2020年毕赤酵母表达系统资料整理
毕赤酵母表达手册
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
毕赤酵母分泌表达报告
实验报告毕赤酵母分泌表达报告订单号：«订单号»客户：«客__户»日期：«日__期»目录1 材料与方法 (1)1.1 菌株的保存与培养 (1)1.2 载体构建 (1)1.3 质粒电转毕赤酵母 (1)1.4 转化子筛选 (2)1.5 转化子表达小试 (4)1.6 最优转化子扩大表达 (6)1.7 蛋白鉴定与纯化 (7)2 结果与分析 (9)2.1 转化子筛选 (9)2.2 转化子表达小试 (9)2.3 最优转化子扩大表达 (10)2.4 蛋白纯化与浓度测定 (10)1．材料与方法1.1 菌株的保存与培养大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株TOP10于LB培养液摇菌后保存成20%的甘油菌于-80℃冷冻保存。
大肠杆菌于37℃培养箱中培养。
毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株X-33于YPD培养液摇菌后保存成25%的甘油菌于-80℃冷冻保存。
毕赤酵母于28℃培养箱中培养。
1.2 载体构建1）目的基因信号肽预测，采用SignalP 4.0和5.1预测，去除信号肽序列；2）根据毕赤酵母表达系统进行密码子优化，避开SacI酶切位点；3）基因合成至pPICZαA，目的基因紧挨着载体α-factor，C端带上6×His。
1.3 质粒电转毕赤酵母1.3.1 目的载体线性化1）按下表配制载体酶切体系：组分体积（ul）质粒（5-10 ug）6 ug10×buffer 5SacI 1 ulddH2O 补到502）37℃酶切过夜；3）琼脂糖凝胶电泳检测，以未酶切的质粒作为对照；4）检测酶切成功后，65℃ 20 min灭活。
1.3.2 线性化载体纯化回收1）按下表配置载体纯化体系：组分体积（ul）酶切产物50核酸助沉剂103 M NaAc，pH=5.2 6无水乙醇1652）-20℃静置35 min以上；3）4℃ 12000 rpm离心15 min，弃上清，此时可以观察到壁上有白色沉淀；4）加入400 ul预冷的80%乙醇重悬沉淀；5）4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清，开盖干燥；6）加入10 ul ddH2O溶解沉淀。
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。
整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。
在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。
为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。
表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。
有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。
一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。
携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。
甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。
对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。
因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。
在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。
这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。
如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。
毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用
写一篇毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用的报
告，800字
毕赤酵母表达系统是一种高效、灵活的工具，可用于外源蛋白表达研究和应用。
它是一种重要的生物工程技术，可以实现外来基因的大规模表达，分子量可达到200 KD 以上。
目前，毕
赤酵母表达系统已成功地用于各类重要蛋白质的表达，并发挥了重要作用。
毕赤酵母表达系统的优势在于它能够表达复杂的蛋白质，而且不受细胞因子的限制，能够有效提高蛋白表达的效率。
此外，该系统还具有良好的原核性、容易稳定表达、灵活的改造等特点。
因此，毕赤酵母表达系统被广泛应用于外源蛋白表达和重组蛋白的研究中。
例如，已成功利用该系统彻底破解人工合成水稻Hsp70基因编码蛋白的结构，它同时也是人类在蛋白研
究中的有力工具。
毕赤酵母表达系统在医学研究中也得到了很大的发展。
比如，可以用毕赤酵母表达系统来研究和表达病毒血管瘤病毒(HPV)-695E5蛋白，而这种蛋白可能会加速病毒复制和细胞侵入，因
此有助于治疗HPV相关的癌症。
利用毕赤酵母表达系统还可
以大规模表达多肽，如α-肌动蛋白及其相关蛋白，从而探索
肌钙蛋白的生物学功能。
总的来说，毕赤酵母表达系统是一种重要的生物工程技术，它能够实现外来基因的大规模表达，受益于它的灵活性和稳定性，可以成功用于外源蛋白表达及其相关研究与应用中，是一项具有重大意义的研究。
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
毕赤酵母表达系统资料整理
毕赤酵母表达零碎之相礼和热创作Mut+和Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产品，甲醇可紧密调理、诱导AOX1基因的高程度表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上.AOX1基因调控分两步：抑制/往抑制机制加诱导机制.简单来说，在含葡萄糖的培育基中，即便加入诱导物甲醇转录仍受抑制.为此，用甲醇进行优化诱导时，引荐在甘油培育基中培育.留意即便在甘油中生长(往抑制)时，仍缺乏以使AOX1基因达到最低程度的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达程度所必须的.AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达.AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，经过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株.在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培育基中，不管是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的工夫大约为2h.Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的状况下生长速率是一样的，存在甲醇的状况下，Mut+在对数期增殖一倍的工夫大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的工夫大约为18个小时.菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或构成正确的折叠结构.GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有渐变，是组氨酸缺陷型，假如表达载体上携带有组氨酸基因，可抵偿宿主菌的组氨酸缺陷，因而可以在不含组氨酸的培育基上挑选转化子.这些受体菌自发渐变成组氨酸野生型的概率一样平常低于10-8.GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培育基上鉴定表型.SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生渐变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用.