筛选功能(强)启动子
启动子
（ ……T89A89T50A65A100…… ） 的 TATA 区 和 -35 bp 处
（……T85T83G81A61C69A52……）的 TTGACA 区。现已查明，-10位的 TATA 区和
-35位的 TTGACA 区是 RNA 聚合酶与启动子的结合位点，能与 σ 因子相互识别而具
有很高的亲和力。
遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）
以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布
百科名片
RNA 聚合酶特异性识别和结合的 DNA 序列。 启动子是基因（gene）的一个组成部分，控 制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关”，决定基 因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleotides），那么启动子也应由核苷酸组成。启 动 子 本 身 并 不 控 制 基 因 活 动 ， 而 是 通 过 与 称 为 转 录 （ transcription ） 因 子 的 这 种 蛋 白 质 （proteins）结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶（enzymes）(RNA 聚合酶 polymerases) 的活动。这种酶指导着 RNA 复制。
顺序(consensus sequence)，只有少数几个核苷酸的差别。
转录单元
转录单元(transcription unit) 是一段从启动子开始至终止子(terminator)结束的 DNA 序列，RNA 聚合酶从转录起点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一 条 RNA 链。在细胞中，一个转录单元可以是一个基因，也可以是几个基因。
因子的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”， 指挥着酶（enzymes）(RNA 聚合酶 polymerases) 的活动。这种酶制造着基因的 RNA
基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果评估
基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果评估摘要：近年来，基因启动子活性检测技术在克隆表达研究中得到了广泛应用。
本文通过系统综述已有文献，并结合实验研究结果，评估了基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果。
研究发现，基因启动子活性检测技术可通过定量及定位分析启动子活性，从而提高克隆表达效率和精确性。
然而，在选择合适的启动子，优化实验条件和解读数据方面仍存在一些挑战和限制。
因此，进一步的研究和优化仍然需要进行。
引言：基因启动子是调控基因转录的关键序列。
准确评估基因启动子的活性对于克隆表达和基因功能研究具有重要意义。
传统的基因启动子活性检测方法存在一些局限性，如低灵敏度、低通量和复杂操作等。
近年来，随着新技术的出现，基因启动子活性检测在克隆表达研究中得到了广泛应用。
本文旨在评估基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果，为相关领域的研究提供参考和指导。
一、基因启动子活性检测技术的原理和方法1. 荧光素酶报告基因系统荧光素酶报告基因系统是一种常用的基因启动子活性检测方法。
它利用荧光素酶作为报告基因，通过测量其活性来反映启动子的活性水平。
这种方法具有高灵敏度、高通量和低背景的优点，被广泛应用于克隆表达研究。
2. 可视化报告基因系统可视化报告基因系统是另一种常用的基因启动子活性检测方法。
它利用可视化标记（如荧光蛋白和β-半乳糖苷酶等）作为报告基因，使启动子活性的检测结果可以直观地观察和分析。
可视化报告基因系统具有直观、快速和定量化分析的优点，在基因启动子活性检测中得到了广泛应用。
二、基因启动子活性检测技术在克隆表达中的应用1. 提高克隆表达效率通过基因启动子活性检测技术可以筛选出活性高的启动子，从而提高克隆表达效率。
研究发现，活性高的启动子与高表达水平存在正相关关系，选择合适的启动子可以显著提高克隆表达效果。
2. 精确调控克隆表达水平基因启动子活性检测技术可以定量分析启动子的活性水平，从而实现精确调控克隆表达水平。
如何找一个基因的启动子序列呢
