抗原与蛋白偶联方法
BSA蛋白偶联多肽技术
1．1．1多肽合成按照多肽合成常规操作，合成来源于上海楚肽生物科技有限公司（Apeptide CO.,Ltd.) HPLC检测纯度为95%。
多肽C端增加的半胱氨酸残基用于以其巯基连接于偶联剂上。
1．1．2 合成多肽与载体的偶联载体蛋白选择BSA（Roche公司），用SPDP（PIERCE公司）连接法将合成的多肽与BSA进行偶联：4.6mgSPDP溶解于740ulDMSO，终浓度为20mM。
0.1008gBSA溶解于2ml PBS-EDTA溶液中，室温静置1h。
HiTrap TM Deaslting column脱盐柱洗脱多余的SPDP。
4mg多肽加入偶联好的BSA-SPDP体系中室温过夜。
1．1．3 抗多肽抗体的制备选体重1. 5～2 kg的健康雄性新西兰大白兔，按常规操作卡介苗活化其免疫系统。
将偶联的BSA-多肽过滤除菌，100mg（2ml）加等体积的不完全佐剂，充分混悬。
在新西兰大白兔背部多点皮下注射，4周后加强免疫，其后每隔2周进行1次加强免疫，注射途径与初次免疫相同，共两次后，检测效价。
耳源静脉采血、分离血清。
1．1．4 多肽抗体的纯化Protein G柱分离纯化IgG抗体：PBSpH7.4平衡Protein G亲和柱，以0.1M Gly-HCl pH3.0洗脱，PBSpH7.4透析，分装，-20℃保存。
1mM预冷的HCl充分膨胀Sepharose 4FF（GE公司）后，15个体积的1mMHCl清洗去残留的蔗糖，每次清洗2min。
偶联缓冲液0.1MNaHCO3 pH8.3 0.5M NaCl平衡2次。
多肽溶于偶联缓冲液，调节pH值到pH8.3后，加入凝胶，室温混旋3h。
加入1M预冷的乙醇胺混旋2h阻断未偶联上的活化位点。
50mM Tris-HCl pH8.0，1MNaCl 溶液与50mM Gly-HCl pH3.5，1M NaCl 交替清洗8次。
PBS缓冲液平衡10倍体积。
装柱，平衡，上样后以0.1MGly-HCl pH2.2洗脱，PBS透析，分装，-20℃冻存。
蛋白交联(参考资料)
蛋白质交联方法及其应用蛋白质交联系指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质(如酶、蛋白毒素等)以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物、抗体导向药物和免疫毒素等。
随着放射免疫分析法、酶标免疫技术、载体药物学和导向物学的发展，蛋白质交联技术的方法和手段也不断改进和完善，并且在生物学和医学领域得到愈来愈广泛的应用。
蛋白质交联方法首先发展于人工抗原的制备研究。
自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质(半抗原)如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体大分子共价结台；使其具备抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。
为了使放射免疫分析达到灵敏度高、特异性强的要求，前人对半抗原和蛋白质连接的方法进行了大量的研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法及卤代硝基苯法等交联技术。
近10多年来发展起来的酶标免疫检测技术，要求制备保持酶的生物活性和抗体的免疫结合活性的酶—抗体偶合物。
常用的交联方法如戊二醛法、碳二亚胺法和混合酸酐法不可避免地要产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使交联效率降低、结合物活性减弱。
为了克服这一不足，人们发展了异型双功能交联试剂，如N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2吡啶基二硫)—丙酸酯，以实现控制交联，提高交联反应的选择性和交联产物的均一性。
将药物与大分子载体连接，制备药物一载体结合物，以改善和控制药物在体内的转运和代谢，实现缓释给药和定向给药，提高生物利用度和治疗指数。
这是现代药物研究领域一个崭新的分支。
载体药物必须能够在体内定量、定位释放原型药物，因此要求设计pH敏感或特定酶敏感的偶联键。
导向药物的发展对蛋白质交联方法提出了更高的要求。
早在1906年，Ehrlich就提出了靶向给药的设想。
随着生物医学的发展，这一设想不断得到具体的实现。
单克隆抗体作为导向载体的出现，更使导向药物的研究成为当代药物研究中最活跃和最引人注目的领域之一，而其中研究得最广泛的是肿瘤治疗的抗体导向研究。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
ELISA原理和实验
ELISA原理和实验ELISA的原理基于免疫学和酶学的原理。
它利用抗原与抗体之间的高度专一性和互相结合的性质，通过将抗原或抗体固定在固相（如微孔板）上，再加入未标记或标记有酶的抗体或抗原，利用酶反应可见色素形成的特性来测定目标物的存在和浓度。
