毕赤酵母表达系统研究进展
改良毕赤酵母分泌表达外源蛋白能力的研究进展
象， 并对不 正 确 折 叠 构 象 蛋 白 进 行 严 格 筛 选 的 主
1
主要的内质网驻留蛋白及其折叠加 工外源蛋白的分子机制
内质网腔是将分泌表达蛋白折叠成天然构
要场 所
［11］
。 内 质 网 驻 留 蛋 白 包 括 3 类 ：折 叠 酶 、 分
子伴侣和凝集素伴侣。几种主要 的 内 质 网 驻 留 蛋 白对多肽 /蛋 白 质 的 折 叠 加 工 分 子 机 制 如 图 1 所 示。
and facilitate the folding progress by consuming ATP ； Foldase PDI further accelerates the protein folding process by formation of correct disulfide bonds mediated in a cycle of Pdi and Ero1 ； Nascent glycoproteins are bound by calnexin and mediated to correct folding and processing of the N － glycans． Correctly folded and processed proteins are released to transport vesicles ，while failed folding leads to binding by the BiP complex and targeting to ERAD．
bip参与内质网功能的而共表达bip的同时再共表达辅分子伴侣能够更pdi基因pdi似乎与新合成的scfv在折叠过程的不同阶段相互作用推测bip主要辅助未折叠或部分折叠scfv转运和保持折叠状态而pdi通过它的二硫键催化或异构化活性促进scfv的折叠23共表达pdi可能对富含半胱氨酸外源蛋白的分泌表达有胱氨酸的美洲板口线虫necatoramericanus分泌性蛋白naasp1时发现共表达pdi可以有效提多拷贝菌株分泌表达该蛋白能力
巴斯德毕赤酵母表达系统研究系统进展
➢翻译后修饰
毕赤酵母糖蛋白因与哺乳动物糖蛋白糖链结构的差 异而具有潜在的抗原性，使其在医药工业上的应用受到 一定的制约。它们在哺乳动物体内可被免疫系统清除而 失去效能，而且有引起超敏反应的危险性。
解决糖基化策略：
①尝试胞内表达，避免目的蛋白的糖基化；
②对非活性中心的糖基化位点进行突变改造，清除糖基 化；
稀有密码子制约翻译速率
此时需要进行全基因的合成，使编码序列 符合毕赤酵母密码子的偏爱性和具有更高的
➢基因剂量
相对剂量效应
一般情况下，随着整合拷贝数的增加，表达量也会增加， 例如，1-8整合拷贝数范围内，HBsAg表达量成比例升高。 但也有例外，如小牛溶菌酶的表达随着拷贝数从1-3的上 升反而减少，这可能与mRNA翻译、蛋白折叠效率有关。
重组子在酵母细胞中的命运
导入毕赤酵母的重组质粒能通过同源重组整合到 染色体上，不同的整合方式可产生不同表型的转化子：
（1）同源双交换：表达载体线性化后，两端分别为5’AOX1和 3’AOX1序列，与基因组的同源序列发生双交换后，导致毕赤 酵母基因组内AOX1编码区被表达单元所替换，胞内醇氧化酶 只能来自AOX2基因，酶活性大大降低。因此转化子表现为甲 醇利用缓慢，表型为Muts。
若整合发生在his4位点处，可能出现表达单 元丢失现象，这可能是由于基因组中突变的his4与表 达单元中的his4基因之间发生了基因转换（gene conversion）所致，所以一般选择AOX1位点整合。
his4
用于转化子筛选的基因标记
用于毕赤酵母转化子筛选的基因标记主要有营养 缺陷型互补基因和显性基因：
二、巴斯德毕赤酵母简介
Pichia pastoris
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能 够在低 廉的甲醇培养基中生长，甲醇能高效 诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达， 因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属 强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵 母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵 母没有合适的自主复制型载体，所以外源基 因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA 上，因此能够稳定遗传。目前已有500多种 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功 表达。
毕赤酵母表达外源蛋白糖基化研究进展
毕赤酵母表达外源蛋白糖基化研究进展杨婕【摘要】Pichia pastoris as the host for the expression of recombinant proteins, has not only the advantages of prokaryotic expression system such as inexpensive in culture, ease of genetical manipulation, high levelsof protein expression, but also has post-translational protein processing capabilities like other higher eukaryotes such as protein folding, formation of disulfide bond and glycosylation. Gly-cosylation is an important form of posttranslational modification in secreted proteins and affects the structure and function of these pro-teins. In this review, we discuss protein glycosylation and humanized glycosylation engineering in Pichia pastoris.%毕赤酵母作为表达外源蛋白的宿主，不仅具有原核生物表达系统的优点，如培养成本低、遗传操作简单、表达效率高等，还可以对表达的外源蛋白进行翻译后修饰加工，如蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化等，因而有其独特的优势。
在分泌蛋白修饰中，糖基化是一种重要修饰方式，影响蛋白的结构与功能。
