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高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
《高效液相》课件
蛋白质分离与纯化
蛋白质分离
高效液相色谱技术可以用于蛋白质的分离和纯化，通过不 同的分离模式和固定相选择，实现对蛋白质的快速分离和 纯化。
蛋白质性质分析
通过高效液相色谱技术可以对蛋白质的性质进行分析，如 蛋白质的分子量、等电点等，为蛋白质的结构和功能研究 提供有力支持。
蛋白质相互作用研究
高效液相色谱技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用， 如蛋白质与配体、抑制剂等之间的相互作用，有助于深入 了解蛋白质的功能和作用机制。
原理
利用不同物质在固定相和流动相之间 的分配系数差异进行分离，通过检测 器进行检测，收集各个组分，达到分 析样品组分的目的。
发展历程
01
02
03
04
起源
20世纪初，俄国植物学家茨 维特发明了色谱法。
1940年代
气相色谱法（GC）出现，并 逐渐发展成熟。
1960年代
高效液相色谱法（HPLC）开 始发展，并逐渐取代气相色谱
02
高效液相色谱仪
仪器组成
进样器
将样品注入色谱柱，是 色谱仪的重要部件之一
。
色谱柱
用于分离样品中的各组 分，由固定相和流动相
组成。
检测器
检测色谱柱流出的组分 ，并将其转换为电信号
。
数据处理系统
用于采集、处理和显示 检测器输出的信号。
重要部件介绍
01
02
03
色谱柱填料
常用的填料有硅胶、氧化 铝、活性炭等，根据不同 分离需求选择合适的填料 。
《高效液相》ppt课件
目录
• 高效液相色谱法简介 • 高效液相色谱仪 • 高效液相色谱分离技术 • 高效液相色谱在生物医药领域的应用 • 高效液相色谱实验技术 • 高效液相色谱技术前沿与展望
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
第二章高效液相色谱法31页PPT
主要部件之一，包括贮液装置、高压输液泵、过滤器、脱 气装置等 高压输液泵压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 基本要求：
应具有压力平稳、脉冲小、流量稳 定可调、耐腐蚀等特性
又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ) 的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中 104个组分.
2020/3/26
小结
综上所述，高效液相色谱法是吸取了气 相色谱与经典液相色谱的优点，具有高柱 效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、 重复性好、应用范围广等优点。
目前高效液相色谱法已被广泛应用于分 析对生物学和医药上有重大意义的大分子 物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖 类、植物色素、高聚物、染料及药物等物 质的分离和分析。
定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。
2020/3/26
2020/3/26
三、影响分离的因素 1. 固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色 谱，其选用原则与气相色谱一样。
，分离柱的制备是一项 技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。
最常用的检测器。
2020/3/26
光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
2020/3/26
（6） 数据处理系统
色谱工作站的功能：
• 色谱参数的选择和设定； • 自动化操作仪器； • 色谱数据的采集和存储，并作“实时”处理； • 对采集和存储的数据进行后处理； • 自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。 • 同时也可把一些常用色谱参数、操作程序，及各种
应具有压力平稳、脉冲小、流量稳 定可调、耐腐蚀等特性
又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ) 的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中 104个组分.
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小结
综上所述，高效液相色谱法是吸取了气 相色谱与经典液相色谱的优点，具有高柱 效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、 重复性好、应用范围广等优点。
目前高效液相色谱法已被广泛应用于分 析对生物学和医药上有重大意义的大分子 物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖 类、植物色素、高聚物、染料及药物等物 质的分离和分析。
定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。
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三、影响分离的因素 1. 固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色 谱，其选用原则与气相色谱一样。
，分离柱的制备是一项 技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。
最常用的检测器。
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光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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（6） 数据处理系统
色谱工作站的功能：
• 色谱参数的选择和设定； • 自动化操作仪器； • 色谱数据的采集和存储，并作“实时”处理； • 对采集和存储的数据进行后处理； • 自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。 • 同时也可把一些常用色谱参数、操作程序，及各种
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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本品每1ml含黄芩以黄芩苷（C21H18O11）计，不得少于10.0mg。 【规格】每支装（1）10ml（每1ml相当于饮片1.5g） （2）20ml（每1ml相当于饮片1.5g） （3）10ml（每1ml相当于饮片3.0g） 讨论：1.如何配制流动相？
2.试写出其计算格式。
谢谢 ！
制作人 卓菊
• 讨论：1.测定方法的不同，是否会影响药品的质量？ 2.检测方法的变化是否会影响检测结果？ 3.先进的检测技术，在保障人民用药安全、有效方面，有何重要性？
• 《中国药典》规定，三黄片中盐酸小檗碱的测定方法是高效液相色谱 法，试分析其不符合规定的原因。
案例：双黄连口服液中黄芩苷的测定
【含量测定】黄芩 照高效液相色谱法（通则0512）测定。 色谱条件与系统适用性试验 ：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸（50:50:1）为流动相； 检测波长为274nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于1500。 对照品溶液的制备： 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。 供试品溶液的制备： 精密量取本品1ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理20分钟，放置至室温， 加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 测定法 ：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
《中药制剂分析》
高效液相色谱法-案例
含量测定方法
• 案例：随着方法学的进一步研究，同一种药物制剂的检测方法在不同版《中国 药典》可能存在变化，例如止咳宝片、》2005年版采用的是紫外-可见分光光度法，《中国药典》 2015年版采用的是高效液相色谱法。
2.试写出其计算格式。
谢谢 ！
制作人 卓菊
• 讨论：1.测定方法的不同，是否会影响药品的质量？ 2.检测方法的变化是否会影响检测结果？ 3.先进的检测技术，在保障人民用药安全、有效方面，有何重要性？
• 《中国药典》规定，三黄片中盐酸小檗碱的测定方法是高效液相色谱 法，试分析其不符合规定的原因。
案例：双黄连口服液中黄芩苷的测定
【含量测定】黄芩 照高效液相色谱法（通则0512）测定。 色谱条件与系统适用性试验 ：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸（50:50:1）为流动相； 检测波长为274nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于1500。 对照品溶液的制备： 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。 供试品溶液的制备： 精密量取本品1ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理20分钟，放置至室温， 加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 测定法 ：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
《中药制剂分析》
高效液相色谱法-案例
含量测定方法
• 案例：随着方法学的进一步研究，同一种药物制剂的检测方法在不同版《中国 药典》可能存在变化，例如止咳宝片、》2005年版采用的是紫外-可见分光光度法，《中国药典》 2015年版采用的是高效液相色谱法。