些蛋白在体内的折叠会受到转录后修饰的影响，出现拓扑结构的变化会对其功能产生很大影响。
利用酵母表达系统就能够在短时间内对蛋白质结构进行研究。
通过酵母菌表达外源蛋白的方法，可以使加入原蛋白质的一段序列在折叠时进行彻底的探究，便于寻找相应的结构域。
3. 药物筛选在药物研发中，酵母表达系统也常被用于药物筛选。
通过酵母表达外源蛋白的方法，可以筛选出一种或多种能够调控目标蛋白的物质，从而对药物进行优化。
例如，先在酵母菌中表达目标蛋白，在检测其功能后，针对它的活性位点进行筛选最优化的化合物。
这就是所谓的基于蛋白的药物发现。
三、酵母表达系统的优势和局限酵母表达系统在药物研发中有着广泛的应用，这是因为它具有许多优点。
首先，酵母表达系统简单、成本低。
其次，酵母表达系统样品预备时间短，能够快速得到高度纯净的蛋白质。
酵母表达系统在重组蛋白生产中的应用及其技术改进研究
酵母表达系统在重组蛋白生产中的应用及其技术改进研究随着分子生物学的发展，蛋白质工程技术的应用日益广泛。
其中，利用重组DNA技术进行大规模、高效、低成本的蛋白质生产成为当前的热点研究方向之一。
而酵母表达系统作为一种常用的蛋白质表达系统，因其具有高表达水平、易于操作、工程化程度高等优势，在重组蛋白生产中得到了广泛应用。
本文将介绍酵母表达系统在重组蛋白生产中的应用特点及其存在的问题，并探讨了当前研究中所采用的技术改进策略与进展。
一、酵母表达系统在重组蛋白生产中的应用特点酵母表达系统是利用酵母菌作为表达宿主来进行蛋白质表达的一种技术。
目前最常用的酵母表达宿主是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和甜酒酿酵母（Pichia pastoris）。
相较于其他表达系统，酵母表达系统具有以下优点：1. 高表达水平：酵母在自然界中是一种高效生长的微生物，在表达外源蛋白时，其表达水平往往高于细菌表达系统，并可达到与哺乳动物表达系统类似的水平。
2. 易于操作：酵母的培养条件相对简单，易于操作，在表达大量蛋白时，生长速度快，扩大表达规模也比较容易。
3. 工程化程度高：酵母表达系统是一个典型的工程化系统，表达载体普遍存在，常用的宿主菌株也有完整的基因组图谱和表达基因芯片。
4. 合成逻辑清晰：人们对酵母基因及其生理代谢过程的了解更为深入，可以通过改变培养条件来调节蛋白质的表达量和质量。
这些优点使得酵母表达系统在蛋白质表达领域中得到了广泛应用。
例如，利用酵母表达系统可以生产重组抗体、酶类、激素等重要蛋白质。
同时，由于其表达水平高、表达时间短、表达成本低等优势，酵母表达系统也广泛应用于生物医药、食品工业、农业等众多领域。
二、酵母表达系统存在的问题虽然酵母表达系统具有众多优点，但在蛋白质表达过程中，酵母宿主菌也存在以下问题：1. 表达量受限：尽管在酵母表达系统中，重组蛋白的表达水平相对较高，但仍然存在一定的表达量受限性。
酵母表达体系构建
酵母表达体系构建酵母表达体系是一种常用的基因表达系统，可以用于生产重组蛋白质、疫苗、抗体等生物制品。
构建酵母表达体系需要选择合适的酵母菌种、载体、目的基因以及必要的宿主细胞，并通过基因克隆、转化、筛选等一系列步骤实现。
本文将详细介绍酵母表达体系的构建过程。
一、选择酵母菌种和载体1．酵母菌种选择：根据需要表达的蛋白质的种类和性质，选择适合的酵母菌种。
常用的酵母菌种有Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）、Pichia pastoris（毕赤酵母）等。
2．载体选择：载体是携带目的基因进入宿主细胞的必要元件，常用的载体包括质粒、整合型载体和噬菌体载体等。
在构建酵母表达体系时，应根据目的基因的性质和表达量要求选择合适的载体。
二、目的基因的克隆和鉴定1．基因克隆：将目的基因插入到载体中，形成重组DNA分子。
可以通过PCR、基因文库等方法获取目的基因，也可以从基因组或cDNA文库中筛选出目的基因。
2．转化宿主细胞：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，常用的方法包括电穿孔法、转化法等。
3．阳性克隆筛选：通过菌落PCR或 southern 杂交等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。
4．序列分析：对阳性克隆进行序列分析，确保目的基因正确插入载体中，并且没有发生任何突变。
三、构建酵母表达体系1．质粒制备：从阳性克隆中提取重组质粒，并进行纯化和鉴定。
2．转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，常用的方法包括电穿孔法、热激法等。
3．筛选阳性克隆：通过 southern 杂交等方法筛选出含有重组质粒的阳性克隆。
4．鉴定表达产物：对阳性克隆进行蛋白质表达水平检测，常用的方法包括 western 杂交、ELISA等。
同时对表达产物进行生物活性检测，以评估表达产物的质量和功能。
5．优化表达条件：通过对培养条件（如温度、pH值、营养物质浓度等）进行优化，提高目的基因的表达水平和产量。
6．生产与纯化：在优化条件下进行大规模培养和表达，并对表达产物进行纯化和加工，以满足实际应用需求。
基因工程 第七章 酵母基因表达体系(55P)
• 该质粒上共有4个基因：FLP、REP1、 REP2和D．其中FLP基因的编码产物催化 两个IRS序列之间的同源重组，使质粒在A 与B两种形态中转化，REP1、REP2和D基 因均为控制质粒稳定性的反式作用因子编 码基因．上述基因共转录出7种不同分子量 的mRNA分子。
• 2u质粒还含3个顺式作用元件．其中单一的 自主复制子结构(ARS)位于一个IRs的边界 上，REP3(STB)区域是REP1和REP2蛋白 因子的结合位点．对质粒在细胞有丝分裂 时的均匀分配起着重要作用，FRT存在于 两个IRs序列中，大小为50bP，是FLP蛋白 的识别位点。
