半抗原偶联
人工结合抗原制备
半抗原的 稳定性、 可溶性、 理化特性
偶联效果
缓冲液成 分及其纯 度和离子 强度、
PH
偶联 物的 浓度
偶联物 相对比
例
一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法。
所有的偶联方法都应该是通过羧基或氨基端残基将多肽耦
联到载体蛋白上。
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蛋白偶联方法
• 分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联
mTP 5 mg
cBSA 2.5 mg
EDC·HCl 79 mg充分溶解于
250 μl TE buffer（pH 8.0
）
37 ℃摇床中反应2 h
TE buffer （pH 8.0 ） 250 μl
Sephadex柱
0.5 ml 溶 液在PBS
中透析3 d
透析产物小
剂量分装， 于－20 ℃保 存备用
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人工抗原的质量评定
• 浓度测定
紫外吸收法、福林酚法、双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和 荧光法等。
• 纯度鉴定和结构分析
紫外光谱扫描法 电泳技术鉴定是否达到电泳纯
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谢谢！
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结束语
若有不当之处，请指正，谢谢！
人工结合抗原制备
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20130805
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• 抗原——是指能够刺激机体产生（特异性）免疫 应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞 在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的 物质。
• 抗原的基本特性： ①诱导免疫应答的能力，即免疫原性。 ②与免疫应答的产物发生反应，即抗原性（免疫反
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介Last revision date: 13 December 2020.常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液）4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、4度搅拌12小时7、静置10小时（4度）8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。
关于半抗原偶联载体的方案
关于半抗原偶联载体的方案人工抗原的合成是化学免疫的重要问题，化学免疫研究的对象，除上面提及的药物、毒物、激素外，还有多糖类、神经递质、肽类、核酸及生物体内其它小分子活性物质，总起来说，它们大多都是无免疫原性的半抗原，在对其进行免疫学及其它相关研究时，一方面要通过化学合成的手段，即蛋白质连接技术，经与载体蛋白交联合成制备人工抗原，继而用其免疫动物制备相应的抗体或单克隆抗体，作为研究用的探针；另一方面还必须将此探针用各种标记物进行标记，如本文论及的酶标记，以便用作研究工具；在分子生物学研究中，包括核酸或基因探针的研究及应用，多种类型探针的标记也都将涉及蛋白质连接技术。
半抗原分子量一般较小，其结构及化学功能团的性质多种多样，数量各不相同，在与酶蛋白或载体蛋白进行交联时，必须考虑交联双方的性质、交联剂、交联方法和载体.2．混合酸酐法制备G6PDH(葡糖—6—磷酸脱氢酶)标记利多卡因(Lidocaine．Li)结合物[29] (1)Li—混合酸酐的制备首先将Li经化学修饰(琥珀酸酐法，略)，在其分子中引入羟基(一COOH)，制成Li—COOH(Li一琥珀酸半酯)；然后，将此Li—COOHl0mg(0．0285mm0l)溶于375ul的DMF中，用电磁搅拌混溶。
在一10℃条件下，边搅动边滴入21ul的三乙胺，再缓慢滴入14ul的卡必醇氯甲酸酯，于一10。
C继续搅拌反应1．5小时，此全部过程应保持无水，即获得Li—混合酸酐(Li—MA)。
3．(2)酶——底物溶液的制备在冰浴中，将G6FDH(L．m)lmg用50mmol／LpH8．1Tris—HCl 溶解，同时加入G6P—Na(葡糖—6一磷·酸钠盐)10mg及NADH 3mg(底物一辅酶系统，用于保护酶活性)，使其溶解，随后缓慢加入300ul卡必醇，用2m0l／LNaOH调pH至9．0。
