生物抗菌肽毕赤酵母表达系统研究进展

病原体的防御反应中所产生的 一类小 分子多肽 。自从 1975 年 瑞典科 学 家 Bo man 从 蚕 蛹 分 离 得 到 一 种 杀 菌 肽 天 蚕 素 ( cecropin) 以来 , 人们 相 继从 细菌、 真 菌、 两栖 类、 昆 虫、 高等 植 物、 哺乳动物以及人类体内发 现了抗 菌肽 [ 1] 。许多 传统的 抗生 素具有毒副作用且能够诱导耐药菌株 的产生 , 发展 克服耐 药性 问题的新型抗生素显 得越 来越 重要 ; 抗 菌肽 具有 分子 质量 小、 水溶性好、 耐热性强、 无免疫原性、 抗菌谱 广和作用 机制独 特等 特点 , 还有研究表明 , 抗菌肽无致畸作 用且不 易发生 蓄积中 毒 , 因此被认为能够成为替代抗生素 的首选 药物。近几 年来 , 有关 抗菌肽及其应用逐渐 成为 动物 学、 植物 学、 药理 学、 生理 学、 免 疫学及分子生物学等 领域 研究的 热点 , 在 医药 卫生、 农业 生产 以及食品工业等领域都具有广泛的应用前景。 1 ! 抗菌肽与基因工程 抗菌肽相对分子质量小 , 有 12~ 100 个氨 基酸组 成。尽管 抗菌肽在长度上千差万别 , 但几乎 所有的 抗菌肽在 本质上 都是 阳离子型 , 两亲结 构是它 们的 共同特 征 , 这种 结 构特 征可 能与 抗菌肽的胞膜攻击 作用 机制密 切相 关。大多 数 抗菌 肽基 本的 作用机制是破坏肿瘤细胞或细菌质膜 结构 , 引起胞 内水溶 性物 质大量渗出 , 从而引起肿瘤细 胞和细 菌的死 亡 [ 2] 。这与传 统抗 生素阻断细菌大分子生物合成的机制 完全不 同 , 病 原菌不 易对 其产生耐药性。抗菌肽 主要 是由 组成免 疫系 统 的诸 多细 胞产
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701 酵母 X 33, 甲醇诱导表达 , 分泌表达了人 皮肤抗 菌肽 L L 37, 产 物纯化后经藤黄微 球菌测试 具有抗 菌活 性。尹娜 等 [ 15] 根据 毕 赤酵母密码子的偏爱性 , 人工合成抗菌 肽 Cecropin D 并克隆 到 酵母表达载体 pPI C9K, 重组表达质粒 pPIC9K D 转 化至毕赤酵 母菌 G SI15, 甲醇诱导表达 , 经 T r icine SDS PA GE 检测 , 在相对 分子质 量 3. 9 ku 处 出 现 目 的 蛋 白 表 达 条 带 , 获 得 的 抗 菌 Cecropin D 对部分革兰 阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。陆 建 荣 等 [ 16] 将 毕 赤 酵 母 分 泌 表 达 质 粒 pP IC9 5 ∃ UT R 内 G GA T CCAA 序列去除 , 构 建改良 的重 组表 达载 体 pP IC9 ED IT L L 37, 原生质球法转 化毕赤酵 母 G S115 。结 果表明 改建 后 L L37 蛋白表达量提高了 约 35 倍。王 婷婷等 [ 17] 构建了 家蝇 抗 菌肽 Attacin 基因多 拷贝串 联体 , 并 克隆 到甲 醇酵 母分 泌表 达 栽体 pP IC9K 上 , 为进一步进行高效表达打下 了基础。 Jin 等 [ 18] 将 cecropin A 的 1~ 8 个氨基酸序列和 maga inin 2 的 1~ 12 个氨基酸序列 连在 一起 , 构建 了酵 母表 达载体 pPIC ZaA / CA M A , 转染毕 赤酵 母 SM D1168, 流 式发 酵 罐发 酵 液 中 目的蛋白含量可达到 22 mg/ L。纯 化后的表达 蛋白比 cecr opin A 和 mag ainin 2 具有更广的杀菌谱和更高的抗菌活性。 牛明福等 [ 19] 将抗菌肽 Pr oteg rin 1( PG 1) 、 Sco rpion D efen sin( SD) 、 M etalniko win 2A 和 Sheep M yeloid A ntibact erial Pep tide( SM A P 29) 成熟肽段 作为 模板 序列 , 设计 并人 工合 成了 复 合抗菌肽 pl 基因 , 同 时用 SOE 法 获得 Scorpio n Defensin 的 基 因 , 分别克隆到 pPICZaA 载体 中 , 转 染酵 母菌 X 33, 复 合抗 菌 肽 pl 及 sD 均获得表达。结果显示复合抗菌肽 pl 及 sD 具有 很 强的热、 酸稳定性 , 而针对不同的 细菌 , 复合抗 菌肽则 表现出 了 强于单独的 sD 的活性 , 特别是对大肠杆菌。 研究发现 , 在以酵母 为宿 主菌 的抗 菌肽 基因 工 程中 , 多 数 研究都实现了目的蛋白的表达 , 产物对 工程菌 没有明 显的抑 制 作用 , 表明抗菌 肽 对酵 母的 毒 性 较小 , 适于 在 该系 统 中表 达。 为了使表达量增高 , 采用了各种不 同的表达 策略 , 直接 表达、 融 合表达、 改造后表达、 串联表达和 复合表 达等 , 都有一 定的预 期 结果。说明应用酵母表达抗菌肽具有很好的开 发前景。 3 ! 展望 近年来已经应用巴斯德毕赤 酵母表 达了许 多外源 蛋白 , 也 出现商用的表达 载体 和试 剂盒等 用作 科学 研究。 人们 对抗 菌 肽的性质和特征的进一步研究 发现 , 用 不同表 达体系 表达抗 菌 肽效果不一样。因此 , 可以从不同的表 达体系 内寻找 其独特 的 新型抗菌肽 , 突破传统培养发酵模 式 , 优 化培养 基配方 , 为提 高 抗菌肽的表达量作出有益的探索。
