细粒棘球蚴延伸因子-1基因的克隆,测序及特性分析3

文章编号:1001-5949(2005)08-0510-03・论　著・细粒棘球蚴延伸因子-1基因的克隆、测序及特性分析3王　健,赵嘉庆,王娅娜,丁淑琴,赵　巍 [摘要]　目的　对细粒棘球蚴(E.granulosus)翻译延伸因子(translation elongation factor)EF-1基因片段进行分子克隆及序列分析。

方法　从细粒棘球蚴原头蚴中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴EF-1基因片段,与p GE M-T载体重组并转化E.C oli JM109,经筛选扩增获得重组基因克隆,再进行序列测定和分析。

结果　成功构建了EF-1/p GE M-T/JM109克隆体系,测序表明该基因开放阅读框为693bp,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为99%,推导编码氨基酸序列同源性为99%。

结论　扩增获得的基因片段可能为细粒棘球蚴(E.granu2losus)翻译延伸因子EF-1基因片段。

[关键词]　棘球蚴病;基因,结构;克隆,分子;序列分析[中图分类号]　R532.32 [文献标识码]　ACloning and sequence analyzing of the EF-1gene from echinococcus granulosus of m ankind WANG Jian,ZH AO Jia-qing,WANG Ya-na,et al.(Ningxia Med.C oll.,Y inchuan750004,China)Abstract　Objective　T o obtain and analyze sequence EF-1gene,and lay bases for screening candidate antigen of echinococcus granulosus.Methods　T otal RNA was extracted from protoscoles of cysts from humam.The specific primers were designed according to published nucletid sequence in the genbank database.The EF-1gene of echinococcus granulosus was amplified by RT-PCR and cloned into p GE M-T vector for sequencing and analyzing.R esults　A cDNA sequence with an open reading frame of693bp has been amplified success fully by RT-PCR.C omparision of the DNA and amino acid sequence deduced from cDNA with the published EF-1gene sequence of echinococcus granulo2 sus in the genbank revealed99%identity samely.Conclusion　Because the EF-1play an importante role in energy metabolism of E.granulo2 sus,EF-1gene gained from protoscoles can be used as candidate antigene gene to develope vaccine and its biological functions studying.K ey w ords　Echinococcosis;G enes structural;Cloning molecular;Sequencing 细粒棘球蚴病又称包虫病,是世界上许多国家影响人类健康和经济发展的重要人兽共患病之一。

在我国25个省(市、自治区)有包虫病的流行,西北五省区为主要流行区,人群患病率在0.6%- 4.5%之间1。

目前包虫病治疗主要以药物和手术治疗方法为主,由于药物和手术治疗存在复发率高等缺点,使得包虫病难以得到有效的根治2。

随着分子生物学技术的发展,国内外积极开展对寄生虫疫苗的研究,并已取得了可喜的进展3。

本研究旨在获得E.gran2 ulosus EF-1基因片段对其基因的结构特点及同源性进行分析,为进一步开展的重组抗原研制工作打下基础。

1　材料与方法1.1　材料1.1.1　细粒棘球蚴原头蚴的收集:从宁夏医学院附属医院包虫病患者手术摘除的完整包囊,无菌条件　3国家自然科学基金项目(项目编号:30260105)　[作者单位]宁夏医学院,宁夏银川750004　[作者简介]王健,男(1965-),宁夏籍,汉族,主管药师,从事分子疫苗研究。

下抽取囊液,分离原头蚴,经P BS(pH7.2)3次洗涤后,-85℃保存。

1.1.2　质粒与菌种:p GE M-T质粒载体购自Promega 公司。

E.coli JM109由本室保存。

1.1.3　酶与试剂:限制性内切酶BamHI、NotI、X-gal、IPTG、RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒均购自Promega公司,DNA回收试剂盒、200bpDNA和Lamb2 daDNA/hindⅢMarker购自北京华美公司。

1.1.4　RT-PCR引物:通过互连网G eneBank中检索的细粒棘球蚴EF-1基因序列设计一对引物: PrimerI:5’ATGG ATCCATGG AGTCGG CGTACATG CG3’ PrimerⅡ:5’GTG CGG CCG CTTACAGTTTGTTAAAGG AAG3’为了便于亚克隆,在引物1和引物2的两端分别引入了一个BamHI和Not I酶切位点。

引物由北京三泰兴隆科技公司合成。

1.1.5　仪器设备:PCR仪(美国BI O RAD),超低温冰柜,超净工作台,电泳仪,凝胶成像分析系统,低温高速离心机,恒温培养箱,纯水仪,电子分析天平,高速匀浆器,热压消毒器,恒温干燥箱。

