高效色谱仪分离方法的选择原则
高效液相色谱法
2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
（l）气相色谱法：分析对象仅占有机物总数的20％。 高效液相色谱法：分离和分析占有机物总数近80％的那些 高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质。
（2）气相色谱：流动相与组分不产生相互作用力，仅起运 载作用。 高效液相色谱法：流动相对组分可产生一定亲和力，并参与 固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数；
高压输液泵应符合下列要求：密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀。
高压输液泵
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱 柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差。 目前主要使用恒流泵，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械 往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（四）检测系统
两种基本类型的检测器： 溶质型检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、安培检测器等。 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应， 属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电化学检测器
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
§1
概 述
Introduction
一、高效液相色谱法概述
高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优 点，并用现代化手段加以改进。
引入了气相色谱的理论;
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器; 具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点;
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
液相色谱法和高效液相色谱法
溶剂等级
➢ 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，放置 时间越短，水质越高。
➢ 理想的HPLC用水应为18.2MΩ的超纯水，并通过 0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空 气等。
溶剂等级
有机溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯
都经过蒸馏和0.45µm的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒） 优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0.2µm的过滤,且除去有紫外吸收的杂质
《仪器分析》
液相色谱法
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
For Short：HPLC
色谱基础知识
主要内容
液相色谱法基础知识 液相色谱仪的主要部件
液相色谱仪的维护
色谱基础知识
色谱起源
1903年俄国植物学家 M. S. Tswett 提出经典液相色谱
C18柱的使用注意点
柱压应低于柱子的承受压力 柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 缓冲液pH使用范围为2～7
硅胶在PH为3～4时稳定性最好 碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。
检测器 进样器
储液瓶 高压输液系统
输液泵
数据处理系统
柱温箱
常用检测器
紫外检测器（UV） 二极管阵列检测器（PDA） 荧光检测器（FL） 示差折光检测器 蒸发光散射检测器
溶剂等级
分析纯级(实线）和 HPLC 级溶剂（虚线）的吸光度比较
甲醇
乙睛
正己烷
溶剂等级
缓冲盐的使用：
使用前必须过滤 使用后一定要对柱子进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨
损及阻塞：首先用纯水冲洗10-30min，再用甲醇冲 洗30min(0.5-1ml/min)
第五章高效液相色谱法
数据处理系统
打开工作站，选择工作通道 编辑方法文件，设置方法名称、运行时间及定量方法 输入路径名、样品名、操作者等 样品分离完成后，记录谱图文件名和色谱峰峰高、峰面积和保留值等
2019/7/25
四. 液相色谱固定相
1.液-固色谱固定相
种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm；
（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响
小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。
2019/7/25
气相色谱中的固定相原则上都可以用于液相色谱，其选 用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但 在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的 工作，一般很少自行制备。
2019/7/25
光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
2019/7/25
二极管阵列检测器
样品池 D2 / W 灯
光栅
每一组分可在每一波 长处得到一吸光度值
二极管阵列
二极管阵列检测器的优点
1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未测到的峰
2019/7/25
2. 液-液色谱固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
高效液相色谱HPLC简介
h
AB
1/10h
拖尾
T
f
＝
B A
前伸
液相色谱图相关术语(3)
色谱图相关术语: 基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所 产生的响应信号的曲线 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓 慢变化 基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起 的基线波动
• 溶剂过滤：常用0.5μm膜过滤。HPLC级溶剂：无微粒，无紫外吸收，已用 0.2μm膜过滤。
• 贮液瓶要不定期更换，要有2～3个备用瓶，定期用酸、水、溶剂清洗。 • 沉子：用三个月后必须清洗或更换，若未用沉子，则必须用0.5μm膜过滤。
溶剂脱气
脱气：正相色谱如非水性凝胶色谱的流动相不必脱气，反相色谱的流动相需 要脱气。 He氦气脱气：10min可以除去80～90％溶入的气体，但价格昂贵 真空脱气：这是最常用的方法，可用真空抽滤流动相的方法代替。 超声脱气：使用方便，但只能脱气30％ 加热回流：最彻底的脱气方法，混合流动相不能用
底相交两点之间的距离 –半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰
高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧 相交两点之间的距离
HPLC的图形结果 --色谱图(Chromatogram)
色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.