直接ELISA是一种简单的ELISA方法，直接测定样品中的抗原。
首先，在微孔板上涂覆纯化的抗体，使其与微孔板表面结合。
然后，将含有抗原的样品加入微孔板孔中，抗原与涂覆的抗体结合。
接下来，加入与抗原特异性结合的抗体（通常是与酶标记物共偶联的抗体），洗涤掉非特异性结合物质，并使抗原与酶标记物的抗体发生结合。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定抗原的存在和浓度。
间接ELISA是一种常用的ELISA方法，用于检测抗体。
首先，在微孔板上涂覆纯化的抗原或蛋白质，使其与微孔板表面结合。
然后，加入样品，例如患者血清，其中包含待测抗体。
接下来，加入与待测抗体特异性结合的抗体（通常是与酶标记物共偶联的抗人或抗动物IgG抗体），洗涤掉非特异性结合物质。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定抗体的存在和浓度。
竞争ELISA也称为抗原饱和法，用于测定溶液中的抗原。
首先，在微孔板上涂覆纯化的抗体，使其与微孔板表面结合。
然后，加入含有已知浓度的抗原的样品溶液和待测抗原样品溶液，它们将竞争与涂覆的抗体结合。
接下来，加入与该抗原特异性结合的抗体（通常是与酶标记物共偶联的抗体），洗去未结合的抗体。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定待测抗原的存在和浓度。
夹心ELISA是一种用于检测特定抗原的双抗体夹心法。
首先，在微孔板上涂覆特异性抗体，使其与微孔板表面结合。
然后，加入待测样品，使其与固定的抗体结合。
接下来，加入另一种特异性抗体（通常与酶标记物共偶联的抗体），使其与抗原结合。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定抗原的存在和浓度。
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III 液）4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、??4度搅拌12小时7、??静置10小时（4度）8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L 的溶液。
生物素偶联抗体原理
生物素偶联抗体原理引言：生物素偶联抗体技术是一种常用的生物化学和分子生物学实验技术，用于检测和定位特定分子在细胞或组织中的位置。
本文将介绍生物素偶联抗体的原理及其在实验中的应用。
一、生物素偶联抗体的原理生物素偶联抗体技术是利用生物素与生物素结合蛋白（biotin-binding protein）的高度特异性结合来实现的。
生物素与生物素结合蛋白之间的结合非常紧密，形成了极为稳定的化学键。
因此，将生物素偶联到抗体分子上，可以通过与生物素结合蛋白的结合，实现对目标分子的检测和定位。
生物素偶联抗体的制备可以通过多种方法实现，最常见的方法是利用偶联剂将生物素与抗体分子进行共价结合。
偶联剂通常是活化的生物素分子，可以与抗体上的氨基或硫基发生化学反应，形成共价键。
这样，生物素就被牢固地连接到抗体上，形成生物素偶联抗体。
二、生物素偶联抗体的应用生物素偶联抗体技术在生物学和医学研究中得到了广泛应用，主要包括以下几个方面：1. 免疫组织化学（IHC）：生物素偶联抗体技术可以用于在组织切片中检测和定位特定抗原的表达。
通过将生物素偶联抗体与组织切片中的抗原特异性结合，再利用生物素结合蛋白与生物素的结合，可以通过染色或荧光标记的方法，可视化目标抗原在组织中的位置。
2. 免疫印迹（Western blot）：生物素偶联抗体技术也可以用于检测和定量目标蛋白在细胞或组织中的表达水平。
通过将生物素偶联抗体与目标蛋白结合，再利用生物素结合蛋白与生物素的结合，可以通过化学发光或荧光检测方法，定量目标蛋白的表达水平。
3. 免疫沉淀（Immunoprecipitation）：生物素偶联抗体技术可以用于纯化目标蛋白及其与其他蛋白的相互作用。
通过将生物素偶联抗体与目标蛋白结合，再利用生物素结合蛋白与生物素的结合，可以将目标蛋白及其结合蛋白从混合物中特异性地沉淀下来，实现对蛋白的纯化。
4. 免疫染色（Immunostaining）：生物素偶联抗体技术可以用于检测和定位细胞表面或内部蛋白的表达。
《蛋白质连接技术》课件
重组蛋白
通过基因工程技术将两个或多个蛋白 质基因连接起来，在大肠杆菌或酵母 等微生物中表达，得到连接的重组蛋 白。
蛋白质连接技术的应用领域
蛋白质结构研究
通过蛋白质连接技术可以研究 和了解蛋白质的结构和功能关 系，进一步用蛋白质连接技术可以设计 和构建新的蛋白质药物或蛋白 质导向药物，用于治疗疾病。
02
基因工程技术连接蛋白质的方法 包括基因克隆、基因表达和蛋白 质纯化等步骤，可以用于制备具 有特定功能的蛋白质。
化学合成法连接蛋白质
化学合成法连接蛋白质是指通过化学 合成的方法将氨基酸序列不同的蛋白 质进行连接。
化学合成法连接蛋白质的方法包括固 相肽合成、多肽缩合、肽段连接等步 骤，可以用于制备具有特定序列和功 能的蛋白质。
