第六章 蛋白质定量和定性分析分解
蛋白质的定性和定量分析
➢ 样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉 淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去
➢ 多亚基蛋白质分子量检测 ❖ SDS和巯基乙醇 ❖ 用其它方法测定分子量进行参照
➢ SDS-PAGE测定的准确性 ❖ 电荷异常或构象异常 ❖ 带有较大辅基的蛋白质 ❖ 某些结构蛋白
• 许多干扰物质降低颜色反应 • 高盐浓度可引起沉淀
四、BCA (二喹啉甲酸)检测法
这是近年来新研制的一种改进的Lowry 测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质 的影响
原理
在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与 Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。 而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成 稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的 光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比， 可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量
注意事项 • 石英比色杯 • 调零所用溶液 • 配制标准蛋白所用溶液 • 光密度范围
二、Bradford检测法
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定 溶液中蛋白质含量的方法
原理
该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种 不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条 件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后， 产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物 在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液 中蛋白质浓度成正比，因此可检测595 mn的光 吸收值大小计算蛋白的含量
如果样品中含有脂类物质将明显 提高光吸收值
• 为促进BCA法的反应进程，可将 样品适当加热
小结（Summary）
掌握常用的测定方法 不同方法的操作步骤 操作过程的注意事项
其它蛋白质的定性定量方法
1. 蛋白质的染色定量 2. ELISA测定 3. 放射免疫测定
蛋白质定性定量分析ppt课件
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2、利用微电极直接测定凝胶表面的p H而得知样品的等电点；
3、将凝胶切成等距离(5nm)的小块， 浸于水中，用精密试纸测定pH。以凝 胶块距正极的距离为横坐标，pH为纵 坐标作用图得出胶的pH梯度曲线。根 据待测样品在凝胶中的位置而得出蛋
白质样品的等电点。
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与标准蛋白比较，得出样品蛋白的含量。
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免疫印迹技术的基本操作(例PKC)
1、细胞裂解物的制备 2、细胞裂解液蛋白含量测定 3、细胞裂解物SDS－PAGE电泳 4、蛋白质转膜 5、目的蛋白的检测
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转变为硫酸铵。
Pr＋H2SO4
CO2＋H2O＋(NH4)2SO4
(NH4)2SO4+2NaOH NH4OH+HCl
NH4OH+H2SO4 NH4Cl+H2O
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凯氏法的评价： 优点：
1、适用于一切形态的样品； 2、不用比色，对混浊不透明的样品也可 进行分析； 3、结果的精、准度较高。
其它蛋白质定性定量分析技
术
蛋白质的电泳染色定量分析
特定蛋白质在总蛋白中所点比例的分析：最
早应用于血浆蛋白电泳分离后白蛋白和球蛋
白的比例测定。其方法有二，其一是将染色
后的蛋白区带剪下，用适当的溶剂提取后比
色测定；其二用反射扫描仪处理后，计算各
蛋白质的定量分析方法
蛋白质的定量分析方法1．蛋白质的常规检测方法1.1 凯氏定氮法一种最经典的蛋白质检测方法。
原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用变成硫酸铵。
然后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。
优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好。
缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大。
1.2 双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。
原理：双缩脲是三分子的脲经180℃左右加热，放出一份子氨后得到的产物，在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽链中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅和蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。
优点：较快速、干扰物质少、不同蛋白质产生的颜色深浅相近。
缺点：灵敏度差、三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。
1.3 Folin酚试剂法原理：与双缩法大体相同，利用蛋白质中的肽键和铜离子结合产生双缩脲反应。
同时也由于Folin酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。
