酵母表达系统步骤
酵母菌的遗传工程和表达系统
酵母菌的遗传工程和表达系统酵母菌是一种常见的单细胞真菌，广泛存在于自然界中。
由于其易于培养、生长速度快、基因组较小、剪接机制类似于哺乳动物细胞等优点，酵母菌成为了功能基因组学、代谢工程学、蛋白质工程学等领域中的重要模型生物。
而酵母菌的遗传工程和表达系统则为这些研究提供了基础和保障。
酵母菌的遗传工程主要包括基因克隆、拷贝数调控、基因敲除、基因组编辑、基因表达调控、代谢通路调控等方面。
其中，基因克隆是构建目的基因载体的重要步骤，一般通过 PCR 扩增或基于荧光报告基因的克隆方法来实现。
而拷贝数调控则指通过操纵载体的拷贝数，达到目的蛋白在酵母细胞中表达量的控制。
酵母菌具有高度重组能力以及泛素降解酶机制，因此基因敲除和基因组编辑等操作在酵母菌中较为容易实现。
基因表达调控则是酵母细胞酿酒业中的重要应用，通过调节转录、翻译后修饰等环节来实现产品的调控。
代谢通路调控则是通过调节酵母菌内一系列代谢酶的表达量或活性来增加特定产物的产量。
酵母菌的表达系统则包括基于质粒的表达和基于基因组的表达两种方式。
质粒表达是将目的基因克隆至质粒中，然后将质粒转化至酵母细胞中，通过调控拷贝数和选择适当的启动子及终止子等措施实现表达。
而基因组表达则是将基因克隆至某一位点上，在酵母菌表达生命周期较长的时期内带来更稳定的表达效果，尤其适用于连续表达大规模生物分子的场合。
同时，可以采用多个方面的策略来处理表达过程中可能出现的问题，从而进一步优化表达效率和表达质量。
例如在 translational initiation 上加入特定元件、利用内质网信号肽将蛋白定向到内质网，从而利用内质网发生的翻译后修饰增加表达质量等等。
总之，酵母菌的遗传工程和表达系统为现代生物技术研究和产业化提供了重要的平台，无论从理论研究还是实践应用的角度来看，都具有广泛的前景和应用价值。
我们期待，基于酵母菌的遗传工程和表达系统将吸引更多的生物学家、遗传学家、代谢工程师、蛋白质化学家等多个领域的专家和研究人员的关注，一起推进这一新兴领域的发展和进步。
S78酵母表达实验步骤
酵母表达实验步骤酵母培养基配方：YPD 培养液：Yeast extract 10 g, Peptone 20 g, Glucose 20g, 溶解于1L ddH2O 中，NaOH 调pH 值为6.5，112℃灭菌20min。
YPD 固体培养基：100 mL YPD 培养液加琼脂粉1.5g。
YSD 培养液：Yeast Nitrogen Base 6.7g, Glucose 20g，Leucine 200 mg，Adenine 100mg，Inositol 200mg，溶解于1L ddH2O 中，NaOH调pH 值为6.5，112℃灭菌20min。
YSD 固体培养基：100 mL YSD 培养液加琼脂粉1.5g。
一、电转化：1．感受态细胞制备：接种酵母S-78单菌落于2ml YPD培养基中，28℃振荡培养过夜。
取100ul 过夜培养液转入50ml YPD中，28℃振荡培养12h（A600为0.7～0.8）。
1500g×5min，4℃离心，收集细胞，用灭菌的预冷双蒸水洗涤2次。
将沉淀细胞重悬于20ml的预冷1mol/L山梨醇中，同前离心后加入1ml预冷1mol/L山梨醇。
此为酵母感受态细胞，备用。
2．电转化取1ul（约1ug）质粒DNA加至80ul感受态细胞，移入0.2cm的电极杯中，置冰浴5min，采用电脉冲转化（1500V，25uF，200Ω），立即加入预冷1mol/L 山梨醇1ml，取200ul涂布在酵母选择培养基（YSD，酵母氮碱6.7g，葡萄糖20g，肌醇200mg，腺嘌呤50mg/L）上置28℃培养1～3d菌落出现。
二、LiAC转化3.2.6.1 酵母感受态细胞的制备①划S-78YPD平板，30℃，培养2-3 天；②挑单克隆于3mLYPD 溶液中，30℃扩大培养12 小时，250 转/min；③以1：25 的比例转入50mL YPD溶液中扩大培养，250 转/min；④测OD600 在0.4 ~ 0.6 之间，停止培养；⑤收集菌液，50mL 离心管（灭菌），4000 转/min 离心5min；⑥细胞合并悬于20mL 灭菌ddH2O 中，4000 转/min 离心5min；⑦倒去上清，细胞悬浮于1.5mL 混合溶液中（10×TE，1M LiAC，ddH2O，以1:1:8 的体积比混合）3.2.6.2 质粒的转化A. HWTX-XI 或突变体质粒DNA 1.0 μg；B．carrierDNA 10μg；(carrier DNA鱼精DNA)C. 上述菌悬液20μL；D. PEG 溶液（10×TE，1M LiAC，50%PEG4000，以1:1:8 的体积比混合) 1.5mL；①混合，30℃，200 转/min，培养30min；②42℃热击15min 后，5000 转/min 离心5min；③弃上清，细胞沉淀用200μL 1×TE 洗涤，5000 转/min 离心5min；④弃上清，细胞沉淀悬浮于200μL 1×TE 溶液中；⑤细胞悬浮液涂YSD 板，30℃培养4-6 天；3.2.6.3 蛋白的表达挑取YSD 板上直径为0.5 ~ 1mm 菌斑于3mLYSD 溶液中扩大培养12h, 然后以1:25 的比例转入50mL YSD 溶液中，30℃，250转/min 培养12 小时；最后以1:25 的比例转入1 L YPD 溶液中，30℃，250 转/min 扩大培养3-4 天。