1、UCSC（1）网址：在Genome里选择物种，比如human，search里输入你的基因名PTEN，点击Go（2）出现新的页面，看到“Known Gene Names”下面的PTEN了吧，点它（3）又回到了和（1）类似的页面，此时，点击sequence（4）出现一个新的页面，选中promoter，同时可以输入数值修改具体的序列区域，比如Promoter including 2000 bases upstream and 100 downstream，即表示启动子-2000～＋100区域（5）点击“get sequence”，出现页面中最上面的序列“>uc001kfb.1 (promoter 2000 100) PTEN - phosphatase and tensin homolog”就是你要的人PTEN启动子-2000～＋100区域的序列了2、Ensembl（1）网址：在“Search Ensembl“标题下search后的下拉框中选中物种名homo sapiens（人），for框中输入基因名PTEN，点击Go（2）出现的新页面中比较乱，但不要管它，直接寻找“Ensembl protein coding gene ”字样的，对，也就是第二个，点击它（3）新出现的页面也很乱，不过依然不用管它，看到左侧有点肉色（实在不知道怎么描述了）的那些选项了吗，对，就是“Your Ensembl”下面那一堆，在里面找“Genomic sequence”，点它（4）现在的界面就一目了然了，在“5' Flanking sequence”中输入数值确定启动子长度（默认为600），比如1000，点击update；（5）出现的序列中，标为红色的就是基因的外显子，红色之间黑色的序列就是内含子，而第一个红色自然就是第一外显子了，那么从开始的碱基一直到第一个红色的碱基间自然就是启动子-1000~+1的序列啦这样，你不仅查到了启动子，连它的外显子、内含子序列也全部搞定了3、SIB-EPD（1）网址：（2）具体使用方法大同小异，就是输入物种名、基因名，限定启动子序列区域不过有了前两个，我想已经足够用了，个人感觉SIB-EPD的库容量太小，很多基因查不到我以前回的贴，总结一下ensembl一般也和NCBI的一致，你的情况可能例外。
6.目的基因的表达
IPTG
mRNA
Tac 表达系统
tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列 拼接而成的杂合启动子。 拼接而成的杂合启动子。
启动子 P lac P trp P tac -35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA -10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT
成一个操纵子 – 操纵子—原核生物转录单位
– 启动序列决定转录活性大小 – 操纵序列是阻遏蛋白的结合位点 • 负性调节 为主 • 正性调节 • 真核生物： 真核生物： • 顺式作用元件（cis-acting element）-顺式作用元件（ ） 指可影响自身基因表达活性的DNA序列。 自身基因表达活性的 序列。 指可影响自身基因表达活性的 序列 – 非编码序列 – 启动子 – 调控元件 位于远端调控区的顺式作用元 调控元件: 增强子,沉默子 件(增强子 沉默子 增强子 沉默子)
发热量低、需氧低、 发热量低、需氧低、适当的发酵温 度和细胞形态； 度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 容易进行DNA重组技术操作； DNA重组技术操作 产物的产量、产率高， 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。 产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类： 宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆 菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母、 第二类为真核细胞：常用有酵母、 丝状真菌、哺乳动物细胞等。 丝状真菌、哺乳动物细胞等。
Lac 表达系统 负调节因子 lac I 表达系统:
在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白， 与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。
功能突变体筛选及其在基因功能研究中的应用
功能突变体筛选及其在基因功能研究中的应用随着基因组学和生命科学领域的发展，越来越多的基因和基因产物的功能需要通过实验验证来确定。
其中，功能突变体筛选被广泛应用于分析基因功能和相关的细胞和生物过程。
本文将探讨功能突变体筛选的概念、策略、应用和未来发展方向。
一、概念功能突变体(allele)是指由于基因组重组、基因组突变、突变、诱变等因素导致的基因或基因产物变异。
在遗传学和分子生物学中，对功能突变体的研究可用于揭示基因和蛋白质的功能、表达和互作方式等信息。
突变体筛选是指通过基因组重组、基因编缉、人工合成等手段制备一系列突变体，然后通过对突变体的筛选和实验观察，找到与所研究基因或功能相关的特定突变，从而进一步揭示相关性的实验方法。
二、策略目前常用的突变体筛选策略主要包括四种，分别是：1.靶点法：针对特定功能或基因，设计相应的突变体序列，并通过不同实验方法(如蛋白质相互作用，酶活性测定等)筛选出相关性突变体。
2.产物法：根据某一特定蛋白质或化合物的质量或活性的变化，找到相应的突变体。
3.细胞筛选法：通过细胞中的特定表型变化，如荧光光谱变化、增值或死亡，从而筛选出与目标基因或产物相关的突变体。
4.深度筛选法：通过对研究对象进行大规模突变体制备和筛选，全面系统地分析了其表型、基因、蛋白质以及代谢及信号传递通路等少数特定产物筛选出像“冰山一角”的突变体。