在一定条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。
优点：灵敏度高、对水溶性的蛋白质含量的测定很有效。
缺点：费时，要精确控制操作时间；Folin酚试剂的配制比较繁琐，且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA和尿素均会干扰反应。
1.4 紫外吸收法原理：蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在280nm处的吸光值与肽键含量成正比。
利用一定波长下蛋白质溶液的吸光值与蛋白质含量的正比关系可以测定蛋白质含量。
优点：简便、灵敏、快速、不消耗样品，测定后能回收。
缺点：测定蛋白质含量的精确度差、专一性差；干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶等能吸收紫外光的物质会出现较大的干扰。
蛋白质的定量和定性分析方法
蛋白质的定量和定性分析方法蛋白质是生物体内最重要的功能分子之一，对于研究生物体的结构和功能具有重要意义。
为了准确地了解蛋白质的含量和性质，在科学研究和实际应用中，我们需要使用定量和定性分析的方法来研究蛋白质。
一、定量分析方法1. 低里德伯法（Lowry method）低里德伯法是一种经典而广泛应用的蛋白质定量方法。
该方法利用蛋白质与碱式铜络合物在碱性条件下反应生成蓝色产物，通过比色法测定溶液的吸光度来计算蛋白质含量。
这是一种灵敏且相对简单的方法，适用于大多数蛋白质样品的定量分析。
2. 比色法（Colorimetric assay）比色法是一种常用的蛋白质定量方法，通过蛋白质与染料的结合来测定蛋白质浓度。
常用的染料有布拉德福蓝（Bradford）、库吉铃蓝（Coomassie Brilliant Blue）、BCA法（Bicinchoninic Acid assay）等。
这些染料与蛋白质结合后形成一种复色物，通过比色法测定溶液的吸光度可以定量分析蛋白质。
比色法具有操作简便、灵敏度高等特点，被广泛应用于蛋白质定量领域。
3. 分子标记法（Molecular tagging method）分子标记法是一种新兴的蛋白质定量方法，利用特定的分子标记物（如荧光染料、放射性示踪剂等）标记蛋白质，然后通过测定标记物的荧光强度或放射性信号来计算蛋白质浓度。
分子标记法具有高灵敏度、高特异性等优点，适用于微量蛋白质的定量测定。
二、定性分析方法1. SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）SDS-PAGE是一种常用的蛋白质定性分析方法，通过电泳将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中分离出来。
在电泳过程中，蛋白质在SDS（十二烷基硫酸钠）的作用下具有相同的电荷密度，只受到大小的限制而移动。
蛋白质在凝胶中的分离程度取决于其分子量大小，可以通过对比标准品的迁移距离来估计样品中蛋白质的相对分子量。
蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的根本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。
可根据R f 作为定性依据。
Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。
将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。
取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。
在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
蛋白质的检验方法
蛋白质的检验方法
蛋白质是生命体内重要的组成部分，对于维持生命活动和调节生理功能起着至关重要的作用。
因此，对蛋白质进行检验是十分必要的。
蛋白质的检验方法主要包括定性检验和定量检验两种，下面将分别介绍这两种方法。
定性检验是指通过实验方法来判断样品中是否含有蛋白质。
常用的定性检验方法有：
1. 硫酸沉淀法，将待检样品加入硫酸，再加入硝酸银。
如果有蛋白质存在，会生成白色沉淀。
2. 碱性铜蛋白法，将待检样品加入碱性铜蛋白溶液，如果有蛋白质存在，会生成紫色沉淀。
3. 生物素-亲和素法，利用生物素和亲和素之间的特异性结合来检验蛋白质的存在。
定量检验是指通过实验方法来确定样品中蛋白质的含量。
常用的定量检验方法有：
1. 比色法，利用蛋白质与某种试剂（如布拉德福试剂）发生显色反应，通过比色计或分光光度计测定吸光度，再根据标准曲线来确定蛋白质含量。
2. 琼脂糖凝胶电泳法，通过电泳将待检样品中的蛋白质分离，再利用染色方法来定量分析。
3. 酶标记法，利用酶标记的抗体或配体与待检样品中的蛋白质结合，通过酶的底物来测定蛋白质的含量。
总的来说，蛋白质的检验方法多种多样，可以根据实际需要选择合适的方法进行检验。
在进行蛋白质检验时，需要注意实验条件的控制，避免干扰因素对结果的影响。
同时，也要严格按照操作规程进行操作，确保实验结果的准确性和可靠性。
希望以上介绍的蛋白质检验方法能够对您有所帮助，如果您对蛋白质的检验方法还有其他疑问，欢迎随时咨询。
第六章 蛋白质定量和定性分析
5.0
5.0
摇匀，室温下放置10分钟
Folin-酚试剂乙/ml 0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
摇匀，在30℃保温（或室温下放置）30分钟
A 500nm
0
• 2.样品中蛋白的测定
•
取2支试管，分别加入0.2毫升样品(待测)稀
释液，再加入0.8毫升蒸馏水使样品体积达到1毫
升。
•
将样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的
(2)测定快速,简洁,只需要加一种试剂.完成一个样品的测定,只 要5分钟左右 .由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分 钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20 分钟之间,颜色的稳定性最好.
三 氨的吸收
1 、蒸馏器洗净后,从G加入小瓷片数粒,开放水龙头和P3使 瓷片随水流入A,水放至A球颈处即可.
2 、取150ml锥形瓶,加入2%硼酸20ml(内加2~3滴混合指示 剂),将锥形瓶置于M下并使管口接触至硼酸溶液底层.