毕赤酵母表达研究进展
利用强效可调控启动子AOX，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因1工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］11. 彭毅，杨希才，康良仪。
影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。
生物技术通报2000，4：33-3612. 11 3 Cregg JM . Tschopp JF Stillman C, et al .High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast pichia.pastoris Bio/Technology,1987,5:479-48513. Sreekrishma K , Nelles L ，Potenz R，et al .High-level expression ,purification ,and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized and characterization in the methylotrophic yeast pichia .pastoris ,Biochemistry ,1989,28:4117-412514. Siegel RS , Buckholz RG, Thill GP , et al .Production of epider growth factor in methylotrophic yeast cells, International Patent Application ,1990 ,Publication No:WO90/10697毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展_夏姗
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏21.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039；2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071；3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。
而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。
我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。
［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04Progess of Pichia pastoris Engineering Bacteria on High-Density Fer⁃mentationXIA Shan 1,2,WU Fu-Jun 2,3,ZHAO Hong-Liang 2,XUE Chong 2,LIU Zhi-Min 2*1.School of Life Science,Anhui Uniservity,Hefei 230039;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;3.Shanxi Kangbao Biological Product Co.Ltd,Changzhi 046000;China*Corresponding author,E-mail:liuzhm@［Abstract ］Pichia pastoris has been utilized widely as an excellent heterologous gene expression system recently.High-density fermentation has been a key technique tache to improve the expression level of the protein of inter ⁃est.In this paper,we expounded the choose of engineering bacteria,designation and optimization of culture medi ⁃um,and control of fermentation course to increase P.pastoris on high-density fermentation.Moreover,the questionsexisting in industry high-density fermentation were put forward.［Key words ］Pichia pastoris ;high-density fermentation;optimization of culture medium;control of fermentationcourse综述doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.02620世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。
生物抗菌肽毕赤酵母表达系统研究进展
中 国 病 原 生 物 学 杂 志 2009 年 9 月 ! ! 第 4 卷第 9 期 ! Sept emb er 2009, ! V ol. 4, N o. 9 J ournal of Pathogen Biology
综述 生物抗菌肽毕赤酵母表达系统研究进展
孔凡红, 仲维霞, 崔勇, 王洪法*
*!
通讯作者 ! E m ail: w an g_hongf a@ yahoo. com. cn 作者简介 ! 孔凡红 ( 1984- ) , 女 ( 汉族 ) , 山东邹城 人 , 在读硕 士 ,
主要从事生物制品的研究。 E mail: k on gfan1025@ 163. com
中 国 病 原 生 物 学 杂 志 2009 年 9 月 ! ! 第 4 卷第 9 期 ! Sept emb er 2009, ! V ol . 4, N o. 9 J our nal of Pathog en Biology 表达系统有一定优点 : 成 本低、 易 于操 作、 遗传 背景 清楚 、 能被 大规模培养、 有大量可供选择利 用的克 隆和表 达载体。但 运用 该系统表达抗菌肽 则比较 困难 , 主 要表现 在 3 个方 面 : 1) 大肠 埃希菌是原核生物 , 不具有真核生 物的基 因表达调 控机制 和蛋 白质翻译后加 工修 饰 能力 , 其 产 物往 往形 成 没 有活 性 的包 涵 体 , 须经过变性、 复性等处理才能应用 ; 2) 抗菌肽的 宿主细 胞毒 性。宿主细胞表达的抗菌肽会反馈性 抑制大 肠埃希 菌的增 殖 , 影响抗菌肽的进一步表达 ; 3) 容 易被降 解。抗菌肽 本身带 有大 量的正电荷 , 对蛋白酶非常敏感 , 在大 肠埃希 菌中容 易降解 , 难 以实现大量表达。因此 抗菌 肽基 因只能 以融 合 蛋白 的形 式在 大肠埃希菌中表达。但也不乏有成功 的例子 , 目前 已有多 种抗 菌肽进入 # 期临床试 验阶 段 [ 6] ; 用 脂质 体包 装的 2 螺旋 型阳 离子肽 CM 3 喷剂 也已完成用于治疗支气 管和肺部 感染的 临床 实验