缺陷在于：
1. 表达效率相对低 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工 修正。
酵母菌的基因工程
酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操
作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe
减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UBI4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变 株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要 低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受 体。 UBA1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性的，但 其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导 的蛋白降解。 Ubc4-ubc5双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。
酵母表达系统在蛋白质工程中的应用
酵母表达系统在蛋白质工程中的应用在现代生物技术领域中，蛋白质工程无疑是一个越来越重要的领域。
蛋白质工程的目的就是为了通过合成、改造、再造蛋白质，让它们发挥更好的作用。
但要想顺利实现这个目标，首先需要一个强大的工具——酵母表达系统。
本文将着重讨论酵母表达系统在蛋白质工程中的应用。
一、酵母表达系统的概述酵母表达系统指的是用酵母作为外源基因表达的宿主系统。
通常我们所使用的酵母表达系统分为两大类：酵母菌株（氨基酸合成型酵母、酵母菌、诺霉菌等）和酵母质粒。
酵母表达系统具有诸多优点：（1）表达效率高，含量可达30%以上；（2）修饰完备，可形成天然蛋白质的完整结构；（3）简单方便，培养条件简单，易于大规模生产。
二、酵母表达系统在蛋白质工程中的应用1. 蛋白质的可合成性: 酵母表达系统不仅适用于表达人类基因，而且还可以表达来自其他生物体的蛋白质基因。
例如，酵母表达系统可以用来合成的大肠杆菌中无法表达的大分子蛋白质，如人源性因子VIII和因子IX。
2. 蛋白质的结构保护: 酵母表达系统在表达可溶性蛋白质时，可以避免因过量表达而引起的蛋白质不正确折叠、表达时段不对，以及蛋白质酶解等问题。
此外，酵母表达系统还可以进行多肽连接和修饰，从而提高蛋白质稳定性和活性。
3. 蛋白质结构改造: 酵母表达系统不仅适用于合成蛋白质，还可以将已知结构的蛋白质进行改造，如改变蛋白质的区域，添加、改变或缩短结构域等，使其得到改进。
例如，可以通过酵母表达系统制备出抗体、酶及酶替代剂等以及多个域之间衔接的蛋白质，这些蛋白质具有与天然蛋白质相同的生物活性，且更加稳定。
4. 蛋白质的特定细胞定位: 酵母表达系统的另一个重要优点在于可以针对性地调控蛋白的表达定位。
例如，可以将表达在酵母中的蛋白转运到特定的亚细胞区域中，从而实现细胞定位和功能分化。
此外，通过改变酵母中的蛋白质结构、质量和量，可以增加细胞发酵性能、生物转化过程和蛋白质反应的有效性。
三、酵母表达系统面临的挑战与以上的优点相对应，酵母表达系统也存在着一些挑战：（1）构建表达载体；（2）寻找适宜的宿主菌株；（3）了解基因调控和宿主代谢途径；（4）选择适合的培养条件等。
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毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。
AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。
毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。
利用含有α因子序列的分泌型载体即可。
翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。
菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts）分泌型载体:pPICZα A,B,and C(5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签)胞内表达型载体：pPICZ A,B,and C，一：分子克隆1.设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C）2.PCR扩增基因PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μlForward Primer（10μM）1μlReverse Primer（10μM）1μldNTP Mixture(各2mM): 4μl5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μlPrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μlddHO up to 50μl2PCR 反应流程预变性98℃ 2min变性98℃ 10sec退火56℃ 10sec 30个循环延伸72℃ 30sec完全延伸72℃ 10min保存4℃3.双酶切及其回收双酶切反应体系（40μl）DNA(空载体或目的基因) 30μlBamHⅠ 1.5μlXholⅠ 1.5μl10×Buffer K 4.0μl4.酶连接首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。
