布鲁氏菌实验室检测

试管凝集反应（SAT）
生理盐水稀释待检血清至 1:25、1:50、1:100、1:200， 1:400倍比稀释， 加入0.5ml抗原稀释液，摇匀，放 37℃温箱中24小时观察结果。判定结果：每次需配制抗原比 浊管作为判断依据。凝集价在1:100(++)以上者为阳性， 1:50(++)为可疑。 可作为布氏菌病早期诊断及确诊实验，每份待捡血清需作1 个血清对照，以排除血清的自然凝集。
作为单一的实验方法是不完善 的，阳性时有诊断意义，阴性时不 能排除前带及封闭现象的可能，结 合其它方法判断。
虎红平板凝集试验（RBPT）
所用抗原是用虎红(四氯四碘荧光素)色素染成的一种酸性 抗原，具有克服非特异性反应，对检查小分子抗体IgG较 为敏感的特点。 在清洁的玻片上加0.03ml的受检血清，然后再加入上述 标化抗原悬液0.03ml，使充分混匀，在4分钟内观察结 果，以出现可见的凝集反应为阳性。可作为初筛实验。
验(玻片、试管法） 3.染料抑菌试验（纸片法）
4.硫化氢试验（醋酸铅） 5.噬菌体裂解试验（BK2，Tb：0和4两个稀释度） 6.全自动生化仪鉴定（鉴定到种）
阳性血清玻片凝集
H2S产生试验-醋酸铅滤纸条与培基斜面平行
染料抑菌噬菌体裂解试验
Vitek2 Compact
GN卡
2、布病血清学检测
全血玻片凝集反应
在一张清洁的破片上加1滴赫德逊氏反应抗原，然后在抗原 上加1滴受检血液或关节腔内积液，可用加样器吸头使其混 匀，在酒精灯上稍微加热，促进反应，在8分钟内观察结 果，凡在此时间内出现凝集者为阳性。可作为初筛实验。
3、分子生物学分型方法
核酸DNA的提取 DNA试剂盒提取法 水煮法 属水平 BCSP31基因PCR方法，223bp B4:5`-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3` B5:5`-GCTTGCCTTTCAGGTCTG -3`
种水平的鉴定(AMOS-PCR)
⑴ B. abortus-specific primer ：
A: 5`-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3` ⑵ B. melitensis-specific primer ：
M: 5`- AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA ⑶ B. ovis-specific primer ：
血平板
布氏琼脂
可培养标本类型
可疑病人血液、尿液、乳液、脑脊液、关 节液、滑囊液
多采用血培养
血培养 无菌采血4~5ml静脉血接种双相培养基或血液增菌瓶。双相 培养基轻轻混合倾斜，血液均匀分布在琼脂面上，37℃培 养，血液增菌瓶混匀直接培养。普通培养箱和CO2培养箱（5%） 各一瓶。3天后观察结果，若可疑阳性，进行纯培养鉴定，30 天不生长为阴性。
肝汤琼脂或胰蛋白胨琼脂上，菌落圆形光滑、初无色透 明，后渐浑浊而带灰白甚至灰黄色；菌落的发育大小常差 异较远，小者直径约０.１mm，大者可达２-３mm。在马铃 薯培养基上，菌落常现微棕黄色。布氏琼脂上的菌落无色 透明。在液体培养基中呈轻微浑浊，久后形成粘稠沉淀， 液面无菌膜，陈旧培养物有时可形成菌环。
布鲁氏菌实验室检测
微生物室 2013年8月 蚌埠
1、布鲁氏菌分离培养（抗原） 2、布病血清学检测（抗体） 3、分子生物学分型方法（菌株分型） 4、实验室生物安全和质量控制
1、布鲁氏菌分离培养
布鲁氏菌是一种革兰氏染色阴性、短小杆菌，无鞭毛， 不形成芽孢，一般无荚膜，毒力菌株可有菲薄的荚膜。 初次分离时多呈球状，球杆状和卵圆形，该菌传代培养 后渐呈短小杆状。
试管凝集反应（SAT）推荐 虎红平板凝集试验（RBPT）推荐 抗球蛋白试验（Coombs试验）推荐 布氏菌素皮试试验（疫情，必要时） 全血玻片凝集反应（操作较RBPT难） 补体结合试验（复杂，敏感度低） 乳胶凝集试剂（敏感性差，较贵） 乳环凝集实验（局限性大） 金标检测（假阳性高，较贵） 酶联免疫吸附试验（IgG、IgM，可参考用）
布氏菌素皮试试验
①机体接触过抗原，处于敏感状态，可以直接检查。②变态 反应原是由菌体提取的、以蛋白为主的生物性抗原。③皮内 注射抗原后，反应出现迟缓。一般在6小时以后局部开始浸 润，表现为红、肿。④不能在同一机体重复，有时出现假阳 性、假阴性。
抗球蛋白试验（Coombs试验）
原理：机体受抗原刺激后可以产生“完全抗体”与“不完全抗体”. 不完全抗体虽可与相应抗原结合，但不出现可见的反应。将 含有不完全抗体的人血清球蛋白作为抗原，注射于另一种动 物(常用家兔)制成抗此球蛋白(抗IgG、IgA及19M)的抗体。再 将此抗球蛋白抗体加入抗原与不完全抗体复合物中，即可出 现可见的凝集反应。 ①试管凝集阴性 ②Coomb玻片反应阳性 ③Coombs试管凝集计算效价
尿液培养 用无菌的导尿管将尿液导入无菌容器中，为提高检出率，可 在尿液中加入1%~3%的高价血清，混合后37℃温育2h，高 速离心沉淀，取沉淀物0.5ml接种琼脂平板培养。 乳液、脑脊液、关节液、滑囊液培养 液体标本直接接种到琼脂平板或斜2.特异性血清阳性：（A+M）、A、M、R血清凝集试
布鲁氏菌属于布鲁氏菌属（Brucella) 、 布鲁氏菌种（（Brucellae）。目前按照国 际分类标准，分为10个种19个生物型。常 见的有牛（B. abortus） 、羊（B. melitensis）、猪 (B. suis)、犬 (B. canis)、绵羊附睾(B. ovis)布鲁氏菌。
布氏杆菌为需氧或微需氧菌，最适生长温度37°C，最适 PH为6.6-7.4，牛种部分型别、绵羊附睾种布氏菌需在510% CO2 条件下生长，初代分离菌株最好在CO2 条件下培 养。在普通培养基上生长不良，需用肝汤、胰蛋白胨肉汤、 马铃薯培养基、巧克力平板或特制的布氏菌培养基上生长。 此菌生长缓慢，初代培养常需5-10天甚至20-30天可见生 长。不过实验室长期传代保存的菌株或增菌液，培养2472h即可生长良好。