毕赤酵母蛋白表达系统研究进展
P． pastoris 是甲醇营养型酵母中的一种，可以在 含有甲醇的培养基上快速生长。与其他蛋白表达系
收稿日期： 2010-11-02 基金项目： 福建省科技厅资助项目（ 2009N0032） ，福建省教育厅资助项目（ JA08041） 作者简介： 杨梅，女，博士，教授，研究方向： 生物化学与分子生物学； E-mail： myang@ fjnu． edu． cn
3 外源蛋白的表达及其影响因素
目前，毕赤酵母蛋白表达系统在国内外应用都 很广泛，已成功表达许多外源蛋白。但由于毕赤酵 母本身仅分泌少量蛋白，因此外源蛋白占培养基中 总蛋白的绝大多数。有些外源蛋白的表达量可达到 g / L 以上水平，如 Hao 等［27］成功表达的重组人复合 α-干扰 素 （ cIFN） 的 表 达 量 达 到 1． 24 g / L； Huang 等［28］表达的截短的 1，3-1，4-β-D-葡聚糖酶的表达 量为 3 g /L。虽然许多外源蛋白都可以在毕赤酵母 中高效表达，但仍然有些蛋白表达量相对较低或不 表达，在同一表达系统中表达不同的外源蛋白，其表 达量千差 万 别，外 源 蛋 白 的 表 达 受 多 方 面 因 素 的 影响。 3． 1 外源基因自身的内在特性
母属（ Candida） 和汉逊酵母属（ Hansenula） 等。毕赤 酵母（ P． pastoris） 作为甲醇酵母的一种，是单细胞低 等真核生物，已发展成为广泛应用的表达宿主。与 其他表达系统相比，毕赤酵母具有不可比拟的优势， 其既有原核生物繁殖快、易于培养、培养基廉价和试 验过程简单可行等特点，又具有强有力的启动子，还 可以对外源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，具备 了典型的真核生物表达体系的特点。毕赤酵母表达 系统已发展成为一个较为理想的蛋白表达系统，被 国内外广泛应用于生产外源蛋白。目前，已有 500 多种外源蛋白在该表达系统中获得表达［4］。
毕赤酵母表达系统研究进展
Ａｄ ｖ ａ ｎｃ ｅ ｓ ｏ ｆ Ｐｉ ｃ ｈｉ ａ ｐ ａ ｓ ｔｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ
第 ４卷 第 ９期
２ ０ １ ３年 ９月
黑 龙 江 科 学
ＨＥＩ Ｌ０ＮＧＪ Ｉ ＡＮＧ Ｓ Ｃ Ｉ ＥＮＣＥ
Ｖ０ Ｉ ． ４ Ｎｏ ． ９
Ｓ ｅ ｐ ｔ ｅ ｍｂ ｅ ｒ ． ２ ０ １ ３
毕 赤 酵 母 表 达 系 统研 究进 展
马银 鹏 ， 王玉文 ， 党 阿丽 ， 孔祥辉 ， 张介驰 ＇
ＭＡ Ｙｉ ｎ — ｐ ｅ ｎ ｇ ，Ｗ ＡＮＧ Ｙｕ — ｗｅ ｎ ，ＤＡＮＧ Ａ． １ ｉ ，Ｋ ＯＮＧ Ｘｉ ａ ｎ ｇ ． ｈ ｕ ｉ ’ ，Ｚ ＨＡＮＧ Ｊ ｉ ｅ — ｃ ｈ ｉ ＇
（ １ ． Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆｍ ｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｈ ｅ ｉ ｌ ｏ ｎ ｇ ］ ｉ ａ ｎ ｇ Ａ ｃ ａ ｄ ｅ ｍ ｙ ｏ ｆＳ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ， Ｈ ａ ｒ ｂ ｉ ｎ １ ５ ０ ０ １ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ２ ． Ｉ ｓｔ ｎ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｆＡ ｏ ｄ ｖ ａ ｎ ｃ ｅ ｄ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｈ ｅ ｉ ｌ ｏ ｎ ｇ ｉ ｆ ａ ｎ ｇ Ａ ｃ ａ ｄ ｅ ｍ ｙ ｆＳ ｏ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ， Ｈ ａ ｒ ｂ ｉ ｎ １ ５ ０ ０ ２ ０， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
（ １ ． 黑龙江省科学 院微生物研究所 ， 哈尔滨 １ ５ ０ ０ １ ０ ； ２ ． 黑龙江省科学 院高技术研究 院 ， 哈尔滨 １ ５ ０ ０ ２ ０ ）
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毕赤酵母表达系统研究进展作者：齐连权， 陈薇， 来大志， 于长明， 王海涛作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071刊名：中国生物工程杂志英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：2002,22(6)被引用次数：11次1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04)2.查看详情3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 19924.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichiapastoris[外文期刊] 2000(1)5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29)6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08)7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03)8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03)9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03)10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04)11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02)12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 199713.