4．(3)G6PDH—Li的交联将酶—底物溶液置于冰浴中，在搅拌条件下，每隔10~15分钟向此酶液中缓慢加入一定量(25ul，50ul，100ul……)的Li—MA溶液，反应10~15分钟后，分别取出反应液5u1测定酶活性及Li半抗原的抗体对标记酶活性的抑制率.直至加入Li—MA的量所引起酶活性的下降程度最低，而抗体对酶活性的抑制率又最高时，此标记过程即完成(表2—8)5．表2—8 G6PDH—Lidocaine交联反应中酶活性变化及抗体抑制率3.碳化二亚胺法(EDC)制备人工抗原4.最近几年，在对无免疫原性小分子物质的化学免疫研究中，采用碳化二亚胺作为交联剂制备合成人工抗原的工作愈来愈多，因为用这种试剂进行交联最为方便，除交联的一方作为载体的蛋白质，具有多个氨基或羧基外，不少小分于化合物也具有此反应基团，或通过化学修饰引入羧基。
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III 液）4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、??4度搅拌12小时7、??静置10小时（4度）8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L 的溶液。
抗原
抗原的T细胞决定基和B细胞决定基
胰高血糖素：N端1-17氨基酸 B细胞识别（抗体） C端18-29氨基酸 T细胞识别（效应T）
T细胞和B细胞抗原表位的特性的比较
表位受体 MHC分子 表位性质
表位大小
表位类型 表位位置
T细胞决定基 TCR 必需
主要是变性多肽
8-12氨基酸(CD8+T) 12-17氨基酸(CD4+T)
* B细胞识别半抗原表位；T细胞识别载体表位。
抗原决定基及抗原结合价
3。抗原结合价：抗原分子上能与抗体结 合的抗原功能性决定基数目。
4。半抗原-载体效应
* 人工抗原（载体-半抗原偶联物）刺激机体 →产生抗半抗原抗体
* B细胞识别半抗原表位；T细胞识别载体表位。
载体效应
（三）共同抗原和交叉反应
* 胸 腺 依 赖性 抗 原（thymus dependent antigen, TDAg）：由B细胞表位和T细胞表位组成，此类抗原诱导 免疫应答需要Th细胞的辅助，绝大多数蛋白抗原属此 类。
* 非 胸 腺 依 赖 性 抗 原 （ thymus independent antigen, TI-Ag）：由B细胞表位组成，此类抗原诱 导免疫应答无需Th细胞辅助，如细菌脂多糖、荚膜多 糖、聚合鞭毛素等。可分为TI-1Ag和TI-2Ag。
• 抗原性(antigenicity) 与抗体或效应Ｔ细胞发生特异性结合的能力。
(二)半抗原(hapten)和载体(carrier)
• 完全抗原：同时具有免疫原性和抗原性的物质。 • 半抗原：仅具有抗原性而无免疫原性的物质。 • 载体：与半抗原结合而赋予其免疫原性的物质。
(三)耐受原(tolerogen)和变应原(allergen)
抗体药物_精品文档
（5）调节人自身免疫系统
※自身免疫疾病从抗体药物的发展中获益巨大，如 TNF-α抗体是迄今最为成功的药物靶点。 ※补体系统具有重要作用，如在系统性红斑狼疮、特 应性皮炎等疾病进展中发挥作用。 ※人自身抗体可能在某些疾病进展中起作用。奥马珠 单抗是第一个靶向自身抗体IgE的抗体药物，用于治 疗哮喘。
抗体药物
Antibody drug
概述
1
5
制备方法 与技术
结构特性
2
3 4
作用靶点 和机制
分类与应用
01 概述
抗体药物——研发现状与发展态势
抗体药物以细胞、基因工程技术为主体的抗体工程技术 进行制备，与靶抗原结合具有高特异性、有效性和安全性， 临床用于恶性肿瘤、自身免疫病等重大疾病，发展迅速，是 当前生物药中复合增长率最高的一类药物。
05
抗体药物制备方法 与技术
噬菌体展示技术
※发展最成熟、应用最广泛； ※基本原理：将蛋白质分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌 体的基因组DNA中，与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白。侵 染宿主细菌，进而复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌 体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与编码蛋白相互作用的 蛋白质。
噬菌体展示技术02 Nhomakorabea抗体药物的结构特 性
※具有功能和结构的双重性 ①数量巨大的结构多样性满足识别不同抗原； ②结构稳定性满足发挥体内效应。
※抗体结构对称，成“Y”字形结构。
1）VH和VL共同组成抗原结合 部位，称为FV，在可变区内 有三个套环，称为互补性决 定去1、2、3（CDR）； 2）CH和CL上具有部分同种异 型的遗传标志； 3）CH可与多种免疫细胞表 面相应受体结合，介导生物 效应。