3 、准确吸取稀释消化液5ml,由漏斗D注入蒸馏器,少量蒸 馏水冲洗漏斗,加入30%NaOH约5ml,再用少量蒸馏水冲洗, 夹紧螺旋夹并水封,使氨气不会从漏斗处流失.
e.一般消化至透明后,继续消化30min即可,但对于含有 特别难以消化的氮化合物的样品,如赖氨酸、组氨 酸、色氨酸等时,需适当延长消化时间.有机物如分 解完全,消化液呈蓝色或浅绿色,但含铁量多时,呈较 深绿色.
f.硼酸吸收液的温度不应超过40℃,否则对氨的吸收作 用减弱而造成损失.
g.蒸馏完毕后,应先将冷凝管下端提离液面,再蒸2min 后关掉热源,否则可能造成吸收液倒吸。
第六章 蛋白质定量和定性分析
(Qualitative and quantitative analysis of protein)
蛋白质分析鉴定
六、蛋白质的颜色反应
可作为蛋白质定性定量测定的依据
1、茚三酮反应(Ninhydrin Reaction) α－氨基酸和水化茚三酮(苯丙环三酮戊烃)功 能时，产生蓝色反应，由于蛋白质是由许多 α－氨基酸组成的，所以也呈此颜色反应。
2、双缩脲反应(Biuret Reaction) 蛋白质在碱性溶液中和硫酸铜功能呈现紫红 色，称双缩脲反应。凡分子中含有两个以上 －CO－NH－键的化合物都呈此反应，蛋白 质分子中氨基酸是以肽键相连，因此，所有 蛋白质都能和双缩脲试剂发生反应。
利用化学分析定量测定蛋白质中某 一特殊元素的含量，并假定蛋白质分子 中含1个这种元素，
2. 用物理化学方法来测定蛋白质的相对 分子质量 是目前常用的方法，包括测定质点 的：扩散系数、沉降超离心、凝胶过滤 、渗透压等。 渗透压测定法最为方便，但准确度 较差，超离心法最为准确，但需昂贵的 超速离心机，
透析：利用蛋白质不能通过半透膜的性 质将其与小分子物质分开的分离方法
四、蛋白质的沉淀作用
蛋白质保持稳定的亲水胶体状态，这 种稳定性主要由两因素决定： 1、 水化作用 存在有极性R基（—NH2、—COOH、 —OH等），故蛋白质分子表面结合有一层 水分子，称为水化膜，其可防止分子互碰 而聚集。
2 、电荷排斥作用 蛋白质是两性分子，一定 pH 值下，分子 带相同电荷，同性电荷互斥，使分子不能聚 集。 由此，改变稳定性的条件，蛋白质的稳 定性被破坏，从溶液中沉淀出来： a 加入脱水剂除去水膜 b 使pH=pI c 加入电解质使质点表面失去同种电荷。
三、 蛋白体的胶体性质
胶体：指质点大小在1nm-100nm范围内所构成 的分散系统 蛋白分子直径 2nm-20nm，其溶液是胶溶液并 且其分子表面分布有亲水氨基酸的极性R基，是一种 亲水胶体，具有亲水胶体的性质： 1、 具有半通透性 2、丁达尔效应 3、布朗运动 等 。
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(四)、注意事项
a.样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细，液 体样要混合均匀。
b.样品放入凯氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，以免被 检样消化不完全，使结果偏低。
c.样品中若含脂肪或糖较多,消化过程中易产生大量 泡沫,为防止泡沫溢出瓶外,在开始消化时应用小 火加热,并时时摇动。
d.当样品消化液不易澄清透明时,可将凯氏烧瓶冷却, 加入30%过氧化氢2-3mL后再继续加热消化.
第六章 蛋白质定量和定性分析
(Qualitative and quantitative analysis of protein)
本章内容
第一节 蛋白质含量测定 第二节 蛋白质分子量的测定 第三节 蛋白质纯度分析 第四节 糖蛋白中糖含量分析 第五节 蛋白质序列分析 第六节 生物质谱技术与蛋白质鉴定
第一节 蛋白质含量测定
二 蒸馏器清洗
图中所示的蒸馏器使用方法如下:
开放自来水龙头,使水从E进入G, 从K流出,(水不宜开得过大以免水 从G溢出).开放P3使水进入A,从漏 斗D中加蒸馏水约10ml入B,用拇指 将G管口掀紧.同时开放P1则B中水 从Y型管中冲出.随后A中水经K流 出.一般情况下,如此重复洗涤两次 即可.若蒸馏器内有氨存在,则应加 入5ml蒸馏水和30%NaOH溶液2ml 后蒸馏一次方可使用.
