G蛋白在暗调控气孔运动中的作用

G蛋白在暗调控气孔运动中的作用摘要：通过药理学试验和暗诱导调控的蚕豆叶片气孔运动变化分析，来证明异源三聚体gtp-结合蛋白（g蛋白）参与暗诱导的气孔关闭过程。

结果表明，百日咳毒素能够阻止暗诱导的气孔关闭，而该效应同样可被h2o2清除剂维生素c、过氧化氢酶所实现。

表明暗中活化的g蛋白水平较高，g蛋白与h2o2共同在暗诱导的气孔关闭中作为信号分子参与其中。

关键词：g蛋白；气孔运动；信号转导中图分类号：q513+.1；q945.19；q67 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）04-0840-02role of g protein in darkness-regulated stomatal movement zhang yuan-hua（college of chemistry and life sciences， weinan normal university， weinan 714000， shaanxi， china）abstract： by pharmacological approach and stomatal analysis， the role of heterotrimeric gtp binding protein （g protein） in darkness-regulated stomatal movement in vicia faba l. was explored. it was showed that ptx blocked stomatal closure in darkness， which could also be modulated by h2o2 scavenger vitamin c and catalase， indicating that activated g protein was at high level in darkness； and both g protein and h2o2 acted as signal molecular in the darkness-inducedstomatal movement. key words： g protein； stomatal movement；signal transduction异源三聚体gtp-结合蛋白（heterotrimeric gtp binding protein）简称g蛋白，由α、β及γ3个亚基构成，是真核细胞中一种参与多种信号传递的重要分子开关[1]。

研究证明，α亚基通过构象改变使三聚体解离，从而调控下游的效应器，产生第二信使，进而引发胞内相关基因的表达，最终诱导细胞完成生理生化反应；并在一定条件下再度结合β与γ亚基，形成非活性的三聚体g蛋白[2]。

研究表明，g蛋白除了参与视觉、味觉、嗅觉形成及激素、神经递质等多种信号转导途径外，还参与植物的离子通道调控、种子萌发、花粉管伸长等生理过程，并介导植物细胞对植物激素的响应[3，4]；然而g蛋白是否参与暗诱导调控的气孔运动以及是否存在与其他信号分子的相关联系尚不得知。

针对上述问题进行了药理学试验，并初步探讨了暗诱导调控的气孔运动变化，以期为深入揭开植物气孔运动中的机理及认识信号分子间的关系奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料选择选取大小一致、子粒饱满的蚕豆（vicia faba l.）种子，用0.1%的hgcl2灭菌15 min，自来水冲洗干净后浸泡24 h，然后在25 ℃人工气候箱中催芽3～4 d，待胚根长至1 cm时播种于盛有湿沙的瓷盘中并放入温室中培养；温室培养条件为光/暗周期14 h/10 h、光照强度300 μmol/（m2·s）、温度白天25 ℃黑夜18 ℃、空气相对湿度75%。

幼苗生长期间每天浇水1次，无任何水分胁迫。

待幼苗生长至3～4周龄时，取其茎顶端完全展开的第一对叶片作为供试材料。

1.1.2 药品试剂及仪器 g蛋白激活剂霍乱毒素（cholera toxin，ctx）、百日咳毒素（pertussis toxin，ptx）均购自美国sigma公司；缓冲液组分吗啉乙磺酸[2-（n-morpholino）ethanesulfonic acid，mes]也购自美国sigma公司；h2o2清除剂过氧化氢酶（catalase，cat）和维生素c及其他试剂为国产分析纯。

仪器主要是nikon te 300倒置荧光显微镜，购自日本尼康映像仪器销售（中国）有限公司。

1.2 药理学试验参照mcainsh等[5]的方法，取蚕豆植株顶端生长良好、完全展开的第一对叶，撕取其下表皮（避开叶脉），然后置于mes-kcl缓冲液（mes 10 mmol/l，kcl 50 mmol/l，ph 6.15）中。