生物传感器
将不同的蛋白质分子连接起来 制备生物传感器，用于检测生 物样品中的物质。
生物催化
将酶和其他蛋白质分子连接起 来制备生物催化剂，用于催化
化学反应。
02
蛋白质连接技术的基本原理
蛋白质的化学结构与性质
蛋白质由氨基酸组成，具有复 杂的空间结构。
蛋白质的性质包括稳定性、可 溶性、生物活性等，这些性质 与蛋白质的结构密切相关。
蛋白质连接的效率是 指连接反应的速度和 产物的纯度。
提高连接效率和选择 性是蛋白质连接技术 的关键。
选择性是指连接反应 具有高度的专一性， 能够区分不同的蛋白 质分子。
03
蛋白质连接技术的方法与步骤
基因工程技术连接蛋白质
01
基因工程技术连接蛋白质是指通 过基因工程技术将蛋白质的编码 基因进行重组，实现蛋白质的连 接。
蛋白质连接技术经历了从传统化学方 法到现代基因工程方法的演变，具有 越来越广泛的应用前景。
半抗原与蛋白质偶联技术课件
录
• 半抗原的介绍 • 蛋白质偶联技术的介绍 • 半抗原与蛋白质偶联的方法 • 偶联效果的评估 • 实例展示
01
半抗原的介绍
半抗原的定义
半抗原
是指那些能够与抗体结合，但没 有免疫原性的小分子物质。
半抗原的特点
具有反应原性，即能够与抗体结 合的特性，但本身不具有免疫原 性，不能诱导机体产生免疫应答 。
蛋白质偶联技术的应用
蛋白质偶联技术在免疫分析、 生物传感器、抗体药物等领域 具有广泛的应用。
通过将半抗原与蛋白质载体进 行偶联，可以制备出具有特定 功能的免疫分析试剂，用于检 测生物样品中的目标物质。
此外，蛋白质偶联技术还可以 用于制备抗体药物和生物传感 器，以治疗疾病和监测环境中 的有害物质。
03
荧光标记法
利用荧光标记技术检测偶联产物的荧光强度，通过与标准品比较，判断偶联产 物的活性。
偶联产物的稳定性检测
热稳定性检测
通过加热处理偶联产物，观察其稳定性和热失活情况，以评 估偶联产物的热稳定性。
储存稳定性检测
将偶联产物在不同温度和湿度条件下储存，定期检测其活性 变化，以评估偶联产物的储存稳定性。
偶联产物的活性检测
通过生物学实验验证偶联产物是否保 持了原有蛋白质的生物学活性，如细 胞增殖、信号转导等。
实际应用中的实例
肿瘤免疫治疗
利用半抗原与蛋白质的偶联技术制备肿瘤免疫治疗药物，通过激活患者自身的免疫系统 来攻击肿瘤细胞。
疫苗研发
将半抗原与病毒或细菌的蛋白质结合，制备出具有免疫原性的疫苗，用于预防传染病。
碳二亚胺法
总结词
一种高选择性的偶联方法，通过形成稳 定的酰胺键将半抗原偶联到蛋白质上。
VS
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抗原与蛋白偶联方法常用的半抗原与蛋白偶联方法EDAC：EDC是一种羧基和氨基反应零长度交联剂。
EDC和与羧基反应形成氨基活化的O酰基异脲中间体，他可以迅速与氨基反应形成酰胺键，释放异脲副产物。
该媒介在水中不稳定，因此两步共轭反应依赖N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)稳定结构。
和氨基失败的反应导致媒介水解，羧基再生，释放N 代尿素。
副反应形成N酰基脲，这通常限制羧基定位蛋白的疏水区。
EDC用于偶联半抗原到载体蛋白原料：1.载体蛋白：2mg牛血清白蛋白BSA，卵白蛋白OV A或血蓝蛋白Keyhole limpet hemocyanin KLH2.偶联缓冲液：0.1M MES，pH4.5-53.EDC：10mg4.Hapten：1-2mg5.脱盐柱或凝胶过滤柱5-6KD阻隔。
操作步骤：1.平衡EDC到室温，加入2mg的BSA、OVA或KLH到200ul偶联缓冲液，如果用热电的载体蛋白用无菌水溶解。
2.溶解2mg多肽或半抗原到500ul偶联缓冲液加入200ul载体蛋白中。
3.对BSA或OVA结合，溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加100ul(1mg EDC)该溶液到载体-多肽溶液中。
对KLH结合溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加50ul(0.5mgEDC)该溶液到载体-多肽溶液中，如果发生沉淀进一步减少EDC用量。
4.室温反应2小时。
用脱盐柱纯化偶联蛋白，如果存储免疫原数天，无菌过滤储存在无菌容器中4或-20度保存。
用EDC和NHS或Sulfo-NHS两步法偶联偶联蛋白用EDC和Sulfo-NHS活化反应在pH4.5-7.2有效，然而NHS激活或Sulfo-NHS激活的分子具有伯胺在pH7-8时有效。
最好的结果是最初第一步反应在MES缓冲液中(或其他无氨基无羧基缓冲液pH5-6)，接着用磷酸盐缓冲液提高pH7.2-7.5(或其他无氨基无羧基缓冲液)立即与含氨基分子反应。
为了淬灭第一个反应用2巯基乙醇或其他可以容易去除的试剂，用脱盐柱换液。
原料：1.活化缓冲液：0.1M MES，0.5M NaCl，pH6.02.结合缓冲液：3. 24.蛋白1：准备溶解到活化缓冲液中1mg/ml。