试样中蛋白质的含量=(V1-V2) ×HClmol/L× 0.014× 20× 6.25×100% /W
V1:滴定试样时用去的HCl的ml数 V2:滴定空白时用去的HCl的ml数 mol/L:HCl的摩尔浓度 W:试样的重量 0.014:氮的毫摩尔 6.25: 氮换算成蛋白质的系数 20: 稀释倍数
e.一般消化至透明后,继续消化30min即可,但对于含有 特别难以消化的氮化合物的样品,如赖氨酸、组氨 酸、色氨酸等时,需适当延长消化时间.有机物如分 解完全,消化液呈蓝色或浅绿色,但含铁量多时,呈较 深绿色.
3. 再用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCl消耗的量计算 出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。
(NH4)3BO3 + 3HCl→3NH4Cl + H3BO3
实验试剂与仪器
实验试剂 • 浓硫酸 • 硫酸钾（提高沸点）沸点由330℃提高到400℃加
速了消化过程。 • 硫酸铜 （催化剂） • NaOH溶液(30%) • 硼酸溶液(2%) • 盐酸标准溶液（0.01 mol/L ） • 指示剂 :溶于95%乙醇的0.1%溴甲酚绿溶液10ml和
4 、用电炉加热,待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起 计时,继续蒸馏5min,然后将锥形瓶放低,使M管离开液面再 蒸馏2min,最后用蒸馏水洗导管外壁.取出锥01mol/LHCl滴定锥形瓶内溶液至淡紫色或灰色为止, 记录滴定所用HCl的量
五、蛋白质含量的计算
蛋白质含量 = 含氮量×6.25
（二）实验原理
1. 有机物中的氮在强热和CuSO4、浓H2SO4 作用下，消化生成 (NH4)2SO4
含氮有机物+H2SO4→(NH4)SO4 +CO2+H2O+‥‥
2. 在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于 H3BO3 溶液中。
(NH4)SO4 +NaOH→Na2SO4+2NH3·H2O NH3·H2O-蒸馏→NH3+H2O NH3+H3BO3→(NH4)3BO3
一、微量凯氏定氮法
一、原理
蛋白质的主要组成元素C,H,O,N,S，各种蛋白质中含氮量 恒定在13%-19%，平均为16%。每100克蛋白质中含氮约为16 克。而且生物组织中的氮主要存在于蛋白质中，因此测定生 物组织中的氮含量可计算出蛋白质含量。
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热 消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后 碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴 定，根据酸的消耗量乘以换算系数计算出蛋白质含量。
A为蒸气发生器,P3为其进水开关,B为蒸馏室,与出气管 M相通,H为装有定量酸液的锥形瓶,B有Y型管,一端与A相 通,另一端经P4与漏斗D相连,可经此将样品及试剂加入B,F 为指形冷凝管,E为进入管,水经F,G,K而流出,蒸馏时B装进 消化好的样品及NaOH,二者反应生产氨,A因加热而产生的 水蒸气经Y管进入B,将氨一起带出,经M管进入锥形瓶中被 酸吸收,蒸汽经冷凝管F周围被冷却,便于被酸液吸收
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法
目前常用的有四种古老的经典方法:定氮法, 双 缩 脲 法 (Biuret 法 ) ， Folin- 酚 试 剂 法 (Lowry 法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍 使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法 (Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏 度高，比紫外吸收法高10-20倍，比 Biuret 法 高100倍以上。凯氏定氮法比较复杂，但较准 确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方 法的标准蛋白质。
三 氨的吸收
1 、蒸馏器洗净后,从G加入小瓷片数粒,开放水龙头和P3使 瓷片随水流入A,水放至A球颈处即可.
2 、取150ml锥形瓶,加入2%硼酸20ml(内加2~3滴混合指示 剂),将锥形瓶置于M下并使管口接触至硼酸溶液底层.
3 、准确吸取稀释消化液5ml,由漏斗D注入蒸馏器,少量蒸 馏水冲洗漏斗,加入30%NaOH约5ml,再用少量蒸馏水冲洗, 夹紧螺旋夹并水封,使氨气不会从漏斗处流失.
溶于95%乙醇的0.1%甲基红2ml混合而成。
凯氏定氮装置
自动凯氏定氮仪
(三)、实验步骤
一、 消化
称取样品0.5~1g，置于凯氏烧瓶内，不使沾染瓶颈.加入 1gK2SO4,0.5gCuSO4及6ml浓H2SO4，在通风橱内的消化炉上 加热，先用小火,待水分蒸发完后,可用较大的火焰.消化到瓶 内溶液呈透明的蓝绿色为止,但要瓶内无黑点,有则需要瓶内 溶液把它冲洗下去,再加热至澄清为止. 冷却，转入100ml容 量瓶中，以少许蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中， 加水至刻度，摇匀。