转基因植物的遗传特性与表达调控
转基因植物的检测鉴定方法、遗传转化技术及新技术
PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
＊已获得专利许可
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Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
loxP
Cre
Transgene
llooxP
loxP
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外源基因去除（Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因，该基因在启动子的作用下，可根据科学家的 意愿，在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉，从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因，或将外来基因从 人们所需食用的部分（如植物的茎、叶、块茎） 彻底清除掉，达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的，从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
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mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
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marker-free转基因植株
• 共转化法＊(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法＊ • MAT(Multi-auto transformation)法＊ • 替代法＊
《植物转基因技术》课件
转基因技术的未来发展方向和前景
研究方向
未来应加强转基因技术在提高作物抗逆性、 品质改良和功能食品研发等方面的研究，以 满足人类不断增长的需求。同时，应关注新 兴技术的应用，如基因编辑技术，以推动转 基因技术的创新发展。
应用前景
随着转基因技术的不断进步和应用领域的拓 展，未来转基因作物有望在保障粮食安全、 提高农业生产效率和改善生态环境等方面发 挥重要作用。同时，随着人们对转基因技术 认识的深入和法规体系的完善，转基因技术 的应用前景将更加广阔。
鉴定
对筛选出的阳性细胞或植 株进行遗传和表达分析， 以确定目的基因是否成功 导入并稳定遗传。
鉴定方法
包括分子生物学技术、免 疫学技术、生物化学技术 等。
转基因植物的遗传稳定性与安全性
01
02
03
04
遗传稳定性
转基因植物在繁殖过程中，目 的基因能够稳定遗传并表达的
能力。
安全性
转基因植物对人类健康、生态 环境和农业生产的潜在影响。
目的基因的验证
对获取的目的基因进行测序和功能验证，确保其正确性和可用性。
基因克隆与载体构建
基因克隆
采用限制性内切酶和连接酶等技 术，将目的基因克隆到载体上。
载体的选择
根据目的基因的特点和需求，选 择适合的载体，如质粒、病毒载
体等。
载体构建
将目的基因与载体进行重组，形 成重组质粒或重组病毒载体。
转化体的筛选与鉴定
转基因技术的法规和监管问题
法规制定
各国政府需制定完善的法规和监管体系 ，规范转基因技术的研发和应用，确保 其安全可靠。同时，需要加强国际合作 ，共同制定国际统一的转基因技术标准 。
VS
监管执行
植物生物技术
植物生物技术植物生物技术是指利用生物学原理和技术手段改良和利用植物的过程。
它是一门综合性学科，涉及到多个领域，如植物遗传和育种、植物病理学、植物组织培养等。
随着现代科学和技术的发展，植物生物技术在农业、环境保护、药物开发等方面发挥着重要作用。
一、植物遗传和育种植物遗传和育种是植物生物技术的重要组成部分。