1.2　方法1.2.1　细粒棘球蚴原头蚴总RNA的提取:取冻存的原头蚴200mg,按试剂盒说明抽提总RNA。

1.2.2　逆转录聚合酶链反应(RT-PCR):其方案为: 5×Bu ffer10μl,10mm ol/L dNTP1μl,25mm ol/L MgS O4 2μl,AM V1μl,T fI1μl,引物1和引物2各2μl,RNA2μl, DEPC水29μl。

反应条件为:48℃45min,94℃2min; 94℃30s,60℃p GE M-T连接载体1min,68℃2min,40个循环;68℃7min。

待反应结束后,通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

1.2.3　PCR产物的纯化:用DNA胶回收试剂盒回收琼脂糖凝胶中的PCR产物。

1.2.4　扩增片段/p GE M-T/JM109的构建纯化的目的DNA与p GE M-T载体在T4连接酶的作用下,4℃连接过夜。

连接产物转化入E.coli JM109感受态细胞,将其涂布于预先铺有IPTG和X-gal的Y T(含AMP)平板上,37℃培养过夜4。

1.2.5　重组质粒的鉴定:经蓝白斑筛选,挑选白色菌落扩增培养,碱裂解法提取重组质粒,用BamHI和Not I酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.6　序列测定及分析:扩增片段重组质粒的序列测定由大连宝生物公司进行,将测序结果在NC BI/ G enBank数据库进行blast比较和分析。

2　结果2.1　EF-1基因的扩增:RT-PCR扩增出特异性基因片段,大小约为693bp,与预期结果一致,见图1。

1.EF-1基因扩增产物 M.DNA M arker图1　EF-1基因RT-PCR扩增产物2.2　扩增片段/p GE M-T/JM109重组DNA克隆体系的构建及鉴定:PCR产物与p GE M-T载体连接,构建了扩增片段/p GE M-T/JM109重组质粒克隆体系。

经酶切鉴定,得到了大小约为693bp的DNA片段,见图2。

2.3　EF-1基因序列的测定及分析:测序结果表明该基因开放阅读框为693bp,经同源性比较发现,与已发表的EF-1基因(G enBank序列号:AF093621)核苷酸序列相比,有4个碱基的不同,同源性为99%,见图3,推导编码氨基酸序列有4处不同,同源性为99%,见图4。

证明该片段为细粒棘球蚴的EF-1基因片段。

M1.DNA M arker　mbdaDNA/H indⅢ1.未酶切重组质粒2.双酶切重组质粒3.EF-1基因RT-PCR扩增产物4.p GE M-T空质粒图2　扩增片段/p GE M-T重组质粒的酶切鉴定2.4　推测氨基酸序列分析及同源性比较:测序鉴定的目的基因序列在Internet上的G enebank/Blast进行氨基酸序列的比较分析。

结果表明肽链由244个氨基酸残基组成,与已发表序列相比有4处氨基酸组成不同,同源性为98%。

3　讨论近年来,基因工程疫苗在病原生物学中的研究取得了很大进展。

并且在疟疾病和日本血吸虫病疫苗研究中取得了可喜的成绩。

但是对包虫病来说,基因工程疫苗的研究起步较晚,研究水平相对滞后。

为了进一步开展包虫病基因工程重组疫苗的研究,寻找适宜的抗原候选基因是一项最基本的工作。

EF-1是一种在细胞内普遍存在且大量表达的多聚体核糖体蛋白质,在基因表达的翻译过程中起重要作用5。

EF-1可能由α、β、γ、δ四个亚基组成。

其中EF-1α属于G蛋白家族,它和氨酰tRNA、G TP 一起组成复合体,通过正确的识别mRNA上的密码子和tRNA上的反密码子,负责转运氨酰tRNA到80S 核糖体,并具有低水平G TP酶的活性。

EF-1β具有鸟甘酸交换活性,在EF-1α从核糖体离开并且构象由G DP形式变成G TP准备与新的AA-tRNA相互作用的过程中,需要EF-1β作为一种催化剂。

EF-1γ常与EF-1β形成复合物,具有增加后者鸟甘酸交换的功能。

至少在脊椎动物中,EF-1还有第四个亚基EF-1δ,尤其在其羧基端与EF-1β具有同源性,而在氨基端无同源性,表明它们可能具有不同的功能。

Query :RT -PCR 扩增片段　Sbjct :G eneBank 发表序列图3　EF -1核苷酸同源性比较Query :推测氨基酸序列　Sbjct :G eneBank 发表序列图4　EF -1氨基酸同源性比较 本研究利用生物信息学技术通过Internet 检索到G eneBank 发表的细粒棘球蚴基因序列,通过RT -PCR 方法扩增出一个693bp 的基因片段,并且成功构建了扩增片段/p GE M -T/JM109克隆体系。