三、应用功能突变体筛选在生物、医学等研究领域有着广泛的应用。
如：1.基因功能研究：通过对基因产物功能的探究，了解了基因产物与细胞过程的相关性，对基因功能的分析与揭示发挥了重要作用。
2.治疗疾病：通过对突变体的筛选和研究，了解病变基因或特定基因突变的作用，并为治疗相关疾病提供了新的线索。
3.基因启动子研究：针对某一特定基因启动子的序列而设计突变子，进一步探究其表达、修饰等特点，从而为基因启动子的研究提供理论基础。
4.新物种发现：通过分离、鉴定和筛选新物种产物去了解新物种的生物学、化学和生态学性质。
启动子名词解释
启动子名词解释启动子是一种基因组中的特殊序列，它在转录过程中起到了重要的作用。
启动子位于基因的上游区域，通常位于转录起始点的附近。
它的主要功能是为RNA聚合酶提供一个结合位点，从而启动基因的转录过程。
启动子的结构和序列对基因的表达水平和模式起着决定性的作用。
在本文中，我们将讨论启动子的结构、功能以及它在基因调控中的重要性。
启动子的结构。
启动子通常由一系列特定的DNA序列组成，这些序列被称为转录因子结合位点。
这些结合位点是一些特定的蛋白质（转录因子）的结合位点，它们能够与RNA聚合酶和其他调控因子相互作用，从而调控基因的转录。
启动子的结构是非常复杂的，它通常由多个转录因子结合位点组成，这些结合位点之间存在着复杂的相互作用关系。
此外，启动子的结构还受到DNA甲基化、染色质结构和其他表观遗传学修饰的影响。
启动子的功能。
启动子的主要功能是为RNA聚合酶提供一个结合位点，从而启动基因的转录。
在转录过程中，转录因子能够与启动子上的结合位点相互作用，从而招募RNA聚合酶和其他调控因子，形成一个转录复合物。
这个复合物能够在启动子上形成一个开放的DNA结构，从而使RNA聚合酶能够进入并开始转录过程。
此外，启动子还能够调控基因的表达水平和模式，它能够受到外部信号的调控，从而使基因的表达适应不同的环境条件。
启动子在基因调控中的重要性。
启动子在基因调控中起着非常重要的作用。
它能够决定基因的表达水平和模式，从而影响细胞的功能和特性。
启动子的异常结构或功能可能导致基因的异常表达，从而引起一系列疾病。
因此，对启动子的研究不仅有助于理解基因的调控机制，还有助于发现新的药物靶点和疾病诊断标志物。
启动子的研究方法。
对启动子的研究是基因组学和表观遗传学研究的重要内容。
目前，研究人员利用多种方法来研究启动子的结构和功能。
其中，常用的方法包括DNA测序、染色质免疫共沉淀、甲基化特异性PCR和转录组学分析等。
这些方法能够揭示启动子的结构和功能，从而为基因调控的研究提供重要的信息。
基因工程复习资料
基因工程复习资料克隆：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上相同的DNA 分子、细胞或者个体所构成的特殊的生命群体载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。
化学本质：DNA 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或者整合能力3.为外源基因的扩增或者表达提供条件。
基因工程的含义：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对一种生物（供体）的遗传物质（DNA ）直接进行体外重组操作与改造，并转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
黏性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来DNA连杆，是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸构成的、具有一个或者数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。
DNA接头它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。
当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具黏性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。
载体：携带外源DNA进入宿主细胞，并为其提供复制与功能基因表达调控系统的工具。
目的基因：基因工程中克隆的目标DNA分子SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，它能够与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始启动子：DNA分子与RNA聚合酶特异结合的部位，也是转录开始的部位基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为该生物的基因组文库。
cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各类cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称之cDNA文库。
启动子的作用高中生物课本