通过研究植物的遗传特性和进行交配配对，可以改良和培育出具有良好性状的新品种。
传统的育种方法需要耗费大量时间和人力物力，而现代植物生物技术可以加速这一过程。
例如，基因编辑技术可以直接对植物基因进行修饰，并在短时间内获得具有特定性状的植物。
二、转基因技术转基因技术是植物生物技术中的关键技术之一。
通过将外源基因导入植物基因组中，可以使植物获得新的性状或提高原有性状的表达水平。
转基因技术在植物抗病虫害、耐逆性等方面具有很大的应用潜力。
例如，转基因作物的广泛应用已经在解决粮食安全和改善人类营养方面发挥了重要作用。
三、植物组织培养植物组织培养是一种通过体外培养植物组织和细胞，利用组织再生和植物再生技术繁殖新的植株的方法。
植物组织培养在植物繁殖、病毒检测和植物育种等方面具有广泛应用。
通过植物组织培养技术，可以大量复制和保存珍稀植物品种，加速育种进程，并进行植物病毒检测以保护农作物安全。
四、基因组学基因组学是研究植物基因组中基因的组成、结构、功能和相互关系的学科。
通过对植物基因组的研究，可以揭示植物的遗传特性和基因组演化的规律，为植物生物技术的应用提供理论基础。
此外，基因组学还促进了基因工程和转基因研究的发展，推动了植物领域的科学进步和技术创新。
五、植物生理学植物生理学研究植物的生理过程和调控机制。
通过研究植物的生长发育、内外环境对植物的影响以及植物内部代谢过程，可以提高作物产量和品质，改善植物的抗逆性。
植物生理学与植物生物技术的结合，不仅可以为作物育种提供理论指导，还可以通过调控植物生理过程来提高植物的综合利用价值。
植物分子生物学利用分子生物学技术手段研究植物分子遗传学和基因组学的学科
植物分子生物学利用分子生物学技术手段研究植物分子遗传学和基因组学的学科植物分子生物学是一门综合多学科的研究领域，通过应用分子生物学技术手段来探索植物的分子遗传学和基因组学。
该学科涉及了许多关键概念和方法，包括DNA克隆、基因表达调控、基因组学、转基因技术以及分子标记等。
通过这些手段的应用，植物分子生物学研究可以进一步深化对植物基因功能、调控网络和进化等方面的理解，推动改良和创新植物育种，以应对全球食品安全和环境挑战。
一、DNA克隆DNA克隆是植物分子生物学研究的核心技术之一。
它是将感兴趣的DNA片段从一个来源复制并插入到宿主植物细胞中的过程。
常用的DNA克隆技术包括限制性内切酶切割、DNA连接、转化和筛选等步骤。
通过DNA克隆，研究人员可以获取大量特定DNA片段以及有关植物基因的信息。
二、基因表达调控基因表达调控是植物分子生物学研究中的另一个重要方面。
植物基因表达调控的过程涉及多种调控因子和信号通路。
植物中的基因表达不仅仅依赖于基因本身的序列，还受到一系列转录因子、启动子和增强子的作用。
通过分析基因在植物不同组织和环境条件下的表达模式，研究人员可以深入了解基因调控网络的运作机制。
三、基因组学基因组学是植物分子生物学研究的重要分支，它研究植物的基因组结构和功能。
随着高通量测序技术的发展，植物基因组的测序速度和精确度大幅提高。
通过对植物基因组的比较和分析，研究人员可以揭示不同物种间的遗传变异，以及基因组在进化过程中的改变。
同时，基因组学也为植物育种和遗传改良提供了重要的理论支持。
四、转基因技术转基因技术是植物分子生物学研究的重要手段之一。
它通过引入外源基因或抑制内源基因的表达，改变植物的遗传特性。
转基因技术在植物育种中起到了重要的作用，例如提高作物的抗虫性、耐逆性和产量等。
然而，转基因技术也面临伦理和环境安全等问题，需要权衡利弊进行应用。
五、分子标记分子标记是植物分子生物学研究中常用的工具。
它是一种与植物基因或DNA序列有关的分子标记，可以用来鉴定特定基因型或进行基因组遗传分析。
转基因植物
载体介导法
➢ T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的 染色体上并得到表达。利用这一特点， 将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建 根瘤农杆菌的转化载体。