酵母表达系统与方法
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酵母表达系统的产生
基因工程技术的发展为用微生物合成和生产外源蛋 白展示出广阔的前景。长期以来，人们用大肠杆菌作为 宿主表达了多种蛋白。这是因为大肠杆菌具有若干优点， 如：遗传背景和生化特性清楚、容易操作、生长迅速、 营养需求简单等。
但大肠杆菌表达系统存在若干缺陷：A：缺少真核 生物的蛋白翻译后修饰和加工，杂的复性才能恢复构象和活性；C：背景杂蛋白 很多、纯化起来麻烦；D：表达量一般不是很高。
◆裂殖酵母表达系统
Schizo saccharomyces pombe （粟酒裂殖糖酵母） 5
不同酵母表达系统的特点
◆ 酿酒酵母表达系统
表达载体：自主复制型和整合型 筛选标记: LEU2、URA3 启动子： PGK1、 PHO5、CUP1
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成功表达的外源蛋白实例：
人重组干扰素
酿酒酵母表达系统的主要不足：
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成功表达的外源蛋白实例：
人血清蛋白和白细胞介素1β
乳酸克鲁维亚酵母表达系统的独特优点：
可以高密度发酵； 不需要甲醇防爆装置； 工业化生产时不降低生产率及酵母菌的再繁殖能力。
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◆甲醇营养型酵母表达系统
甲醇作为唯一的能源和炭源
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表达载体：整合体型载体
（Invitrogene公司已开发出多种巴氏毕赤酵母表达载体 如：pPIC9, pHIL-D2, pHIL-S1,pPICZA, pPICZB, pPICZC系列和 pPICZaA, pPICZaB, pPICZa系列适 合于胞内和分泌的表达载体）
产生量（g/L） 2.3 0.8 2.5 1.0 1.7 12.0 3.0 1.3 10.0 4.0
文献 [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13]
酵母表达体系构建
酵母表达体系构建酵母表达体系是一种常用的基因表达系统，可以用于生产重组蛋白质、疫苗、抗体等生物制品。
构建酵母表达体系需要选择合适的酵母菌种、载体、目的基因以及必要的宿主细胞，并通过基因克隆、转化、筛选等一系列步骤实现。
本文将详细介绍酵母表达体系的构建过程。
一、选择酵母菌种和载体1．酵母菌种选择：根据需要表达的蛋白质的种类和性质，选择适合的酵母菌种。
常用的酵母菌种有Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）、Pichia pastoris（毕赤酵母）等。
2．载体选择：载体是携带目的基因进入宿主细胞的必要元件，常用的载体包括质粒、整合型载体和噬菌体载体等。
在构建酵母表达体系时，应根据目的基因的性质和表达量要求选择合适的载体。
二、目的基因的克隆和鉴定1．基因克隆：将目的基因插入到载体中，形成重组DNA分子。
可以通过PCR、基因文库等方法获取目的基因，也可以从基因组或cDNA文库中筛选出目的基因。
2．转化宿主细胞：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，常用的方法包括电穿孔法、转化法等。
3．阳性克隆筛选：通过菌落PCR或 southern 杂交等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。
4．序列分析：对阳性克隆进行序列分析，确保目的基因正确插入载体中，并且没有发生任何突变。
三、构建酵母表达体系1．质粒制备：从阳性克隆中提取重组质粒，并进行纯化和鉴定。
2．转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，常用的方法包括电穿孔法、热激法等。
3．筛选阳性克隆：通过 southern 杂交等方法筛选出含有重组质粒的阳性克隆。
4．鉴定表达产物：对阳性克隆进行蛋白质表达水平检测，常用的方法包括 western 杂交、ELISA等。
同时对表达产物进行生物活性检测，以评估表达产物的质量和功能。
5．优化表达条件：通过对培养条件（如温度、pH值、营养物质浓度等）进行优化，提高目的基因的表达水平和产量。