5.蛋白2：准备溶解到结合缓冲液中6.NHS或Sulfo-NHS7.2-巯基乙醇8.脱盐柱9.羟胺-盐酸操作步骤：1.开盖前平衡EDC和NHS到室温。
2.加0.4mg EDC(2mM)和0.6mg NHS或1.1mg Sulfo-NHS(5mM)到1ml蛋白1溶液中室温反应15min。
3.加1.4ul的2-巯基乙醇(终浓度20mM)淬灭EDC。
4.可选步骤：用PBS平衡的脱盐柱从超量试剂和灭活的交联剂中分离蛋白。
5.按相同摩尔比加蛋白2到活化蛋白1，室温反应2小时。
6.淬灭反应加入羟胺到终浓度10mM，该方法水解蛋白1上未反应的NHS生成异羟肟酸。
其他淬灭方法包括加20-50mM Tris，赖氨酸，甘氨酸或乙醇胺，然而这些伯胺包含修饰蛋白1的化合物。
7.通过脱盐柱去除多余的淬灭试剂。
（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法(1)5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
(2)1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
(3)10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。
(4)过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。
2、碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤(1) 取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液）(2) 取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)(3) 取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液）(4) 将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml）(5) 室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液(6) 4度搅拌12小时(7) 静置10小时（4度）(8)有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
3、孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法(1) 用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。
(2) 加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。
(3) 用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1)(4) 按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。
（二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联1、芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤(1) 用0.1 mol/L HCl溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。
(2) 滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。
NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。
游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。
(3) 溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。
(4) 用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。
(5) 边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。
(6) 冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0。
(7) 用PBS透析2天(8) -20度保存（浓度为20mg/mL）双功能的酰亚胺酯(imidate esters)可以氨基反应，形成脒。
例如：用二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)将去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)与β-半乳糖苷酶偶联。
