利用GmNH23基因过表达转基因植物对其广谱抗病毒特性的研究
具有不同酶活性并可抵抗特异shRNA降解的nm23-H1真核表达载体的构建和表达
具有不同酶活性并可抵抗特异shRNA降解的nm23-H1真核表达载体的构建和表达鲁战胜;郭丽丽;李林;吴志浩;周清华【摘要】背景与目的已有的研究证明nm23-H1基因是一个重要的肿瘤转移抑制基因，但其抑制肿瘤转移的生化机理尚不完全清楚。
Nm23-H1基因结构和功能异常与肿瘤的侵袭转移有密切关系。
我们前期已构建了nm23-H1的短发夹RNA （short hairpin RNA, shRNA）载体以及可抵抗此shRNA降解的nm23-H1的cDNA的表达载体，在此基础上我们欲应用基因定点突变技术构建具有不同酶活性并能抵抗此shRNA降解的nm23-H1cDNA真核表达载体，并通过恢复实验验证其表达，为进一步研究肿瘤抑制基因nm23-H1的分子机制提供理论基础和实验依据。
方法以pcDNA3.1(+)-shRNA-resistant-nm23-H1质粒为突变模板，应用重叠延伸PCR方法引入nm23-H1基因四个单点突变和一个联合位点突变，并将突变基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1Hygro(+)。
将突变质粒转染人肺腺癌细胞株A549/nm23-H1-shRNA（稳定沉默nm23-H1基因），利用Western blot技术验证不同突变体nm23-H1蛋白的表达。
结果成功构建了shRNA抵抗的nm23-H1S44A、nm23-H1P96S、nm23-H1H118F、nm23-H1S120G、nm23-H1P96S-S120G五个突变型真核表达载体，经DNA序列分析突变的碱基序列与实验设计完全一致，经Western blot验证nm23-H1蛋白表达正常。
结论成功构建了五个具有不同突变位点的shRNA抵抗的nm23-H1基因真核表达载体，并且突变蛋白质nm23-H1表达正常，同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。
%Background and objective It has been proven that nm23-H1 gene was a tumor metastatic suppressor gene. However, it’s molecular mechanism of suppressingmetastasis remains unexplored. hTere is a closely relationship between the abnormality of stucturs and functions of nm23-H1 gene, and cancer invasion and metastasis. We have constructed the vec-tor with nm23-H1-shRNA and the vector with nm23-H1cDNA resistant to the speciifc shRNA. So, we plan to construct shR-NA-resistant eukaryotic expression vector of nm23-H1 gene by site-directed mutagenesis, rescue experiment was performed to verify the nm23-H1 gene expression, and to provide basement for studying the biochemical mechanisms of nm23-H1 gene. Methods Site-directed mutagenesis of nm23-H1 gene was performed by overlap extension PCR method. Pure plasmid con-taining gene of nm23-H1 (shRNA-resistant) was prepared. hTe desired ifve mutations were constructed and cloned into the eukaryotic vector pcDNA3.1Hygro(+). hTe human lung adenocarcinoma cell A549/nm23-H1-shRNA (stable nm23-H1 gene silencing) was transfected with the ifve mutants, and the expression of the mutant proteins was determined by Western blot. Results Five eukaryotic expression vectors (shRNA-resistant) of nm23-H1, nm23-H1S44A, nm23-H1P96S, nm23-H1H118F, nm23-H1S120G, nm23-H1P96S-S120G, were successfully constructed. hTe results of DNA sequencing conifrmed that the base sequences of the genes were completely concordant with experiment design. hTe expression of nm23-H1 mutant proteins was veriifed by Western blot. Conclusion Five eukaryotic expression vectors (shRNA-resistant) of nm23-H1 gene were successfully con-structed, and the mutant proteins were veriifed. hTe site-directedmutagenesis technical of overlap extension PCR is a effcient, simple and economical method.