其中X-33由于是野生型，因而耐受性比较好，假如担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表示型，也就是说可以在含甲醇的培育基中快速生长，但是听说会对外源基因表达有影响，KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有渐变，在不含精氨酸的培育基中不克不及生长.用野生型ARG4基因(约2kb)拔出到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离发生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析表现野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代，以是KM71全部转化子都是Muts表型.AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构经过基因取代方法更换aox1::ARG4结构，这样重组菌株的表型是His+MutsArg-，这意味偏重组菌株生长时需精氨酸.但仅添加精氨酸其实不克不及完全缓和arg4渐变的影响，arg4菌株在含精氨酸的最小培育基中不克不及很好地生长.因而不引荐在KM71中经过取代aox1::ARG4结构来获得His＋转化子.一样平常来说，假如是胞内表达，应尽量用Muts细胞，这样得到的蛋白产品中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量绝对较多，使卑鄙纯化更易进行.而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢(Muts)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可运用.基因重组Pichia.pastoris酵母菌体内无自然质粒，以是表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以完成外源基因的表达，包含启动子、外源基因克隆位点、停止序列、挑选标识表记标帜等.细菌内同源重组被以为是重组质粒构建过程的难点，由于未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，以是重组转移载体必须用特定的限定性内切酶进行线性化处理.这种处理的目的是防止随机拔出重组时质粒在功能区断开，形成目的基因表达失活，让同源重组以指定的方式发生.表达载体次要分为以下几类：(1)胞内表达载体次要有pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)等.该类载体可以将目的基因表达在胞内，可以防止毕赤酵母的糖基化，次要得当于那些不克不及被糖基化相关基因的表达；(2)分泌型表达载体次要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P等.由于毕赤酵母本人的泌内源蛋白非常少，将外源蛋白分泌到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及积存.经常运用的分泌的信号序列次要是由89个氨基酸组成的α交配因子(α-factor)的引导；(3)多拷贝拔出表达载体如pPIC9K，pPIC3.5K.在某些状况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可添加所需蛋白的表达量.该载体均可用于在体内(pPIC3.5K, pPIC9K)或体外(pAO815)发生并分离多拷贝拔出，同时可检测添加重组基因的拷贝数能否添加蛋白表达量.体内整合可经过高遗传霉素抗性挑选可能的多拷贝拔出，而体外整合可经过连接发生外源基因的串联拔出.在GS115中挑选His+Mut+转化子：用SalI或StuI线性化质粒转化GS115后，大多在His4位点上发生重组，大多数转化子是Mut+表型；但是由于质粒含有AOX1基因序列，有可能在AOX1位点发生重组，毁坏野生型AOX1基因，发生His+Muts转化子，则必要在MD及MM平板上检测可证明His+ Mut+转化子.毕赤酵母表达经常运用培育基10×YNB(13.4%的无氨基酸酵母氮源)，134gYNB固体溶于1L蒸馏水，过滤灭菌，4℃保管.YPD完全培育基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L(固体培育基含1.5%琼脂).转化培育基RDB：每100mL加入山梨醇18g(186 g/L)，琼脂糖2g(20g/L)121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)，100×AA 1mL.混匀，倒平板(灭菌时只加入80ml水即可).选择培育基MD(最小葡萄糖)：配100mL，向80mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L)121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L).选择培育基MM(最小甲醇)：配100mL，向90mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L)121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)，0.5mL甲醇(0.5%).诱导表达培育基BMGY：配1L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甘油10mL.诱导表达培育基BMMY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20 g/L，3g/LK2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至895mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃当前在超净台上加入100×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL.BMGY/BMMY含酵母浸出物及蛋白胨，可波动分泌蛋白，制止或减少分泌蛋白的分解.假如目的蛋白对中性PH蛋白酶敏感的话，可在无缓冲培育基(MGY、MM)中表达.假如没有证据证明你的分泌蛋白对中性PH值蛋白酶敏感，建议开始表达时用BMMY.假如表达蛋白降解了，测验考试在无缓冲培育基中进行表达.假如以上条件仍不克不及无效防止蛋白降解，可将基因转入SMD1168中，该菌株表型是his4pep4，缺失了蛋白酶，转化与表达程序与GS115相反，也可用于大规模发酵.用考马斯亮蓝G-250测蛋白含量。
毕赤酵母表达知识归纳
毕赤酵母表达知识归纳1a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。
说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。
Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。
然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。
该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。
都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。
invitrogen手册上可以灭菌的。
毕赤酵母常用表达载体
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
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作者：非成败
作品编号：92032155GZ5702241547853215475102
时间：2020.12.13
毕赤酵母表达系统
Mut+和Muts
毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。