2、、应用双功能酰亚胺酯（imidate esters）制备去甲基三正喋呤-与β-半乳糖苷酶标记特的操作步骤(1) 用含5％（W/V）N-乙基吗啉的无水甲醇0.4ml,在室温下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)(A液)(2) 取与β-半乳糖苷酶100 ug, 溶于pH9.9的100 m mol/L碳酸缓冲液（含MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇10 m mol/L 0.1ml(B液)(3) 将A液倒入B液。
(4)20度反应90分钟后，加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-巯基乙醇10 m mol/L、pH7.5的Tris-醋酸缓冲液(50m mol/L) 1ml, 终止反应。
(5)过sephadex G-25, 去除小分子物质，得酶标记物（约75％的酶与半抗原结合，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline )进行偶联，则只有15％的酶与之结合。
（三）含巯基半抗原的偶联可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。
此外，将载体蛋白用溴乙酰胺(bromoacetamide)激活。
或将载体蛋白与半抗原在pH4.0的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。
（四）含羟基的半抗原偶联醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为羧基的操作步骤1、 15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol）,12g 琥珀酸酐(succinic anhydride)和8.7ml 三乙基胺(triethylamime)用100 ml乙酰乙酯溶解。
2、加热回流1小时。
3、减压蒸馏去溶剂，,残余物用5% NaHCO3水溶液溶解。
4、用乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行s酸化（pH到2.0）.5、用水洗涤固形物（为三氯乙基半琥珀酸酯）两次，用氯仿-已烷使其结晶（产量约75％，熔点88-89度）6、取2.5g 半琥珀酸酯溶于6.5ml 亚硫酰氯(thionyl chloride)中，65度加热30分钟。
7、减压蒸发，干燥1小时（高度真空条件下）。
8、将上述产生（2，2，2-三氯忆基琥珀酰氯）溶于15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺(N,N-dimethylethylacetamide)中，室温搅拌反应2小时。
9、 65度真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来（得盐酸化的结晶---5`-酯约84％，熔点160度）。
10、用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离三氯乙酯，得f半抗原-半琥珀酸酯，这样引和的羧基可与蛋白质偶联（如用碳化二亚胺化）。
半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再与蛋白质偶联的操作步骤1、 20mg 腺苷溶于1ml 100m mol/L NaIO4溶液中，4度避光反应30分钟。
2、加1滴乙二醇(得A液)3、将A液加入到β-半乳糖苷酶液（20mg/ml,用150m mol/L NaCl,10m mol/L MgCl2水溶液溶解，用3％K2CO3调节pH至9.0）中4、 4度反应2小时，期间不断调节pH9.05、加入临时配制的50 mg/ml NaBO4溶液，用量为反应体积的1/10。
4度反应过夜。
6、用含有MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇10 m mol/L、NaCl 100 m mol/L的50 m mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)透析(更换透析液数次)（五）含酮基或酮基半抗原的偶联是将酮基经羟胺类化合物处理变成肟类化合物，再进一步将肟类化合物中的羟基，衍变成羧基化合物，再进一步进行含羧基半抗原的偶联操作。
这类羟胺类化合物主要有：氨氧乙酸aminoxy acetic acid 或羧甲氧胺carboxymethoxyl amine 或者盐酸羟胺酮基的类固醇分子中引入羧基的操作步骤1、在200ml 乙醇中，加入O-(羧甲基)羟胺（O-(carboxyl)hydroxylamine）和酮基半抗原，使其浓度分别为10m mol/L 和4m mol/L2、加热回流90分钟3、旋转蒸发，减少容积，然后加水至40ml，用乙醚抽提4、用水洗涤乙醚抽提物，用Na2SO4干燥成白色粉末。