联 的放射免疫制剂，主要用于复发的淋巴瘤患者或对 物
半抗原与蛋白质偶联技术课件
录
• 半抗原的介绍 • 蛋白质偶联技术的介绍 • 半抗原与蛋白质偶联的方法 • 偶联效果的评估 • 实例展示
01
半抗原的介绍
半抗原的定义
半抗原
是指那些能够与抗体结合，但没 有免疫原性的小分子物质。
半抗原的特点
具有反应原性，即能够与抗体结 合的特性，但本身不具有免疫原 性，不能诱导机体产生免疫应答 。
蛋白质偶联技术的应用
蛋白质偶联技术在免疫分析、 生物传感器、抗体药物等领域 具有广泛的应用。
通过将半抗原与蛋白质载体进 行偶联，可以制备出具有特定 功能的免疫分析试剂，用于检 测生物样品中的目标物质。
此外，蛋白质偶联技术还可以 用于制备抗体药物和生物传感 器，以治疗疾病和监测环境中 的有害物质。
03
荧光标记法
利用荧光标记技术检测偶联产物的荧光强度，通过与标准品比较，判断偶联产 物的活性。
偶联产物的稳定性检测
热稳定性检测
通过加热处理偶联产物，观察其稳定性和热失活情况，以评 估偶联产物的热稳定性。
储存稳定性检测
将偶联产物在不同温度和湿度条件下储存，定期检测其活性 变化，以评估偶联产物的储存稳定性。
偶联产物的活性检测
通过生物学实验验证偶联产物是否保 持了原有蛋白质的生物学活性，如细 胞增殖、信号转导等。
实际应用中的实例
肿瘤免疫治疗
利用半抗原与蛋白质的偶联技术制备肿瘤免疫治疗药物，通过激活患者自身的免疫系统 来攻击肿瘤细胞。
疫苗研发
将半抗原与病毒或细菌的蛋白质结合，制备出具有免疫原性的疫苗，用于预防传染病。
碳二亚胺法
总结词
一种高选择性的偶联方法，通过形成稳 定的酰胺键将半抗原偶联到蛋白质上。
VS
半抗原的作用
半抗原的作用嘿，朋友们！今天咱们来聊聊半抗原这个神奇的东西。
你可别小看它，虽然它就像魔法世界里那些不起眼的小魔药，但是作用那可大着呢！半抗原就像是一个调皮的小捣蛋鬼，自己单独的时候，力量有限得很，就像一个光杆司令，没有自己的军队。
它的分子小得可怜，就像一颗迷你的小星星在庞大的免疫系统宇宙里闪烁，似乎很容易被忽视。
不过，一旦这个小不点找到它的“大靠山”，那就不得了啦。
它就像一个小喽啰搭上了超级反派的战车。
半抗原可以和一些大分子结合，这个时候它就像一个小刺客找到了自己的隐身披风，借着大分子的掩护，开始在身体里兴风作浪。
对于免疫系统来说，半抗原和大分子结合后的这个复合物就像一个伪装成好人的坏蛋。
免疫系统看到这个复合物，就像一个警惕的保安看到了一个拿着奇怪包裹的陌生人，一下子就紧张起来啦。
免疫系统会调动各种防御力量，就像召集一群超级英雄来对付这个突然出现的威胁。
半抗原还像一个狡猾的小骗子。
它引起的免疫反应有时候就像一场闹剧，免疫系统被它骗得团团转。
身体里就像突然爆发了一场小战争，各种免疫细胞忙得不可开交，就像一群消防员在到处灭火。
但是从另一个角度看，半抗原也像是一个提醒免疫系统锻炼身体的小教练。
它的存在让免疫系统时不时地来一场演习，让免疫细胞们保持警惕，就像士兵们经常进行军事演练一样。
如果没有半抗原时不时地捣捣乱，免疫系统可能就会变得懒散，就像一个天天睡懒觉的大懒虫。
而且半抗原在医学研究里，那也是一个潜力无限的小明星。
科学家们研究它的时候，就像探险家在挖掘宝藏。
它就像一把神秘的小钥匙，说不定能打开治疗很多疾病的大门呢。
也许有一天，我们会发现半抗原能像魔法棒一样，把那些难治的病都给治好，那可真是太酷啦！它还像一个小小的信号弹，在身体这个复杂的战场上，一旦它和大分子结合引发反应，就像信号弹升空，告诉免疫系统哪里出现了问题。
然后免疫系统就可以根据这个信号，精准打击那些隐藏的“敌人”。
总之，半抗原虽然小得像个芝麻粒，但它在我们身体的大舞台上，却能演出一场又一场精彩又夸张的大戏，对我们的健康有着不可忽视的影响呢。
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• 对氨基苯胺的衍生物的半抗原与抗体反应
• 抗苯胺、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、 对氨基苯甲酸的抗血清。
• 旋光异构体（右旋酒石酸、左旋酒石酸、 内消旋酒石酸）
半抗原与载体偶联时，思考问题 •
1）半抗原的溶解度和稳定性：在结合反应中应不导致半抗原活性 的改变，同时也不能使载体变性至不溶解的程度。 2）偶联的位置：抗体对远离蛋白质联接点的半抗原部分有最好的 特异性，故联接时应使联接键远离半抗原的决定簇。 3）选择适合的偶联试 剂：不同的半抗原在偶联时，应根据半抗 原的化学结构，以及反应方式选择适当的偶联试剂。如小分子肽 类有一定的三级结构，在溶液中依靠氨基酸残基来维持其结 构的 稳定。因此，用双功能的亚氨酸酯不但对氨基酸有选择，而且能 代替被取代的每一个ε-氨基的正电荷。蛋白质与偶联剂接触后， 使不同蛋白质分子的功能基团 交联并凝聚。广泛交联的蛋白质， 其溶解度常降低，而这种溶解度差的蛋白质却是有效的免疫源。 • 4)载体蛋白的选择,异源性以及不干扰未来的检测对象 .