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
载体介导法
Vir区（virulence region）： ➢ 该区段上的基因能激活T-DNA转移，
使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
Ti质粒的基因位点及其功能区域
➢ T-DNA区（transferred-DNA regions）：
产生白化苗，且由于 PEG法对原生质体活力 有害，转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
转基因植物的遗传特性与表达调控
（4）从头甲基化与沉默机制 A 植物对外源DNA的基因免疫诱导反应； B DNA-DNA配对诱导； C DNA-DNA互作诱导。
4. 克服转基因沉默的策略
(1) 转基因的选择： （2）启动子的选择； （3）利用组织和发育特异性作用的增强子 （4）利用MAR序列； （5）利用位置特异性重组系统； （6）选择单拷贝的转化体。
E 交叉相连的DNA链经旋转形成Holliday中间体； F Holliday中间体分枝迁移数个碱基后，另一条链再断裂并与对方的 断裂链重组，这时就完成重组，实现了交换。
（3）位点特异性重组在转基因整合遗传特性研究中的应用
A 控制转基因整合的拷贝数；
B 可导入多个基因进入植物基因组； C 使目标基因重排；
在44个转KM抗性基因的烟草中，通过转基因植株自交、转化与非转化杂 交、转化株杂交进行分析，发现35个无性系包含一个单位点插入KM抗性基 因，其余5个为两位点插入，且观察到双位点插入导致自交后代中出现隐形 致死突变。 多基因转化植株后代分离规律与其整合特性密切相关，多基因连锁形式整 合到一个位点，其符合单基因的孟德尔式分离规律；如分别整合到不同位点， 那么每个基因的分离符合孟德尔式规律，各个基因间不影响。
（2）转录水平的基因沉默 A 转基因及其启动子甲基化； B多拷贝重复基因序列引起的转录水平基因沉默； C 同源基因间的反式失活； D 转基因位置效应引起的转基因沉默； E 染色体包装对转基因沉默的影响； F 后成修饰作用导致转基因沉默。
（3）转录后水平的转基因沉默
A 生化开关模型；
B 异常RNA模型；
当两个loxP基因座方向相同，Cre介导的反应造成loxP基因座之间的 DNA被删除，loxP基因座方向相反，Cre介导使两端携带loxP的片段发 生倒位，如果loxP 不在同一DNA分子，如一个在质粒上，另一个在染 色体上，那么Cre酶可使质粒DNA整合到染色体loxP所在位置，实现定 点重组。
转基因植物的遗传特性与表达调控
3、转化后整合位点的DNA结构变化
保持整合外源基因的完整性是实现转基因功能表达的基本条件，外源
基因整合后的完整性与其结构变化有关，现已明确，外源基因作为侵入 者的整合，会引起不同程度的基因重排，涉及缺失、异位、倒位及重复 等一系列现象。这主要与细胞本身的重复和修复功能有关。
Mayerhofer等（1991）和Gheysen等（1991）对15个独立的T-DNA插 入进行了研究，提出了外源DNA整合模型， 他们认为： （1）T-DNA的插入不会引起植物DNA大的重排，但在T-DNA的两侧各出 现了一个158bp的正向重复序列，且多数插入会导致靶位点处小的缺失， 最多79个核苷酸； （2）在T-DNA和植物DNA连接处常有几个至33个核苷酸的填充DNA， 这些填充序列与靠近连接处的植物DNA序列相似； （3）在靶位点处不要求有特异的序列，但若T-DNA两端与植物靶位点之 间有一段短序列（5-10bp）同源，则可能对T-DNA整合进植物基因组其 作用。
（2）整合拷贝数：许多研究表明，外源DNA的插入拷贝数有以下几种：单 拷贝单位点插入；串联多拷贝单位点插入；多拷贝多位点插入，多数情况 是以单拷贝在单位点整合，但在同一位点，也存在较多的多个拷贝串联整 合的情况。形式为头对尾式串联和头对头式串联。农杆菌转化和基因直接 转化整合拷贝数存在差异，前者拷贝数少，整合位点特异性强。