启动子的作用高中生物课本作用和功能：启动⼦是指⼦段能使特定基因进⼦转录的DNA序列。
启动⼦可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录合成RNA。
在RNA合成RNA聚合酶辨认，并开始转录合成RNA。
在RNA合成中，启动⼦可以和调控基因转录的转录因⼦产生相互作用，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，包含核⼦启动⼦区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动，继⼦控制细胞开始生产哪⼦种蛋⼦质。
启动⼦位于控制基因表达的调控序列中、基因转录起始位点的上游（朝向DNA正义链的5′⼦向），长约100一1000个碱基对。
启动⼦本⼦并⼦编译功能，但它拥有对基因翻译氨基酸的指挥作用，就像⼦⼦旗帜，其核⼦部分是⼦编码区上游的RNA聚合酶结合位点，指挥聚合酶的合成，这种酶指导RNA的复制合成。
因此该段位的启动⼦发生突变（变异），将对基因的表达有着毁灭性作用。
启动⼦代表⼦些重要的元件可以与其他调节区域（如成。
因此该段位的启动⼦发生突变（变异），将对基因的表达有着毁灭性作用。
启动⼦代表⼦些重要的元件可以与其他调节区域（如增强⼦、沉默⼦、边界元件或绝缘⼦）合作⼦致，以主导基因转录的⼦平。
分类诱导型启动⼦：表达载体采用诱导型启动⼦，只有在诱导剂存在的条件下才能表达⼦的产物。
这种⼦法有助于避免菌体生长前期⼦表达对菌体生长的影响，⼦可减少菌体蛋⼦酶对⼦标产物的降解。
特别适合解决有毒蛋⼦的表达。
组成型启动⼦："能够使基因在所有组织中都能启动表达的启动⼦称为组成型启动⼦。
组成型启动⼦的调控不受外界条件的影响，所启动基因的表达具有持续性，但不表现时空特异性。
"⼦般来⼦于管家基因，可连续不断地启动基因的表达。
U6 启动⼦：U6 是⼦型启动⼦，⼦般发现是启动⼦⼦段，不带PolyA 尾的序列。
由Ⅲ类 RNA 聚合酶启动⼦ U6 启动⼦转录产生shRNA，经剪切后产生成熟 siRNA，产生⼦扰效果。
这⼦类启动⼦在腺病毒和慢病毒⼦扰载体的构建中应用很多。
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以氨苄青霉素抗性基因作为报告基因筛选大肠杆菌（原核生物）功能启动子为例，简要说明其强启动子的筛选过程。
强启动子对于基因工程操作中外源基因的表达效率有显著的影响，因此他的筛选具有重要的意义。
在这之前，需要对启动子的一些相关知识进行一些梳理。
大肠杆菌的启动子位于-10区和-35区，而真核生物启动子却不同，因此不能以真核生物的启动子作为筛选目的（反之，亦不可）；常见的原核生物在启动子上虽然没有较大差别，但是为了能高效表达，我们还是从大肠杆菌自身的基因组中选择强启动子，因为这也和外源启动子稳定性和大肠杆菌RNA聚合酶结合的倾向性有感（优先结合与自身）；另外还要考虑载体的拷贝数，多拷贝载体和单拷贝在形成产物的量上是有差别的，当然，如果能够通过载体把外源基因整合到宿主（这里指大肠）上，这样就能防止在传代是质粒不稳定或丢失的现象。
（１）大肠杆菌基因的分离：去垢剂溶解细胞，酚和蛋白酶去除蛋白质，核糖核酸酶去除RNA，乙醇沉淀等步骤，得到大肠杆菌基因组、（２）DNA分子的切割：用限制性核酸内切酶进行切割；限制酶产生的黏性末端、末端转移酶合成的同聚物接尾以及合成的人工接头等。
酶切后的片段中就含有想要得到的启动子片段，片段进行ＰＣＲ扩增。
（３）载体选择：能在大肠杆菌中自主复制，对某些限制酶来说只有一个切口，并在酶作用后不影响其自主繁殖能力。
从细菌核酸中易于
分离和纯化。
在宿主中能以多拷贝形式存在，有利于插入的外源基因表达，能在宿主中稳定地遗传。
进入宿主细胞的载体主要有：a质粒：重组DNA以转化的方式进入宿主细胞；bλ噬菌体：重组DNA以转染的方式进入宿主细胞；c柯斯质粒：以转导的方式进入宿主细胞。
我们这里选择以来自大肠杆菌的含有氨苄青霉素抗性基因的不含启动子的PBR322质粒作为载体（常用的质粒载体，能在基因公司很容易买到因为题目要求要以氨苄青霉素抗性基因作为报告基因）。
酶切质粒（选与2中一样的酶来切，这样就能得到相同的粘性末端，容易将质粒与DNA片段结合），ＰＣＲ扩增至一定量。
（４）质粒片段与ＤＮＡ片段结合，导入受体细胞（这里是大肠）。
（５）将得到的大肠杆菌在液体培养基中进行培养。
（６）制作青霉素梯度平板或者是添加有青霉素的梯度ＬＢ液体培养基。
（７）将５中得到的菌体稀释为菌悬液，在６中涂布培养或液体发酵培养。
（８）含有强启动子菌体的检出。
因为能在青霉素中生长大肠是经过了质粒导入后的氨苄青霉素抗性基因的表达引起的（当然，也有一些是野生型大肠杆菌发生了突变，所以在选择报告基因时我们更应倾向于选择双报告基因作为标记），而他的表达则证明了启动子的存在。
（大多数情况下，在高浓度青霉素环境中生长的都是成功导入质粒载体的菌体，且能在越高浓度青霉素环境生
长的为能高效表达的，即含有强启动子的基因）
（９）将８中检出的菌体在一定量青霉素培养中培养，扩大培养，淘汰不能稳定遗传的菌体，破壁，收集质粒。
收集到的质粒继续以同一种酶切割。
（１０）切割后得到的片段以探针（大肠杆菌－３０区和－１０区启动子为ＣＡＡＴ和ＴＡＴＡ，探针就是由他们的互补链在固定相上做成，可以买的）吸附，富集，得到大肠杆菌的强启动子。