【期刊名称】《中国肺癌杂志》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】6页(P183-188)【关键词】Nm23-H1;重叠延伸PCR;定点突变;Western blot【作者】鲁战胜;郭丽丽;李林;吴志浩;周清华【作者单位】300052天津，天津市肺癌转移与肿瘤微环境重点实验室，天津市肺癌研究所，天津医科大学总医院;300052天津，天津市肺癌转移与肿瘤微环境重点实验室，天津市肺癌研究所，天津医科大学总医院;300052天津，天津市肺癌转移与肿瘤微环境重点实验室，天津市肺癌研究所，天津医科大学总医院;300052天津，天津市肺癌转移与肿瘤微环境重点实验室，天津市肺癌研究所，天津医科大学总医院;300052天津，天津市肺癌转移与肿瘤微环境重点实验室，天津市肺癌研究所，天津医科大学总医院【正文语种】中文Nm23-H1基因是第一个被发现的重要的肿瘤转移抑制基因，为nm23基因家族8个成员之一[1,2]，该基因与人类多种肿瘤的侵袭转移密切相关。
转双价广谱抗病基因创造甘蓝型油菜抗菌核病新品种的研究
分子植物育种,2003年,第1卷,第4期,第457—463页Molecular Plant Breeding,2003,Vol11,No14,457—463 研究论文RESEARCH AR TICL E转双价广谱抗病基因创造甘蓝型油菜抗菌核病新品种的研究陈雁 饶勇强 孟金陵3华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉,4300703通讯作者,jmeng@mail1hzau1edu1cn摘要菌核病严重威胁着我国长江中下游地区甘蓝型油菜的生产,几乎每年都会导致甘蓝型油菜的大面积减产。
来自于烟草的葡聚糖酶(G lucanase)基因,其编码产物能降解真菌的细胞壁结构成分-葡聚糖。
来自于烟草的植物蛋白AP24则属于细胞程序性死亡(PCD)的诱导蛋白,对多种真菌具明显抑制作用。
前期已成功地将这两个广谱抗病基因导入甘蓝型油菜,并且通过表型鉴定,在T0和T1代检测到了核盘菌抗性。
本实验对转基因T2代和T3代甘蓝型油菜进行分子鉴定和田间抗病性鉴定。
经过PCR分子鉴定,从14个转基因T3代甘蓝型油菜株系中筛选到4个外源基因已经纯合的株系。
对株系G A02-2的R T2PCR鉴定则进一步证明外源广谱抗病基因在RNA水平上的大量表达。
田间抗性鉴定主要利用苗期离体叶接种和成株期茎杆插签接种这两种方法。
结果表明,T2代转基因株系中有5个株系表现为抗病基因初步纯合,5个株系表现为隐性纯合,12个株系处于分离当中,其中株系G A02-2的抗病性鉴定结果与R T2PCR鉴定的结果吻合。
18个T3代转基因甘蓝型油菜株系中有7个株系表现为抗性纯合,3个株系表现为隐性纯合,其余8个株系基本上仍在分离中,其中株系G A02-2-1的抗病性鉴定结果与前面的分子鉴定以及上代的抗病性鉴定完全吻合。
综合分子鉴定和抗病性鉴定结果,筛选出抗病效果良好的转基因纯合株系应用于抗病育种。
关键词甘蓝型油菜,葡聚糖酶基因,AP24基因,菌核病Creating New Variety with Scleroti nia sclerotiorum Resistance by Trans2 forming two Broad2spectrum Antifungal G enes into B rassica napus L.Chen Yan Rao Y ongqiang Meng Jinling3National K ey Laboratory of Crop G enetic Improvement,National Center of Crop Molecular Breeding,Huazhong Agricultural University,Wuhan,4300703Corresponding author,jmeng@mail1hzau1edu1cnABSTRACTScleroti nia sclerotiorum is the most devastating disease of rapeseed(B rassica napus L1)in China espe2 cially in Yangtze River Area and leads to great yield loss every year.G lucanase and AP24,which come from to2 bacco both,have broad spectrum of antifungal activity.Our laboratory had transformed these two genes into B rassica napus and obtained Scleroti nia sclerotiorum resistance in T0and T1plants.This work took two dif2 ferent inoculation methods during two different periods to