此外，插入植物染色体的外源DNA大小是有限制的，如油菜插入外源 DNA为5-6Kb，烟草中最大可达9Kb，但频率较低。
4、转化方法对整合外源基因结构的影响
尽管转化方法较多，但外源DNA以两种分子形式转化，一种是外源 DNA插入T-DNA质粒载体中导入；另一种是裸露的DNA分子直接导入， 由于转化原理不同，因此与整合后的外源DNA结构必然存在直接关系。 （1）T-DNA转化的外源DNA结构变化
植物遗传转化中存在的问题与对策
植物遗传转化中存在的问题与对策大家好，今天我们来聊聊植物遗传转化这个话题。
我们得明确一点，植物遗传转化可不是什么高深莫测的科学，而是咱们生活中常见的一件事情。
就像你把苹果切成小块，然后用勺子舀起来吃一样简单。
那么，植物遗传转化中到底存在哪些问题呢？又有哪些对策可以解决这些问题呢？接下来，我们就一起来探讨一下吧！我们来看看植物遗传转化中存在的问题。
其实，这个问题还是挺复杂的，因为涉及到很多生物学的知识。
但是，为了咱们能够更好地理解这个问题，我还是尽量用简单易懂的语言来给大家讲解。
第一个问题，就是如何找到合适的亲本和目标基因。
在咱们日常生活中，你可能会遇到这样的情况：你想要把苹果切成橙子的味道，但是你没有合适的苹果和橙子作为亲本。
这时候，你就需要去寻找那些既有苹果基因又有橙子基因的作物。
同样地，在植物遗传转化中，你需要找到那些既有你要转化的目标基因又有能够表达这个基因的受体细胞的亲本。
这可不是一件容易的事情，需要咱们花费大量的时间和精力去研究。
第二个问题，就是如何将目标基因有效地转移到受体细胞中。
这就像是把苹果切成橙子的味道，你不能只把苹果的果肉切下来，还要把果皮、种子等都切掉才行。
同样地，在植物遗传转化中，你不能只把目标基因切下来，还要想办法让它进入到受体细胞中，并且能够在受体细胞里正常地发挥作用。
这也是植物遗传转化中的一个难题。
第三个问题，就是如何确保转移后的受体细胞能够稳定地表达目标基因。
这就像是把苹果切成橙子的味道之后，你还需要把橙子的果皮、种子等都切掉，才能让橙子真正变成橙子的味道。
同样地，在植物遗传转化中，你还需要确保转移后的受体细胞能够稳定地表达目标基因，否则你还是无法得到想要的结果。
那么，面对这些问题，咱们又有哪些对策可以解决呢？下面，我就给大家分享一些解决方案。
对于第一个问题，我们可以通过转基因技术来解决。
转基因技术就像是给你提供了一个现成的苹果和橙子，你可以直接拿来用，而不需要自己去寻找。
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5、位点特异重组
（1）位点特异性重组系统
遗传重组分为3类：同源重组，转座和位点特异性重组，也称定位 重组。同源重组发生在两个具有一定程度同源性的DNA分子之间或同 一分子的两个同源性区域，它们相互重组。转座和位点特异重组的共 同点是重组只发生于具有特定的DNA序列的位置上，由特定的酶来识 别某一种DNA序列，而造成重排。二者的区别在于转座重组中，识别 位点之间的DNA片段被转位插入到另外的位点，是DNA合成过程中 伴随而发生的DNA断裂、转移和插入。而定位重组并不涉及DNA的 净合成，在两个识别位点之间的DNA片段并不转移到基因组中的另一 地方，这段DNA是在重组酶所识别的位点上进行重组、交换而被切除 或发生倒置，该定位系统越来越多地应用于转基因植物中，以改造基 因重排，去除不需要的筛选基因、激活或缺失某一表达基因。
3、转化后整合位点的DNA结构变化
保持整合外源基因的完整性是实现转基因功能表达的基本条件，外源 基因整合后的完整性与其结构变化有关，现已明确，外源基因作为侵入 者的整合，会引起不同程度的基因重排，涉及缺失、异位、倒位及重复 等一系列现象。这主要与细胞本身的重复和修复功能有关。 Mayerhofer等（1991）和Gheysen等（1991）对15个独立的T-DNA插 入进行了研究，提出了外源DNA整合模型， 他们认为： （1）T-DNA的插入不会引起植物DNA大的重排，但在T-DNA的两侧各出 现了一个158bp的正向重复序列，且多数插入会导致靶位点处小的缺失， 最多79个核苷酸； （2）在T-DNA和植物DNA连接处常有几个至33个核苷酸的填充DNA， 这些填充序列与靠近连接处的植物DNA序列相似； （3）在靶位点处不要求有特异的序列，但若T-DNA两端与植物靶位点之 间有一段短序列（5-10bp）同源，则可能对T-DNA整合进植物基因组其 作用。 此外，插入植物染色体的外源DNA大小是有限制的，如油菜插入外源 DNA为5-6Kb，烟草中最大可达9Kb，但频率较低。