• （1） 琥珀酸酐法：本法用于带有羟基的半抗 原的改造。琥珀酸酐加水转变成琥珀酸。如将 带有羟基的半抗原和琥珀酸酐在无水吡啶中反 应，即可得到带有羧基的半抗原琥珀酸的衍生 物。
四、通过巯基偶联
• 将半抗原中的巯基，通过交联剂马来酰亚胺活 化的载体蛋白与含SH-的半抗原的交联
含巯基半抗原偶联反应图
七、通过酚基与载体蛋白偶联 • 一氯醋酸钠：本法适于带有酚基半抗原的改造。 将带有酚基的药物与一氯醋酸钠反应即可得到 带有羧基的半抗原衍生物
将酚基与对氨基苯甲酸反应 • 将酚基与对氨基苯甲酸反应导入羧基，再进一 步通过EDC等方法，实现半抗原与载体蛋白质 的偶联
八、通过糖基的过碘酸氧化法
• 过碘酸氧化法：过碘酸将糖环氧化成双醛基， 再与蛋白质上的氨基偶联。本法常用于配糖体 类药物与蛋白质的偶联。
EDC介导的载体蛋白与含COOH-的半抗原的交联
2、混和酸酐法
• （2）混合酸酐法又称为氯甲基异丁酯法，主 要用以甾体激素与蛋白质的偶连。以烷基氯甲 基为偶连剂，最常用的是氯甲基异丁酯。含有 羧基的半抗原与氯甲基异丁酯反应形成混合酸 酐，然后在与蛋白质载体上的氨基反应形成肽 键。
三、羟基化合物的偶联
一、 有游离氨化二亚胺法：碳化二亚胺是一种化学 性质非常活跃的双功能试剂，它们既可与半抗 原上的羧基又可与半抗原上的氨基缩合。此法 非常简便，只要将半抗原与 载体蛋白质按一 定分子比混合在适当的溶液中，然后加入碳二 亚胺，搅拌l～2h，置室温反应24h，最后透析 除去未反应的半抗原，即可得到人工免疫原。
PIERCE交联剂一览
1、通过碳化二亚胺偶联过程示意图
2）戊二醛法
• （ 2）戊二醛法：戍二醛是带有两个活性基团 双功能的连结剂，它借助两端的醛基与载体和 半抗原的氨基以共价键连接
戊二醛的两个醛基分别与载体及半抗原-NH2结合
二、带羧基的半抗原与载体蛋白偶联
1、碳化二亚胺法 • （1）碳化二亚胺法：碳化二亚胺是一种化学 性质非常活跃的双功能试剂，它们既可与半抗 原上的羧基又可与半抗原上的氨基缩合。此法 非常简便，只要将半抗原与 载体蛋白质按一定 分子比混合在适当的溶液中，然后加入碳二亚 胺，搅拌l～2h，置室温反应24h，最后透析除 去未反应的半抗原，即可得到人工免疫原
• 不完全抗原 只具有反应原性而缺乏免疫原性的物质称 为不完全抗原(incomplete antigen),亦称为半抗原 (hapten)。半抗原又分为简单半抗原和复合半抗原。 • 1.简单半抗原(simple hapten) 分子量较小,只有一个抗 原决定簇,不能与相应的抗体发生可见的反应,但能中和 相应的抗体阻止其出现可见的反应(用沉淀抑制反应可 证实)。如抗菌素、酒石酸、苯甲酸等都属于这类抗原。 • 2.复合半抗原(complex hapten) 分子量较大,有多个抗 原决定簇。一般的半抗原都属于此类,能与相应的抗体 发生沉淀反应 二硝基氯苯(DNCB)、多糖、类脂质、脂 多糖等半抗原都为复合半抗原。
五、带有酮基的半抗原 • （1） 羧甲基羟胺法：带有酮基的半抗原（如 孕酮、睾酮）与O-(羧甲基)羟胺反应，转变为 带有羧基的半抗原衍生物。
六、苯胺基与蛋白质偶联
• 重氮化的对氨基苯甲酸法：本法适于带有酚基 的半抗原（如某些药物）的改造。先将对氨基 苯甲酸和亚硝酸钠反应，反应产物再作用于带 有酚基的半抗原，从而制得带有羧基的半抗原 衍生物。