6．生产与纯化：在优化条件下进行大规模培养和表达，并对表达产物进行纯化和加工，以满足实际应用需求。
酵母表达体系
毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶.而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子.毕赤酵母含有两种醇氧化物酶,AOX1 AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。
AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多,通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。
毕赤酵母表达外源蛋白:分泌型和胞内表达.利用含有α因子序列的分泌型载体即可.翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N—连接糖基化高甘露糖型,毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度(平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基)短得多。
菌株：GS115 （ Mut+， Muts)和 KM71（Muts）分泌型载体：pPICZα A，B,and C（5’AOX1启动子，紧密型调节,甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签)胞内表达型载体:pPICZ A，B，and C,一：分子克隆1。
设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B，p15—pPICZ C）2.PCR扩增基因PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μlForward Primer(10μM）1μlReverse Primer（10μM）1μldNTP Mixture（各2mM): 4μl5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μlPrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μlO up to 50μlddH2PCR 反应流程预变性98℃ 2min变性98℃ 10sec退火56℃ 10sec 30个循环延伸72℃ 30sec完全延伸72℃ 10min保存4℃3。
酵母菌表面展示的酵母细胞的培养与表达步骤
酵母菌表面展示的酵母细胞的培养与表达步骤酵母菌表面展示技术是一种重要的生物工程技术，可以通过将目标蛋白质或多肽序列表面展示在酵母菌细胞表面，从而实现蛋白质的高效表达和展示。
本文将介绍酵母菌表面展示的酵母细胞的培养和表达步骤。
1.准备培养基首先，准备含有所需营养物质的培养基。
常用的培养基包括YPD培养基（酵母粉蛋白质培养基）、SD培养基（合成蛋白质培养基）和SC培养基（选择性培养基）。
根据实验需要选择合适的培养基，并按照相关文献或方法指南进行配置。
2.酵母细胞传代培养将酵母细胞的初始培养物接种到含有适当培养基的无菌试管或烧瓶中。
根据实验需要，可以选择不同规模的培养容器，如试管、烧瓶或发酵罐。
在适当的温度下，用摇床或震荡培养器进行培养，保持适当的培养条件（如温度、pH值和氧气供应），直至菌液达到合适的菌密度。
3.感应表达载体将要表达的目标蛋白质或多肽序列插入相应的表达载体中，并将这些载体转化到酵母细胞中。
常用的表达载体包括pYD1和pYD2。
将重组载体和酵母细胞一同处理，使其进行感应表达。
4.酵母菌表达培养接种已感应表达的转化菌落到含有选择性培养基的培养容器中。
根据实验需要，可以选择添加相应的抗生素进行筛选。
将菌液继续在适当的培养条件下培养，并监测菌液的生长情况。
5.表达蛋白质的定量和纯化通过Western blot、ELISA等技术验证目标蛋白质或多肽序列的表达情况，并定量蛋白质的表达水平。
根据实验需要，可以采用亲和层析、离心和蛋白质纯化技术对表达的蛋白质进行纯化。
6.酵母菌表面展示将纯化的蛋白质重新悬浮于含有适当培养基的培养液中，并与酵母细胞进行共培养。
通过培养时的适当处理（如温度的改变、pH值的调整、特定培养基成分的添加等），使表达的蛋白质或多肽序列能够准确地定位和展示在酵母细胞表面。
7.酵母菌表面展示的验证通过免疫荧光、流式细胞术和酵母菌表面结构的特异性分析等方法，检测和验证酵母菌表面展示的效果。
酵母表达系统
酵母表达系统基因表达是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术制备各种目的基因的重组蛋白质，在分析基因的表达与调控、基因的结构与功能、基因治疗以及生物制药等领域均取得了令人振奋的成果。