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通讯作者 ! E m ail: w an g_hongf a@ yahoo. com. cn 作者简介 ! 孔凡红 ( 1984- ) , 女 ( 汉族 ) , 山东邹城 人 , 在读ail: k on gfan1025@ 163. com
中 国 病 原 生 物 学 杂 志 2009 年 9 月 ! ! 第 4 卷第 9 期 ! Sept emb er 2009, ! V ol . 4, N o. 9 J our nal of Pathog en Biology 表达系统有一定优点 : 成 本低、 易 于操 作、 遗传 背景 清楚 、 能被 大规模培养、 有大量可供选择利 用的克 隆和表 达载体。但 运用 该系统表达抗菌肽 则比较 困难 , 主 要表现 在 3 个方 面 : 1) 大肠 埃希菌是原核生物 , 不具有真核生 物的基 因表达调 控机制 和蛋 白质翻译后加 工修 饰 能力 , 其 产 物往 往形 成 没 有活 性 的包 涵 体 , 须经过变性、 复性等处理才能应用 ; 2) 抗菌肽的 宿主细 胞毒 性。宿主细胞表达的抗菌肽会反馈性 抑制大 肠埃希 菌的增 殖 , 影响抗菌肽的进一步表达 ; 3) 容 易被降 解。抗菌肽 本身带 有大 量的正电荷 , 对蛋白酶非常敏感 , 在大 肠埃希 菌中容 易降解 , 难 以实现大量表达。因此 抗菌 肽基 因只能 以融 合 蛋白 的形 式在 大肠埃希菌中表达。但也不乏有成功 的例子 , 目前 已有多 种抗 菌肽进入 # 期临床试 验阶 段 [ 6] ; 用 脂质 体包 装的 2 螺旋 型阳 离子肽 CM 3 喷剂 也已完成用于治疗支气 管和肺部 感染的 临床 实验
eases , J ining 272033, Shandong, China) Abstract ! A ntimicr obial peptides( A M Ps) a re amphiphilic, positively char ged mo lecules that have emerg ed as no vel an timicro bial ag ents. M any different kinds of A M P s hav e been identified fro m var ious o rg anisms. A M Ps have br oad spec tr um of antibact erial activities. P reparation o f A M P s at a larg e scale is a sig nificant challenge in o rder to dev elop co mmer cial product s. L imited resources of nat ur al antimicro bial peptide and diff iculties in extr action make antimicro bial peptide har d to achieve lar ge scale pr oductio n; a rtificial synthesis of antimicr obial peptide is limited to research fo r its high co st and difficulty to industr ialization. Pichia p astor is ex pr ession system is applicable to a w ide r ang e o f bio log ical antimicr obi al peptide, and the level of ex pr essio n can be increased by var ious st rateg ies, so P . p astor is sy st em has a go od application pr ospects in antimicr obial peptide pr oduction. T his paper focuses o n the advances of P . p astor is ex pression. Key words ! A nt imicro bial( A M Ps) ; Pichia p astor is ; review
[ J our nal of Pathogen B iology . 2009 Sep; 4( 9) : 700- 702. ]
Advanced on Pichia p ast oris expression of antimicrobial peptides KONG F an hong, ZH ONG Wei x ia, CUI Yong, WANG H ong fa ! ( S handong I ns titute of P ar asitic D is