目前发现的有4个定位重组系统，Cre/lox、FLP/FRT、R/RS和 Gin/gix。
（2）位点特异性重组的作用机制
以Cre/lox为例加以说明，Cre来源于噬菌体P1，P1基因组中有 1029bp的一段DNA，编码34组酶。该酶在离体系统中以含loxP基因座的DNA序列为底物，高效地 使线状、环状甚至超螺旋DNA发生重组反应，而产生功能。
4、转化方法对整合外源基因结构的影响
尽管转化方法较多，但外源DNA以两种分子形式转化，一种是外源 DNA插入T-DNA质粒载体中导入；另一种是裸露的DNA分子直接导入， 由于转化原理不同，因此与整合后的外源DNA结构必然存在直接关系。 （1）T-DNA转化的外源DNA结构变化 农杆菌介导转化细胞中T-DNA结构完整，整合位点稳定，多数情况 下在25bp处与植物DNA连接，整合后的外源基因结构变异少，但外源 DNA也会出现结构变化，表现为T-DNA的串联和截短现象。 T-DNA串联：通常有5-20个拷贝的T-DNA的首尾相联，在大多数整合 事件中，T-DNA可以在无选择压的情况下串联起来。 T-DNA截短：也是T-DNA转化时较多发生的结构变化，可能是由于TDNA两侧各有一个25bp的边界类似序列。截短是在转移和整合过程中 产生，由于T-DNA区内‘框类似’序列的存在，被用作引导T-DNA转 移和整合的次级识别位点，从而代替正常情况下的25bp右边界序列， 所以正常的有边界序列被截短。 截短在共整合载体中比二元载体系统更易发生。
一、转基因植物中外源DNA的整合特性
1、外源DNA的整合位点和拷贝数
（1）整合位点：转基因导入植物细胞后，通过细胞分裂时遗传物质的复 制过程整合到核基因组中，目前普遍认为，转基因在寄主染色体内的整合 位点是随机的, 外源DNA可以插入植物基因组的任何一条染色体，也可以 插入一条染色体的任何位点或没有固定的插入位点，但往往对转录活跃区 域具有优先插入特性。 （2）整合拷贝数：许多研究表明，外源DNA的插入拷贝数有以下几种：单 拷贝单位点插入；串联多拷贝单位点插入；多拷贝多位点插入，多数情况 是以单拷贝在单位点整合，但在同一位点，也存在较多的多个拷贝串联整 合的情况。形式为头对尾式串联和头对头式串联。农杆菌转化和基因直接 转化整合拷贝数存在差异，前者拷贝数少，整合位点特异性强。
2、外源DNA结构对整合的影响
外源DNA结构分为四种类型：单链线形DNA、单链环形DNA、 双链线性DNA及双链环形DNA。四种结构中单链线状DNA研究较 多，一般认为单链DNA可以通过有效的不正常整合参与同源染色 体序列的重组，研究认为单链DNA在单链完全变成双链之前已发 生重组。此外Bilang等（1992）研究了导入烟草的DNA结构（线 形和环形）的重组效率，结果表明线性单链DNA同环形单链DNA 相比，其抗性愈伤组织数目要高于后者，说明线性DNA的整合效 率要高于环形DNA。
当两个loxP基因座方向相同，Cre介导的反应造成loxP基因座之间的 DNA被删除，loxP基因座方向相反，Cre介导使两端携带loxP的片段发 生倒位，如果loxP 不在同一DNA分子，如一个在质粒上，另一个在染 色体上，那么Cre酶可使质粒DNA整合到染色体loxP所在位置，实现定 点重组。
四类定位重组系统的分子重组程序分以下几步：
（2）裸露DNA直接转化的外源DNA结构变化 采用裸露DNA直接转化时，整合的外源DNA往往出现复杂的杂交 图谱，在转化当代及子代中常出现DNA环化、甲基化、片段分离和丢 失等现象。 在DNA直接转化中供体DNA容易在整合过程中发生各种结构变化和 修饰，而且植物靶DNA序列也可在供体DNA整合过程中发生重排。