其中，酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。
1、酵母表达系统的特点酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。
酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。
某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。
应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。
解决内部降解的方法有三：一是在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用；二是将培养基的pH值调成酸性(酵母可在pH3.0~8.0的范围内生长)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。
另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。
因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。
2、常用酵母表达系统(宿主-载体系统)（1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。
因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。
酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。
酵母表达系统-PPT课件
2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。
体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达
高拷贝整合元件： A、高度重复序列：rDNA 提供多个整合位点 B、缺陷型标记基因：Leu2d
提高选择压力
C、抗性标记；neo 提高选择压力
甲醇酵母系统胞内表达载体
需要带入ATG
表达载体类型
单位点
甲醇酵母系统胞内表达载体
需要带入ATG
多位点
表达载体类型
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：PHO1
甲醇酵母系统分泌表达载体
KM71:His+Muts
3’His4
3） 多基因插入事件（串联整合）
宿主株:GS115、KM71
可插入位点： 5’AOX1
3’AOX1
TT
转化子： GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts
4） 基因取代（GS115，AOX1+）
转化子：His4+Muts
汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体
信号肽：MFα
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：MFα 标记：Kan
4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策
载体稳定性 基因剂量
整合位点
甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性
1）载体稳定性
同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化： 选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 ，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚
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毕赤酵母表达系统步骤
（参考Invitrogen公司说明书）：
一、pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存
1取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。
2挑取转化子，甘油保存。
二、载体构建
1将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。
2提质粒酶切鉴定或PCR鉴定
3载体测序
测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物
三、线性化DNA
1提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒）
2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI
3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全；
4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）；
四、线性化DNA的去磷酸化处理
线性化质粒43μl
CIAP Buffer 5μl
CIAP酶2μl
四、总体积为50μl的样品37℃ 1h，过柱纯化，用30μl ddH2O洗脱；
五、感受态细胞的制备
实验前准备：无抗性YPD平板一个、无抗生素液体YPD培养基，100μg/ml Zeocin YPD 平板和液体、50ml离心管两个、500ml预冷的无菌水、20ml 1M 山梨醇（灭菌预冷的），0.2cm预冷的电击杯；
1YPD平板划线培养菌，30℃培养2-3d；
250ml三角瓶中，加入5ml YPD，挑取酵母单菌落，30℃培养过夜；3吸取0.5ml菌液，加入至含有200ml新鲜YPD的1L三角瓶中，30℃，225rpm/min培养至OD值1.3-1.5；
41500g，4℃离心5min收集菌体；
540ml冰预冷的无菌水重悬沉淀；
61500g，4℃,5min；
730ml无菌水重悬；
81500g，4℃,5min；
910ml 1M 山梨醇重悬；
101500g，4℃,5min；
11加入1ml山梨醇，重悬冰上放置，直接做转化，或加入灭菌甘油每管80ul分装，冻存于-80℃(长时间保存会影响转化效率)；
六、电击转化
15-10μg线性化DNA（20μl<）与80ul上述感受态细胞混合，转移
至预冷的0.2cm电击杯中（点击条件：电压1.5kV；电容25µF；
电阻200Ω，电击时间为4～10msec）；
2冰上放置5min
3电击（按生产厂商提供的适合酵母用的参数）
4迅速加入1ml预冷的1M 山梨醇，转移至1.5ml EP管中
530℃静置培养1-2h
（如果要增加存活率，获得更多的转化克隆，可在30℃静置培养1h后，加入1mlYPD培养基，30℃200rpm培养1h后取部分涂布与不同浓度抗生素的平板）
6取50、100、200ul分别涂布于含有Zeocin的YPD平板，30℃培养2-10 d至有菌落出现；
7如果要筛选多拷贝转化子，将转化克隆混合在一起，涂布在Zeocin 浓度为500、1000、2000μg/ml的YPD平板，培养2-3d。
七、筛选鉴定
1菌液PCR鉴定
（1）英俊Invitrogen说明书方法：取10ul菌液在1.5ml离心管中，加入5μul溶菌酶，30℃10min，将产物转移至-80℃30min，
或者浸入液氮1min，取2-5ul直接做PCR检测。
（2）煮沸冻融法：1ml菌液12000rpm离心2min，收集菌体，500μl PBS重悬两次，100μl无菌水溶解，沸水浴10min，-80℃冷
冻10min，再沸水浴10min后立即涡旋震荡1min，12000rpm
离心2min取上清做PCR。
（3）P CR检测（pPICZα载体）：
X-33和GS115扩增大小2.2kb加目的片段，KM71是3.6kb
加目的片段
引物片段大小
5’AOX/3’AOX： 2.2kb加上目的片段大小
α-Factor/3’AOX： 2.3kb加上目的基因大小
2酵母基因组DNA提取
（1）取1.5ml菌液4000rpm 离心5min收集菌体
（2）沉淀用无菌水洗一次，4000rpm 5min
（3）1M山梨醇重悬，加入5ul溶菌酶，30℃温浴30min
（4）加入100ul 2% SDS，-20℃冻融震荡3次
（5）加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混匀，离心取上清（6）加入0.1倍体积3mol/L醋酸钠和2倍体积无水乙醇，-20℃静置30min
（7）离心弃上清，75%乙醇洗涤，晾干后溶于20ul无菌水中，-20℃冻存。
八、鉴定正确的重组菌株甘油保存。
Law Salt LB培养基液体pH7.5
1L 350ml液体150ml固体蛋白胨：10g 3.5g 1.5g
酵母提取物：5g 1.75g 0.75g NaCl：5g 1.75g 0.75g 琼脂粉：15g 2.25g Zeocin：25ug/ml
4℃避光保存两周
YPD
1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖、2% 琼脂、100ug/ml Zeocin 1L配置
酵母提取物：10g
蛋白胨：20g
琼脂：20g
高压灭菌后，加入100ml 20%的葡萄糖（过滤灭菌），冷却至60℃后加入Zeocin。
YPDS
1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖、1M山梨醇、2% 琼脂适当浓度Zeocin（根据菌株不同选择）
1L配置
酵母提取物：10g
山梨醇：182.2g
蛋白胨：20g
琼脂：20g
高压灭菌后，加入100ml 20%的葡萄糖（过滤灭菌），冷却至60℃后加入Zeocin。