转化到克隆型感受态（DH5α和Top10），使用低盐LB培养基，加入25 μg/mlZeocin，双酶切法鉴定重组质粒后，送测序。
双酶切鉴定体系（10μl）DNA(空载体或目的基因) 6μlBamHⅠ0.5μlXholⅠ0.5μl10×Buffer K 1.0μl二：线性化重组质粒1.提取重组质粒20ml低盐LB培养基(25 μg/ml Zeocin)，提取150ul重组质粒2.重组质粒线性化体系：重组质粒线性化体系（80μl）重组质粒70μlSac1/PmeⅠ2μlBuffer 8μl37℃水浴酶切过夜（约12-24小时）,取0.5-1ul酶切后质粒，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，可冻存在-20℃。
3. 线性化产物的浓缩（若回收的线性化质粒浓度大于100ng/ul,则不需要浓缩，50ml酵母培养液得到200ul感受态细胞，使用10ul线性化质粒+100ul感受态进行电转）(1)65℃，20min灭活限制性内切酶(2)加入等体积（酚：氯仿：异戊醇=25:24:1），振荡均匀，RT，12000rpm，离心1min, 取上清。
(3)加入等体积氯仿，振荡均匀，RT，12000rpm，离心1min, 取上清。
(4)加入0.1倍体积醋酸钠（pH=5.2，3M）,2倍体积预冷无水乙醇，振荡均匀，-80℃，放置30min后，4℃，12000rpm,离心40min.(5)将沉淀用70%乙醇500ul，洗两次，14000rpm,4℃，离心10min,晾干后，加入10ulddH2O溶解即可，-20℃保存。
三：酵母电转化感受态细胞的制备1 活化酵母菌：取出存于-20℃冰箱的GS115无抗YPD平板，挑取单克隆，划线于新的无抗YPD平板上，30℃烘箱培养16h2 挑取酵母单菌落，接种到50ml无抗YPD液体培养基，250rpm，30℃培养15h3 取50μl菌液接种于100ml培养基中，250rpm，培养至OD值在1.2~1.5之间。
4 分装菌液至灭菌的50ml离心管，4℃，3700rpm，离心10min5 弃上清，加50ml预冷至4℃的无菌水，重悬细胞，剧烈震荡200次，4℃，3700rpm，离心1min，重复用无菌水洗一次。
6 弃上清，用2ml 1M山梨醇（1M）清洗沉淀后，加入400ul 1M 山梨醇重悬四：电转化至酵母感受态细胞中1取5µl线性化回收产物，加入至100µl新鲜制备的电转化感受态细胞中，混匀移入干净的1.5ml EP管中（避免气泡出现）。
2取预冷于-20℃的电极杯，放在冰上。
设置电转化参数：电压1200V，时间5ms。
3将重组质粒与感受态细胞混均匀后，加入到电极杯中，等待1-2min(使细胞DNA体系与电极杯能充分接触，利于电转的成功)4立即向电转杯中加入1ml山梨醇，用移液枪充分混匀。
从电转杯中吸出液体，加入到灭菌1.5ml EP管中。
30℃烘箱1h(1-2)复苏5 取出复苏的菌液，4000rpm，离心5分钟, 弃掉800µl上清。
将剩余的300µl 细胞重悬，涂含有25µg/ml Zeocin抗性的YPDS平板上，30℃培养箱避光，倒置培养3天。
五：(可省略直接进行小试)菌落PCR鉴定待YPDS 的Zeocin TM平板上长出单克隆后，挑取单克隆，接种于YPD液体培养基中，加25µg/mlZeocin TM抗生素。
避光培养，转速250rpm，30℃培养16小时。
酵母菌落PCR鉴定体系如下：PCR鉴定反应体系（50μl）菌液0.5μlForward Primer（10μM）1μlReverse Primer（10μM）1μldNTP Mixture(各2mM): 4μl10×Easy Tag buffer（Mg2+ plus）5μlEasy Tag DNA Polymerase 0.5μlO up to 50μlddH2PCR反应程序设定：PCR鉴定反应流程预变性95℃ 5min变性95℃ 60sec退火54℃ 60sec45 个循环延伸72℃ 90sec再延伸72℃ 10min保存4℃1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。
六：小试1.挑取隆菌落，接种到5ml YPD培养基，28-30℃培养过夜，全部转入20-50mlBMGY中，28-30℃培养至OD600=2-6, 4000rpm离心10min，弃上清,将菌体转入50-100ml BMMY中，加入1%甲醇诱导表达。
2.若蛋白小于10kDa，分别12，24h取样，SDS-PAGE检测；一般情况，12，24，36h分别取样，SDS-PAGE检测表达情况七：重组蛋白的表达1、挑取酵母阳性单克隆菌落，接种于5ml YPD中，28-30℃培养过夜。
全部转入100ml BMGY培养基中，加抗生素Zeocin TM至浓度2ul/ml,250rpm，28-30℃摇床培养16-18h。
用紫外分光光度计测OD值为2-6。
2、将培养的酵母菌取出，分装至50ml离心管中，4000rpm， 4℃，离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入20-30ml的BMMY培养基重悬酵母菌。
3、将菌液倒入400ml培养基的2L锥形瓶中，每瓶加入2ml(体积分数为0.5%)的甲醇，250rpm，30℃培养，诱导蛋白表达。
4、每隔24小时，向瓶中加入4ml甲醇诱导（体积分数为1%），诱导96小时左右。