estimate the resistance to Scleroti nia sclerotiorum ofT 2and T 3progenies.That is detached leaves inoculation and inoculation of stem by tooth sticks with clinging pathogene.The plants exhibited an increased resistance against the fungal attack compared with the nontrans 2genic plants during two inoculations.The candidate plants were also analyzed by PCR and R T bined these methods ,homozygous transgenic plants were selected.KEYWORDSB rassica napus ,G lucanase gene ,AP 24gene ,Scleroti nia sclerotiorum1引言菌核病属真菌性病害,是由核盘菌(Sclero 2ti nia sclerotiorum )的子囊孢子侵染叶片和植株本体产生。
大豆TGA转录因子基因GmTGA26在盐胁迫中的功能分析
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.14123大豆TGA转录因子基因GmTGA26在盐胁迫中的功能分析柯丹霞*霍娅娅刘怡李锦颖刘晓雪信阳师范学院生命科学学院/ 大别山农业生物资源保护与利用研究院，河南信阳464000摘要：TGA转录因子是bZIP的一个亚家族，在病原体和非生物胁迫反应中发挥重要作用。
本研究在大豆中筛选并克隆得到1个TGA转录因子家族基因GmTGA26，同源蛋白比对表明GmTGA26具有保守的亮氨酸拉链结构域，与野生大豆同源性最高。
基因表达特性分析表明，GmTGA26在大豆中受盐胁迫诱导表达。
此外，GmTGA26编码核定位蛋白并且具有转录激活活性。
通过发根农杆菌介导的大豆毛根转化，得到过表达GmTGA26的“复合体”大豆植株，在盐胁迫条件下，与空载体对照相比，“复合体”大豆植株生长状态更好，丙二醛含量和相对质膜透性明显降低(P < 0.05)，而叶绿素含量和根系活力则有显著的升高(P < 0.05)。
qRT-PCR结果表明，盐胁迫条件下在大豆毛状根中过表达GmTGA26可显著上调胁迫响应基因的表达。
以上结果表明，过表达GmTGA26显著增强了“复合体”大豆植株的耐盐能力。
推测GmTGA26通过调控下游一系列胁迫响应基因从而参与调控大豆盐胁迫应激反应过程。
关键词: 大豆；TGA转录因子；毛根转化；耐盐性Functional analysis of GmTGA26 gene under salt stress in soybeanKE Dan-Xia*, HUO Ya-Ya, LIU Yi, LI Jin-Ying, and LIU Xiao-XueCollege of Life Sciences, Xinyang Normal University / Institute for Conservation and Utilization of Agro-bioresources in Dabie Mountains, Xinyang 464000, Henan, ChinaAbstract: TGA transcription factors are a subfamily of bZIP, which play important roles in pathogen and abiotic stress responses. A TGA transcription factor family gene GmTGA26was screened and cloned from soybean in this study. Homologous protein comparison showed that GmTGA26 had a conserved leucine zipper domain and had the highest homology with wild soybean. The analysis of gene expression characteristics revealed that GmTGA26gene was induced by salt stress in soybean. In addition, GmTGA26gene encoded nuclear localization protein and had transcriptional activation activity. The “complex” soybean plants overexpressing GmTGA26were obtained through Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation of soybean. The growth state of “complex” soybean plants was better t han the empty vector control under salt stress. Meanwhile, the MDA content and relative plasma membrane permeability decreased significantly (P < 0.05), while the chlorophyll