用干净毛刷刷去残存的叶肉细胞，再将其分割成面积约0.5 cm×0.5 cm大小的表皮条块。

然后将新鲜表皮条块置于不同浓度的g蛋白激活剂ctx、ptx和h2o2清除剂维生素c及cat溶液中，在25 ℃、空气相对湿度80%的培养箱中进行暗处理（暗诱导）。

所用ctx和ptx的溶液浓度梯度依次为0（ck）、100、200、300、400、500 ng/ml，维生素c的溶液浓度梯度依次为0（ck）、10、50、100、200 μmol/l，cat的溶液浓度梯度依次为0（ck）、10，50，100，200 munit/ml。

在限定时间内于显微镜下用测微尺测量叶片气孔孔径（μm）。

测量时每处理每次随机选取5个视野，每个视野随机选取6个气孔。

均重复3次（n=90），所得数据以“均值±标准误”表述，并进行差异显著性分析。

2 结果与分析2.1 霍乱毒素对暗处理的叶片气孔开度的影响不同浓度霍乱毒素溶液对暗处理的蚕豆叶片气孔开度影响结果见图1，由图1可见，试验设定的霍乱毒素溶液浓度梯度对蚕豆叶片暗处理的气孔开度的影响不大，只在300 ng/ml以上的溶液浓度里引起很小的气孔关闭，且处理浓度间差异不显著（p>0.05），说明霍乱毒素活化的g蛋白对暗诱导的气孔运动没有显著影响。

2.2 百日咳毒素对暗处理的叶片气孔开度的影响不同浓度百日咳毒素溶液对暗处理的蚕豆叶片气孔开度影响结果见图2，由图2可见，与对照相比，各百日咳毒素溶液浓度均对蚕豆叶片暗处理的气孔开度产生了影响，而且差异显著（p0.05），但大于这些浓度的维生素c溶液和过氧化氢酶溶液均能对暗处理的气孔关闭产生影响，而且差异显著（p<0.05）。

这个结果表明，暗处理后保卫细胞自发产生的h2o2能显著被维生素c和过氧化氢酶清除掉一部分。

考虑到百日咳毒素对暗诱导气孔关闭的影响，我们有理由相信g蛋白与h2o2之间存在某种直接或者间接的信号联系。

3 讨论g蛋白在动物和微生物的信号转导途径中起着重要作用，而且目前已有很多证据表明植物中也存在g蛋白。

研究表明，g蛋白在叶片气孔运动中参与调控胞外钙调蛋白（calmodulin，cam）刺激花粉的萌发和诱导不依赖光照的编码1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（rubisco）小亚基的基因（the small subunits of ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，rbcs）表达的过程[4]。

g蛋白激活剂霍乱毒素及gtp非水解类似物[guanosine-5′-（γ-thio）triphosphate，gtpγs]能抑制k+内流，gtpγs的作用可被胞质ca2+降至较低水平[6，7]。

百日咳毒素在不饱和光照下促进气孔开放且g蛋白参与胞外cam信号转导，在游离钙离子浓度[（ca2+）cyt]上游起作用以及产生h2o2[8-10]。

本试验结果表明，在暗诱导气孔开度的过程中，g蛋白作为信号分子参与其中，较小浓度的百日咳毒素溶液就能诱导气孔运动。

这个结果提示我们暗诱导的气孔开度与g蛋白的活化有关，因而在一定范围内，由暗诱导激活的g蛋白水平相对较高，故对暗处理的霍乱毒素激活的g蛋白表现不敏感。

进一步的研究表明，h2o2清除剂维生素c和过氧化氢酶能够阻止暗诱导的气孔开度，而该效应与g蛋白激活剂百日咳毒素的效果一致，说明h2o2与g蛋白之间存在一定的联系，二者都可能处于暗诱导气孔开度的信号通路中。

chen等[9]的研究发现，在胞外cam诱导的气孔运动中，霍乱毒素可诱导促进拟南芥[arabidopsis thaliana（l.）heynh.]保卫细胞内h2o2的生成。

结合本试验的结果，不难看出蚕豆保卫细胞中h2o2可能作为g蛋白的下游信号分子在调控气孔运动。

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