5、收菌：取出培养瓶，4500rpm，离心30分钟，取上清，倒入50ml高速离心管中，14000rpm，离心40min.弃沉淀物，取上清或者破菌，进行纯化配制溶液1.Low Salt LB Medium with Zeocin™10 g Tryptone5 g NaCl5 g Yeast Extract1. Combine the dry reagents above and add deionized, distilled waterto950 ml. Adjust pH to 7.5 with 1N NaOH. Bring the volume up to 1 liter.For plates, add 15 g/L agar before autoclaving.2. Autoclave on liquid cycle at 15 psi and 121°C for 20 minutes.3. Allow the medium to cool to at least 55°C before adding the Zeocin™ to 25 μg/ml final concentration.Store plates at 4°C in the dark. Plates containing Zeocin™ are stable for up to 2 weeks.2. YPD (+ Zeocin™) Yeast Extract Peptone Dextrose Medium (1 liter)1% yeast extract2% peptone2% dextrose (glucose)+ 2% agar+ appropriate concentration of Zeocin™1. Dissolve: 10 g yeast extract 20 g of peptone in 900 ml of water.2. Include 20 g of agar if making YPD slants or plates.3. Autoclave for 20 minutes on liquid cycle.4. Add 100 ml of 20% dextrose (filter-sterilize dextrose before use).5. Cool solution to ~60°C and add the appropriate amount of Zeocin ™ from a 100 mg/ml stock solution.Note: It is necessary to include Zeocin™ in the medium for selection of Pichia transformants only. Zeocin™ may be omitted from the medium when performing expression studies. Store YPD slants or plates containing Zeocin™ at 4°C. The shelf life is one to two weeks.3.YPDS + Zeocin™ AgarYeast Extract Peptone Dextrose Medium with Sorbitol (1 liter)1% yeast extract2% peptone2% dextrose (glucose)1 M sorbitol+ 2% agar+ appropriate concentration of Zeocin™1. Dissolve: 10 g yeast extract 182.2 g sorbitol 20 g of peptone in 900 ml of water.2. Add 20 g of agar.3. Autoclave for 20 minutes on liquid cycle.4. Add 100 ml of 20% dextrose (filter-sterilize dextrose before use).5. Cool solution to ~60°C and add the appropriate amount of Zeocin ™ from a 100 mg/ml stock solution.Note: It is necessary to include Zeocin™ in the medium for selection of Pichia transformants only. Zeocin™ may be omitted from the medium when performing expression studies. Store YPDS slants or plates containing Zeocin™ at 4°C. The shelf life is one to two weeks.4.BMGY and BMMYBuffered Glycerol-complex MediumBuffered Methanol-complex Medium (1 liter)1% yeast extract2% peptone100 mM potassium phosphate, pH 6.01.34% YNB4 × 10-5% biotin1% glycerol or 0.5% methanol1. Dissolve 10 g of yeast extract, 20 g peptone in 700 mL water.2. Autoclave 20 minutes on liquid cycle.3. Cool to room temperature, then add the following and mix well: 100 mL 1 M potassium phosphate buffer, pH 6.0100 mL 10X YNB2 mL 500X B100 mL 10X GY4. For BMMY, add 100 mL 10X M instead of glycerol.5. Store the media at 4°C. The shelf life of this solution is approximately two months.Store Zeocin™at –20°C and thaw on ice before use.。