content and root activity increased significantly (P < 0.05). The qRT-PCR results indicated that overexpression of GmTGA26 in soybean hairy roots under salt stress could significantly up-regulate the expression of stress response genes. The above results showed that overexpression of GmTGA26 significantly enhanced the salt tolerance of “complex” soybean plants. It is speculated that GmTGA26 participates in the regulation of soybean salt stress response by regulating a series of downstream stress response genes.Keywords: soybean;TGA transcription factor; hairy root transformation; saline tolerance本研究由国家自然科学基金项目(U1904102)，河南省高等学校青年骨干教师培养计划和信阳师范学院“南湖学者奖励计划”青年项目资助。
肿瘤转移抑制基因nm_(23)研究现状
肿瘤转移抑制基因nm_(23)研究现状
龚莉
【期刊名称】《国外医学：口腔医学分册》
【年(卷),期】1995(22)6
【摘要】nm_(23)是引人注目的肿瘤转移抑制基因,分为nm_(23)-H_1和
nm_(23)-H_2两个亚型,编码具有NDPK活性的蛋白。
nm_(23)基因的mRNA、蛋白质表达下降,等位基因缺失或基因突变与恶性肿瘤的高转移潜力有关。
【总页数】4页(P332-335)
【关键词】肿瘤转移;抑制基因;基因表达;基因突变
【作者】龚莉
【作者单位】华西医科大学口腔病理教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R73－37
【相关文献】
1.肿瘤转移抑制基因nm23在膀胱癌中表达的研究现状 [J], 何华;张旭
2.肿瘤转移抑制基因nm23的研究现状 [J], 张宾;王家富;黄庆玉
3.人肿瘤转移抑制基因NM23-H1抑制卵巢癌转移机制体内体外实验研究 [J], 赵怡璇;徐耀红;李守柔;文杰
4.肿瘤转移抑制基因nm23研究现状 [J], 龚莉
5.肿瘤转移抑制基因nm23突变的研究现状 [J], 陈晓东;戴益民
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GmHSFA1基因克隆及其过量表达提高转基因大豆的耐热性
遗传HEREDITAS(Beijing) 28(11): 1411~1420, 2006研究报告DOI: 10.1360/yc-006-1411GmHSFA1基因克隆及其过量表达提高转基因大豆的耐热性陈晓军1,2, 叶春江1,3, 吕慧颖1, 徐民新1, 李葳1,张利明1,王超1, 罗淑萍2, 朱保葛1(1.中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101; 2.新疆农业大学农学院, 乌鲁木齐 830052;3.济南大学化工学院生物技术系, 济南 250022)摘要: 热激转录因子在调节植物对逆境胁迫应答和热激蛋白基因表达方面起重要作用。
采用生物信息学和比较基因组学方法结合RACE技术从大豆基因组中克隆到一个新的热激转录因子基因GmHsfA1, 其cDNA全长1 781 bp, 包含1个1 533 bp的开放阅读框, 编码含有510个氨基酸残基的蛋白质(GenBank登录号为AY458843)。
与其他转录因子的分子结构相似,GmHSFA1也含有4个典型的结构功能域—DNA结合域、寡聚域、核定位信号和C端激活域。
BLAST分析表明, GmHSFA1与其同源性最高的番茄热激转录因子LpHSFA1之间的氨基酸序列相似性为52.46%。
RT-PCR、Northern和遗传转化结果显示: 1)GmHsfA1在大豆的不同组织中呈现组成型表达模式; 2)常温下转基因大豆植株的GmHsfA1表达水平明显高于非转基因对照; 3)GmHsfA1的过量表达激活了转基因大豆植株中热激蛋白基因GmHsp22在非诱导条件下的转录, 并加强了高温胁迫下另2个热激蛋白基因GmHsp23和GmHsp70的表达; 4)转GmHsfA1大豆植株的耐热温度(达52℃)明显高于非转基因植株。
上述结果说明, GmHsfA1的过量表达激活或促进其下游3个热激蛋白基因的转录或表达, 明显提高了转基因大豆植株的耐热能力。