简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。
为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。
注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。
AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。
在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。
Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。
菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别
GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。
GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。
这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。
GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。
SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生突变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。
其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响，
KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。
用野生型ARG4基因(约2kb)插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离产生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代，所以KM71所有转化子都是Muts 表型。
AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换
aox1::ARG4结构，这样重组菌株的表型是His+MutsArg-，这意味着重组菌株生长时需精氨酸。
但仅添加精氨酸并不能完全缓和arg4突变的影响，arg4菌株在含精氨酸的最小培养基中不能很好地生长。
因此不推荐在KM71中通过取代aox1::ARG4结构来获得His＋转化子。
一般来说，如果是胞内表达，应尽量用Muts细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多，使下游纯化更易进行。
而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢(Muts)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可应用。
基因重组
Pichia. pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达，包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。
细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程的难点，因为未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，所以重组转移载体必须用特定的限制性内切酶进行线性化处理。
这种处理的目的是防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活，让同源重组以指定的方式发生。
表达载体主要分为以下几类：(1)胞内表达载体主要有pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)等。
该类载体可以将目的基因表达在胞内，可以避免毕赤酵母的糖基化，主要适合于那些不能被糖基化相关基因的表达；(2)分泌型表达载体主要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P等。
由于毕赤酵母本身的泌内源蛋白非常少，将外源蛋白分泌到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及积累。
常用的分泌的信号序列主要是由89个氨基酸组成的α交配因子(α-factor)的引导；(3)多拷贝插入表达载体如pPIC9K，pPIC3.5K。
在某些情况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需蛋白的表达量。
该载体均可用于在体内(pPIC3.5K, pPIC9K)或体外(pAO815)产生并分离多拷贝插入，同时可检测增加重组基因的拷贝数是否增加蛋白表达量。
体内整合可通过高遗传霉素抗性筛选可能的多拷贝插入，而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
在GS115中筛选His+Mut+转化子：用SalI或StuI线性化质粒转化GS115后，大多在His4位点上发生重组，大多数转化子是Mut+表型；然而由于质粒含有AOX1基因序列，有可能在AOX1位点发生重组，破坏野生型AOX1基因，产生His+Muts转化子，则需要在MD及MM平板上检测可证实His+ Mut+转化子。
毕赤酵母表达常用培养基
10×YNB (13.4%的无氨基酸酵母氮源)，134 g YNB固体溶于1L蒸馏水，过滤灭菌，4℃保存。
YPD完全培养基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L(固体培养基含1.5%琼脂)。
转化培养基RDB：每100mL加入山梨醇18 g (186 g/L)，琼脂糖2g (20g/L) 121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)，100×AA 1mL。
混匀，倒平板(灭菌时只加入80ml水即可)。
选择培养基MD(最小葡萄糖)：配100mL，向80mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L)121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)。
选择培养基MM(最小甲醇)：配100mL，向90mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L) 121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)，0.5mL甲醇(0.5%)。
诱导表达培养基BMGY：配1L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甘油10mL。
诱导表达培养基BMMY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至895mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃以后在超净台上加入100×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL。
BMGY/BMMY含酵母浸出物及蛋白胨，可稳定分泌蛋白，阻止或减少分泌蛋白的分解。
如果目的蛋白对中性PH蛋白酶敏感的话，可在无缓冲培养基(MGY、MM)中表达。
如果没有证据证明你的分泌蛋白对中性PH值蛋白酶敏感，建议开始表达时用BMMY。
如果表达蛋白降解了，尝试在无缓冲培养基中进行表达。
如果以上条件仍不能有效防止蛋白降解，可将基因转入SMD1168中，该菌株表型是his4pep4，缺失了蛋白酶，转化与表达程序与GS115相同，也可用于大规模发酵。
用考马斯亮蓝G-250测蛋白含量
作者：非成败
作品编号：92032155GZ5702241547853215475102
时间：2020.12.13。