琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收

玻璃奶法
实验原理：
• 玻璃奶(Glassmilk)：无毒、无味、无腐蚀作用的 白色硅颗粒，能专一性结合0.2kb至50kb大小的 DNA（双链、单链、线性、环状或超螺旋），不 结合RNA、蛋白质、寡核苷酸、有机溶剂、去污 剂及其他可能抑制酶活性的有机或无机物。 • DNA与玻璃奶结合原理：在高盐状态下，玻璃奶 周围的负电荷被打破，并允许DNA的磷酸负电荷 与玻璃奶特异性结合。在低盐（H2O/1×TE）时 溶解分离。
DEAE滤膜插片法
• 将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。 • 电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的 DEAE纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳 一会儿，条带上的DNA被膜片截留。 • 取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65度保 温洗脱，直到膜上没有DNA了，将溶液用酚氯仿 抽提沉淀。 • 这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困 难。
DNA 结合率影响因素：
• 盐浓度：
– DNA<100bp:高盐状态下结合率高。 – DNA>100bp:低盐状态下结合率高。
• pH值：
– pH<7.0:结合率高。
应 用：
• 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段； • 从DNA反应物中纯化目的DNA片段，如回 收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA 片段； • 从探针制备反应中去除未标记上的核苷酸 以及小的DNA片段（比如引物）； • DNA浓缩，去盐及去除杂质。
5．涡旋震荡悬浮Ultra-Sep Beads，加入10 µl Ultra-Sep Beads到样品EP管中。50～ 55℃温育10min或时间至完全熔解。在温浴 过程中，每隔2 min震荡EP管悬浮UltraSep Beads。 注意观察胶完全熔解后胶/ Binding Buffer混 合物的pH值。当混合物pH＞8.0则DNA的 产量将会显著减少。如果混合物变为橙色 或红色，则加入5 µl 5M NaAC（pH5.2）以 降低pH值。加入NaAC后混合物的颜色应该 变为淡黄色。
DNA片段分离回收常用方法：
• • • • 电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法 DEAE滤膜插片法 玻璃奶法
电洗脱法
• 将含DNA片断的凝胶放在一个用半透膜隔 离的空间中，通过电泳的电流使得DNA离 开凝胶进入液相。 • 回收液相后纯化沉淀其中的DNA分子。
低熔点琼脂糖凝胶法
• 将切好的回收胶块放在回收胶槽内，在切 去胶块处加入低熔点琼脂糖胶，待其凝固 后将其小心放回电泳槽继续进行电泳。 • 待目的带完全进入低熔点琼脂糖胶后，在 长波紫外灯下切下含有所需DNA带的凝胶 条，置于新的EP管中，加300 µL TE。 • 65℃水浴10 min或更长使胶块完全融化。 • 酚氯仿抽提DN糖/EB凝胶电泳分离DNA片段
切取所要的DNA条带
溶解琼脂糖/EB凝胶
结合玻璃奶 离心沉淀玻璃奶 洗脱DNA DNA产量和质量测定
方法和步骤：
1．琼脂糖/EB凝胶电泳分离DNA片段。 2．紫外灯下切取所要的DNA条带。 3．将切下胶块放入1.5ml EP管中，称重，以确定胶 条的体积。 设定胶的密度为1g/ml，例如0.2g胶认为其体积为 0.2ml。 4.加入等体积的Ultra-Sep Binding Buffer。 对长度低于400bp的DNA片段或大于2%琼脂糖凝 胶，加入3×体积的Binding Buffer。
实验五
• 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收
– 玻璃奶法分离回收琼脂糖凝胶中DNA片段
• 质粒DNA的连接和转化
第一部分 琼脂糖凝胶中 DNA片段的分离和回收
——玻璃奶法分离回收琼脂糖凝胶 中DNA片段
实验目的：
• 掌握利用玻璃奶法从琼脂糖凝胶中分离回 收DNA片段的原理和操作技术; • 了解其他几种方法的原理与操作技术。
本方法的优点：
• 高纯度：回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白 质及其它有机分子，可直接用于酶切、连接、探 针制备、序列测定等； • 简便：所需主要仪器是一架台式离心机； • 快速：整个回收过程只需半个小时； • 高效：回收效率达到70%以上； • 多用途：可以用于胶回收、PCR产物回收、DNA 片段及探针的纯化浓缩等； • 安全：不接触苯酚、氯仿等有害物质。
12. DNA产量和质量测定： 适当稀释DNA，测定A260及A280。按照 计算公式计算DNA浓度： DNA浓度=吸光度260x50x稀释倍数mg/ml DNA纯度=A260/A280, ＞1.8表明样品核酸 纯度＞90%。
注意事项：
• DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带 时应使用长波紫外灯，切胶时间尽量短。 • DNA洗涤液应保持在低温，否则可能使DNA从玻 璃奶上脱落而导致回收率降低。 • 最后洗脱前尽量去除管壁和管底残留的洗涤液， 否则可能导致结合的DNA无法洗脱或洗脱液含有 杂质，影响继后操作。
实验材料：
• 使用Omega bio-Tek胶回收试剂盒（UltraSep Gel Extraction Kit）
Ultra-Sep Binding Buffer Ultra-Sep Beads DNA Wash Buffer Elution Buffer 300ml 5.5ml 2×80ml 60ml
9．弃上清并彻底去除离心管残余液体。空气中干燥 5～10min。 10．向管中加入15～50 µl（按最终产物浓度确定加 入体积）Elution Buffer（10mM Tris，pH8.5）。 涡旋震荡重悬沉淀，50℃水浴5min，10,000×g 离心1min，沉淀玻璃奶。 如果用水洗脱DNA，确定水的pH值在7.5～8.0之 间。 11．小心将上清转入另一EP管中，上清即含纯DNA。 约80～90%结合DNA被洗脱下来。
6．10,000×g室温离心1min，使Ultra-Sep Beads沉淀，弃上清。 7．加入300 µl Ultra-Sep Binding Buffer，涡 旋震荡Ultra-Sep Beads以洗涤玻璃奶。 10,000×g室温离心1min，弃上清。 8．加入750 µl预先按瓶上标签说明用无水乙 醇稀释的DNA Wash Buffer。涡旋震荡重 悬玻璃奶，10,000×g离心1min，沉淀玻 璃奶。