关键词: 大豆; 热激转录因子A1(HSFA1); 转基因; 热胁迫; 过量表达; 耐热性中图分类号:Q943.2 文献标识码: A 文章编号: 0253-9772(2006)11-1411-10 Cloning of GmHSFA1 Gene and its Overexpression Leading to En-hancement of Heat Tolerance in Transgenic SoybeanCHEN Xiao-Jun1,2, YE Chun-Jiang1,3, LÜ Hui-Ying1, XU Min-Xin1, LI Wei1ZHANG Li-Ming1,WANG Chao1, LUO Shu-Ping2, ZHU Bao-Ge1(1.Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; 2. College of Agronomy, XinJi-ang Agricultural University, Urmqi 830052, China; 3. BioTech Department, Chemistry-Engineering College, Jinan University, Jinan250022, China)Abstract: Heat shock transcription factors (HSFs) are important in regulating heat stress response by mediating expression of heat shock protein (HSP) genes in various plant species. In the present study, a novel GmHSFA1 with an ORF of 1 533 bp (full-length cDNA sequence of 1 781 bp) was cloned from soybean genome via comparative genomic收稿日期: 2006-02-09; 修回日期: 2006-06-14基金项目:国家自然科学基金项目、国家重点基础研究发展规划(973计划)项目(编号: 2002CB111304)和国家科技攻关项目(编号: 2004BA525B06)[Supported by the National Natural Science Foundation of China, the Key Project of Chinese National Programs for Funda-mental Research and Development (973 Program) (No.2002CB111304), the National Sci-Tech Project of China(No.2004BA525B06)]作者简介:陈晓军(1977-), 男, 硕士, 研究方向: 植物基因工程通讯作者:朱保葛(1960-), 男, 博士, 研究员, 博士生导师, 研究方向:植物遗传学与分子育种。
肿瘤转移抑制基因nm23H1产物在人鼻咽癌中表达的研究
肿瘤转移抑制基因nm23H1产物在人鼻咽癌中表达的研究
黄光琦;曾祥国
【期刊名称】《华西医科大学学报》
【年(卷),期】1997(028)001
【摘要】采用ＳＰ免疫组化技术，以ＮＤＰＫ／ｎｍ２３Ｈ１特异的单克隆抗体
为探针，对人鼻咽癌中ｎｍ２３Ｈ１的表达及其与颈淋巴结转移的关系进行了研究。
结果：３１例鼻咽癌中ｎｍ２３Ｈ１基因产物表达的阳性率为４１．９％（１３／３１）。
其中无转移组的阳性率为５２．３％（１１／２１），有转移组的阳性率为２０％（２／１０），两组间具有显著性差异（Ｐ〈０．０１），而在转移的颈淋巴结组织中ｎｍ２３Ｈ１产物表达极微或无表达，其
【总页数】5页(P40-44)
【作者】黄光琦;曾祥国
【作者单位】华西医大基础医学院;华西医大附属医院
【正文语种】中文
【中图分类】R739.630.2
【相关文献】
1.nm23H1、E-Cadherin和CD44基因产物在卵巢浆液性囊腺癌中的表达 [J],
施公胜;谢阳桂;孙超
2.鼻咽癌中CD44v6和nm23H1表达的原位杂交研究 [J], 谷化平;尚培中;刘艳茹;倪灿荣
3.肿瘤转移抑制基因KiSS-1在鼻咽癌中的表达及其意义 [J], 汪庚明;江浩;张磊;项
平;承泽农
4.肿瘤转移抑制基因nm23H1 mRNA在人非小细胞肺癌中的表达 [J], 陈仕林;梅举;张宝仁;朱家麟;叶玉坤;苏长青;汪栋;邵冲;张传生
5.高压氧联合放化疗对鼻咽癌患者血清中VEGF和nm23H1表达的影响 [J], 陈芳;柏玉举;张庭友
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利用tasiRNA介导的基因沉默技术验证抗病毒基因GmNH23的功能
利用tasiRNA介导的基因沉默技术验证抗病毒基因GmNH23的功能植物能够对入侵的病原体产生防御反应,包括生物、化学和物理系统性防御。
在生物系统性防御中依赖一类最重要的R(Resistance)基因编码的R蛋白,它可以特异性识别特定病原体,以激发植物的防御反应。
R基因分为多种类型,其中NBS-LRR类型是植物基因组中最大的基因家族之一,而TIR-NBS-LRR类型的抗病基因又是其中的一大类,包括烟草N基因、拟南芥RPS4基因等。
大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病是大豆的严重病害,但对其抗病基因的研究尚属滞后。
大豆GmNH23基因也属于TIR-NBS-LRR类型,与抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的烟草N基因同源,本实验室在前期研究中利用本氏烟草瞬时过表达系统验证了GmNH23基因对TMV和SMV都具有一定的抗性。
然而,GmNH23基因在稳定过表达植物中的抗病毒活性及其在大豆中的抗病毒功能尚未进行研究。
因此本论文从这两方面对GmNH23基因的功能做了深入研究。
首先,我们得到了GmNH23基因过表达(GmNH23-Ox)转基因本氏烟草,验证其对TMV和SMV均具有抗性,进一步证实了GmNH23基因对这两种病毒的抗性。
反式作用小干扰RNA(trans-acting siRNA,tasiRNA)是一类由特异的MicroRNA介导产生的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),能够通过转录后基因沉默来抑制中靶标基因的表达。