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1)14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊]2001(04)15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)16.Werten M W;van den Bosch T J;Wind R D High yield secretion of recombinant gelatins by Pichia pastoris 199917.Callewaert N;Laroy W;Cadirgi H Use of HDEL tagged Trichoderma reesei mannosyl oligosaccharide 1 2 alpha D mannosidase for N glycan engineering in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(23)18.Hilario E;Lataro R C;Alegria M C High level production of functional muscle alpha tropomyosin in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(04)19.Choi B K;Jimenez Flores R Expression and purification of glycosylated bovine betacasein(L70S/P71S) in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(04)20.Borgheresi R A;Palma M S;Ducancel F Expression and processing of recombinant sarafotoxins precursor in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(08)21.Cregg J M;Cereghino J L;Shi J Recombinant proteinexpression in Pichia pastoris[外文期刊] 2000(01)1.张伍魁.范清林.宋礼华.ZHANG Wu-kui.FAN Qing-lin.SONG Li-hua毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用[期刊论文]-中国生物工程杂志2006,26(1)2.隋少飞.陈松林巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展[期刊论文]-生物技术通报2004(3)3.龙晶.杜立新.LONG Jing.DU Li-xin巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展[期刊论文]-微生物学杂志2007,27(6)4.黄石.邹民吉.徐东刚毕赤酵母分泌表达系统的研究进展[期刊论文]-医学研究通讯2004,33(7)5.杨梅.温真.林丽玉.杨彩云.Yang Mei.Wen Zhen.Lin Liyu.Yang Caiyun毕赤酵母蛋白表达系统研究进展[期刊论文]-生物技术通报2011(4)6.樊建勇.王刚.刘玉峰毕赤酵母表达系统[期刊论文]-国外医学(预防、诊断、治疗用生物制品分册)2003,26(5)7.韩雪清.刘湘涛.尹双辉毕赤酵母表达系统[期刊论文]-微生物学杂志2003,23(4)8.彭彦孟.连继勤毕赤酵母表达系统[期刊论文]-国际检验医学杂志2007,28(7)9.欧阳立明.张惠展.张嗣良.刘志敏.OUYANG Li-Ming.ZHANG Hui-Zhan.ZHANG Si-Liang.LIU Zhi-Min巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展[期刊论文]-生物化学与生物物理进展2000,27(2)10.娄瑞娟.罗利龙.张霞.张瑞刚.宋水山.LOU Rui-juan.LUO Li-long.ZHANG Xia.ZHANG Rui-gang.SONG Shui-shan巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展和前景展望[期刊论文]-生物学杂志2010,27(5)1.张旦旦.窦文芳.许正宏.史劲松基于蛋白酶活性控制的重组人β干扰素毕赤酵母表达体系优化[期刊论文]-中国医药工业杂志 2012(9)2.张淑琼.高娟.曾思遥.蒋再学.陈瑞爱.罗满林犬IFN-α优化基因的真核表达及抗病毒活性的研究[期刊论文]-中国畜牧兽医 2012(8)3.窦文芳.张旦旦.许泓瑜.金坚.许正宏.史劲松.陆震鸣提高重组表达体系相对活性促进外源蛋白表达：人干扰素毕赤酵母表达体系研究[期刊论文]-食品与发酵工业 2011(11)4.曾松荣.王艳萍.杨明重组毕赤酵母发酵牛肉风味肽的中试研究[期刊论文]-中国生物工程杂志 2008(10)5.朱骞.张汇东.葛菲菲.缪勤.曹瑞兵.陈溥言.徐汉坤犬白细胞介素2在毕赤酵母中的诱导表达及生物活性的测定[期刊论文]-农业生物技术学报 2007(4)6.蔡梅红.张素芳.曹瑞兵.郭伟玲.陈溥言重组酵母鸡γ干扰素的抗病毒活性测定及临床初步应用[期刊论文]-微生物学报 2006(1)7.曹瑞兵.周国栋.周海霞.包晶晶.陈溥言猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用[期刊论文]-微生物学报 2006(3)8.龙元.刘钟滨基因工程植酸酶表达的优化途径和方法[期刊论文]-同济大学学报（医学版） 2006(z1)9.季刚鼠抗人CD2基因工程抗体嵌合Fab的构建和表达[学位论文]博士 200610.肖生科.王磊.陈毓荃提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展[期刊论文]-生物技术通报 2004(2)11.赵玉美洲商陆抗病毒蛋白Ⅰ和Ⅱ基因功能的研究及叶片中抗病毒蛋白的分离[学位论文]博士 200412.王强应用建立的DNAshuffling配套技术平台改良tPA分子性质的研究[学位论文]博士 200413.曹瑞兵重组猪α、β和γ干扰素的研制及其抗病毒作用[学位论文]博士 2004本文链接：/Periodical_swgcjz200206010.aspx。