改变a的途径 改变固定相 改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质
在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加 。
确定最佳的溶剂强度
• “试-凑法”，即先用一种可能过强的流动相，在后面的实验中逐步减小溶 剂强度以增加k’，当所有谱峰的k’介于1—20时，其流动相已经接近最佳 了。
高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站 开始记录并出图11。 5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次， 获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分 别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。 6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
液相色谱质谱分析
质谱图是以质荷比(m/z)为横坐标、相对强度为纵坐标构 成，将原始质谱图上最强的离子峰定为基峰并定为相对强度 100％，其他离子峰以对基峰的相对百分值表示。
丙酮的质谱图
（2）离子峰的主要类型
分子在离子源中可产生各种电离，即同一分子可产生多 种离子峰：分子离子峰、同位素离子峰、碎片离子峰、重排 离子峰、亚稳离子峰等。 设有机化合物由A，B，C和D组成，当蒸汽分子进入离子 源，受到电子轰击可能发生下列过程而形成各种类型的离子：
CH3
1) 根据质谱峰的质荷比测定化合物的分子量， 推测分子式及结构式 2) 根据峰强度进行定量分析
2.质谱仪的结构
（1） 进样系统
作用：将样品分子引入到离子源中。 方式： 蠕动泵连续进样
六通阀直接进样 色谱进样系统
(2) 离子源
作用：
1. 将导入质谱仪系统的样品去溶剂化 2. 将离子源处的大气压与质谱仪系统一级 真空阻隔开 3. 被分析物离子化或将溶剂中的离子转化 成气相 4. 去除中性物质和带反极性电荷离子，否 则会对分析产生干扰
电喷雾电离源(ESI)
多电荷离子 测定的样品分子量大
(3) 质量分析器
作用: 是将不同碎片按质荷比m/z分开。 质量分析器类型：磁分析器、飞行时间、四 极杆、离子捕获、离子回旋等。
a 单聚焦型磁分析器
b 四级杆分析器
(4) 检测器
质谱仪常用的检测器有法拉第杯(Faraday Cup)、 电子倍增器及闪烁计数器、照相底片等。
分配比变化范围宽的 复杂样品应采取 梯度洗脱方式分离
流动相溶剂选 择的一般要求
1) 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。 2) 适用于所选择的检测器。 3) 化学惰性好，以免破坏固定相。 4) 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。 5) 纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。
高效液相色谱分析法(仪器+组成+分离类型+流动相选择)
2、主 要 部 件
(1) 高压输液泵
主要部件之一，压力：30MPa以上。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10μm），液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱 的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、 流量稳定可调、耐腐蚀等特性
(2)梯度淋洗装置
3.离子交换色谱分离固定相
结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂
薄壳玻璃珠为担体，表 面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相
薄壳键合型；微粒硅胶 键合型（键合离子交换基团）
树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸 性、弱酸性） （2） 阴离子交换树脂（强碱 性、弱碱性）
4. 空间排阻分离固定相
liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较
常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：利用溶质分子占据固定相表面吸 附活性中心能力的差异；适用于分离相对分子 质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合 物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
GC：H = A + B / u + C • u （填充柱）
A = 2λ • dp
A ∝ λ • dp
B = 2γ • Dm = 2γ • Dg B ∝ t R ，B ∝ Dg
Dg
∝
T η
或Dg
∝
T M
B = 2γ • Dm
Dm
∝
T η
柱温T ↓低，流动相η ↑大 ⇒B相忽略
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数
(4) 高效分离柱
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
高效色谱仪分离方法的选择原则
高效液相色谱（HPLC）是现代色谱分析中最常用、最重要的一种手段，在化学、药学、生物学、食品分析等领域得到了广泛应用。
在HPLC分离过程中，选择合适的分离方法对于得到准确、可重复的结果至关重要。
本文将从分离选择原则、分子特征、环境因素以及现有技术手段等方面探讨高效色谱仪分离方法的选择原则。
分离选择原则
1.根据化学性质：对于化学性质相近的化合物，要选择具有不同物化性
质的高效色谱分离方法，如极性物质采用反相色谱（RP）分离、非极性物质
采用正相色谱（NP）分离，对于具有官能团的化合物可以采用离子交换色谱
（IEC）分离。
此外，在HPLC分离过程中，需要注意分离剂与样品的相容性，避免对样品造成影响。
2.根据分子量：分子量越小的化合物，分子扩散速率越快，利于分离，
此时较为适合采用反相液相色谱分离。
分子量大、分子活力较小的化合物，采用正相液相色谱分离技术，可以更好地实现分离和纯化。
3.根据结构异构体：含有结构异构体的化合物需要选择能分离出它们之
间的差异的高效色谱分离方法。
例如，立体异构体可以采用手性反相液相色谱（CHIRAL）分离，卤代苯酚的同系列化合物可以通过环境友好型的互作性液相色谱（GPC）来分离。
4.根据检测方式：对于不同检测方式下需要分离的物质，需要选用对应
的高效色谱分离方法。
如对于AAS检测需要检测的有机汞化合物，可以采用甲基丙烯酸甲酯-硼酸盐-等离子体色谱（MBAA-BP-ICPMS）分离。
分子特征
1.化合物的极性：化合物的极性差异直接影响HPLC分离的选择，对于
极性物质常常采用RP分离，而对于非极性物质常常采用NP分离。
在选择RP 分离柱时，除了考虑碳链长度的差异，还要考虑极性团的不同。
2.化合物的光学活性：光学异构体的分离一般采用手性固定相。
例如，
可采用巯基乙二胺手性固定相（CYD）与苯基磷酸双(1-萘酰)二乙酯手性固定相（NPT-Ph-PhSP）对光学异构体进行分离。
3.化合物的紫外光吸收性：对于具有紫外吸收性质的化合物，可以采用
UV检测技术进行分离，对于化合物的分离选择，可以采用不同的波长检测方法。
环境因素
1.pH值：不同的化合物在不同的pH值下以及溶剂中的某些成分下的
分离效果差异较大，需要在保证其稳定性的前提下进行对于pH值的控制。
2.温度：在分离的过程中，温度对于HPLC分离的选择也有很大的影响。
一般情况下，在标准的室温下HPLC分离有很好的效果，但是有些需要进行温度控制的实验也是需要的。
现有技术手段
随着科技的日益发展，高效色谱仪的分离技术也在不断更新换代，可以通过以
下几个方面进行选择：
1.柱子类型：如动态壁涂层柱、芯片技术、超临界流体技术等。
2.分离模式：如普通相分离、反相分离、离子交换、手性分离等。
3.连接方式：如在线或离线固相萃取（SPE）、在线或离线前处理、联
用质谱等。
因此，选择合适的高效色谱仪分离方法，需要综合考虑以上因素，制定相应的
实验方案，并根据样品数量及对样品提纯的要求合理选择色谱柱、流动相和检测条件。
总结
HPLC分离技术在化学、药学、生物学、食品分析等领域得到了广泛应用，合
理选择分离方法对于预防交叉污染、保证分析结果以及提高实验效率都有很大的帮助。
因此，进行分离选择时应当综合考虑分子特征、环境因素以及现有技术手段等方面，选择适合的分离方法，制定实验方案，进行准确、可重复的分析结果。