因此我们利用tasiRNA干扰大豆GmNH23基因的表达来验证其抗SMV和TMV的功能。
本研究利用产生内源tasiRNA的miR1514a设计并构建了干扰载体pKGWRR-tasiRNA-GmNH23。
首先通过17wt和rdr6 silence本氏烟草中瞬时表达法验证了tasiRNA-GmNH23对靶标基因的沉默作用。
植物NAC 转录因子的研究进展
·综述与专论·2012年第11期生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETINNAC 家族转录因子是近10年来新发现的具有多种生物功能的一类植物所特有的转录因子，广泛分布于陆生植物中，其共同特点是在蛋白质的N 端含有高度保守而又特异的NAC 结构域。
第1个被克隆的NAC 转录因子基因为矮牵牛（Petunia hybrida ）的NAM（No Apical Meristem）基因［1］，随后在拟南芥（Arabidopsis thaliana ）中发现了与NAM 结构类似的ATAF1/2和CUC2（cup -shaped cotyledon）转录因子基因［2］。
虽然转录因子NAM、ATAF1/2和CUC2的生物学功能各不相同，但它们的N 端都具有相似的结构，并以其名称的第1个字母命名为NAC 结构域。
目前，在许多植物中都发现了成员众多的含收稿日期: 2012-04-24基金项目:中国热带农业科学院橡胶研究所基本科研业务费专项资金（1630022011024）作者简介:康桂娟,女,博士,助理研究员,研究方向:橡胶树分子生物学; E -mail: guijuan.kang@植物NAC 转录因子的研究进展康桂娟 曾日中 聂智毅 黎瑜 代龙军 段翠芳（中国热带农业科学院橡胶研究所 农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，省部共建国家重点实验室培育基地—海南省热带作物栽培生理学重点实验室，儋州 571737）摘 要： NAC（NAM、 ATAF1、ATAF2和CUC2）转录因子是植物特有的一类转录因子，在多种陆生植物基因组中发现有超过100个成员，是植物基因组中最大的转录因子家族之一。
该家族转录因子的共同特点是其N 端具有保守的NAC 结构域，C 端则为高度变异和具有转录激活功能的调控区。
具有多种生物功能NAC 家族转录因子在植物生长发育、胁迫应答和激素调节等过程中具有重要作用。
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利用GmNH23基因过表达转基因植物对其广谱抗病毒特性的研究植物中克隆得到的抗病（resistance,R）基因大多数编码NBS-LRR类蛋白。
本实验室在前期研究中从大豆中克隆得到了一个NBS-LRR家族抗病毒蛋白编码基因GmNH23,对TMV（tobacco mosaic virus,烟草花叶病毒）和 SMV（soybean mosaic virus,大豆花叶病毒）具有抗性。
前期研究中我们只做了GmNH23基因的瞬时表达及抗性研究,而未进行稳定表达及其功能验证。
为了验证GmNH23稳定表达后的抗性,并验证其是否具有广谱抗病毒活性,本论文以马铃薯敏感品种夏波蒂为材料,得到了过表达GmNH23转基因马铃薯,对其抗病毒活性进行了研究。
建立了高效的马铃薯再生及遗传转化体系。
转化体系如下:马铃薯叶片预培养、共培养培养基为MS+1.6%葡萄糖+5 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA;愈伤组织芽诱导培养基为MS+1.6%葡萄糖+0.02 mg/L NAA+0.02 mg/L GA<sub>3</sub>+2.0 mg/L ZTR;农杆菌菌液侵染浓度OD<sub>600</sub>=0.7,侵染时间为15 min,共培养2 d;特美汀和头孢曲松钠作为脱菌剂,浓度分别为200 mg/L和500 mg/L;由于遗传转化所用的两种重组载体骨架上分别具有潮霉素（Hyg）和卡那霉素（Kan）标记基因,故采用两者进行抗性筛选,在芽诱导及生根阶段的浓度分别为4 mg/L和50 mg/L。
经愈伤组织再分化与抗生素筛选后获得多株马铃薯转化幼苗,经基因组PCR 技术鉴定到了21个阳性植株,经RT-PCR进一步检测发现16株转基因株系成功表达了GmNH23基因,Western blot实验也证明了GmNH23蛋白的表达。
PVY（potato virus Y,马铃薯Y病毒）是一种马铃薯的严重病害,且与SMV同属马铃薯Y病毒科（Potyviridae）。
利用PVY对GmNH23过表达马铃薯幼苗进行侵染发现与野生型植株相比,转基因植株的症状明显减轻;同时对前期实验室获得的过表达本氏烟草幼苗进行PVX、PVY侵染发现与野生型植株相比,转基因植株的症状明显减轻,在野生型本氏烟
草中瞬时表达GmNH23后侵染两种病毒,也均出现超敏反应,说明GmNH23对PVX、PVY均具有抗性。
本研究同时获得了GmNH23基因过表达的转基因烟草,对其T3
代经基因组PCR检测发现阳性检出率为100%,经RT-PCR进一步检测,阳性检出率为80%。
利用TMV-GFP对GmNH23基因过表达的转基因烟草进行侵染,发现与野生型植株相比,转基因烟草的病毒扩散率降低了约5倍,说明GmNH23在烟草中的稳定表达也表现对TMV的抗性。
综上所述,本论文的结果表明从大豆中克隆得到的GmNH23基因不仅对SMV具有抗性,同时还对PVX、PVY和TMV具有抗性,说明其具有广谱抗病毒特征。
本论文的研究成果为利用GmNH23改良作物对病毒的抗性打下了理论基础。