高效液相色谱定性定量分析方法
高效液相色谱法
答：气相温度对于样品的气化程度影响很大,一般来说温度越高,气化越快,通过色谱柱时间也越短,气相单一物质分析一般用恒温,多种物质分析时,通过改变柱温能够很好的对样品进行分离,节省了分析时间,这时往往用梯度升温。
3、若标准曲线用咖啡因浓度对峰高作图，能给出准确结果吗？与本实验的标准曲线相比何者优越？为什么？
答：能，浓度对峰面积更优越。因为有些峰不完全对称，用它作标准曲线误差较大。
4、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？
答： 干过滤主要是保持溶液浓度不变而采取的一种过滤方法，前液中可能有一些滤纸或滤膜上的杂质存在，为了保持溶液浓度不变，所以要将前液去掉。干过滤为分离掉溶液中的固体并且不改变溶液浓度而采取的一种方法。为保持溶液浓度不变。前段滤液要弃去，并且滤纸漏斗盛接的烧杯都要干的。这样做不会影响实验结果。
液相并不是都是室温,一般来说,温度对于反相色谱分析影响不大,所以用反相柱分析时,一般用室温,不配备柱温箱,但是很多正相色谱分析时对于温度要求比较严格,比如说配位体交换色谱法时,温度的影响还是很大的。
5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。
6、10μL平头微量注射器。
四、实验内容
1、标准贮备液配制质量浓度分别为20、40、80、160μg·mL-1的标准系列溶液。（1mL，2mL，4mL，8mL稀释为50mL）
2、谱仪器条件：
泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：4μL；柱温：室温。
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间tR和峰面积A后，可直接用tR定性，用峰面积A作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
hplc检测方法
hplc检测方法HPLC检测方法高效液相色谱(HPLC)是一种广泛应用于化学、制药、食品、环境等领域的分析技术。
HPLC检测方法能够对样品中的化合物进行定量和定性分析，具有灵敏度高、分离效果好、选择性强等优点。
下面将介绍HPLC检测方法的原理、步骤、注意事项等方面的内容。
一、原理HPLC检测方法的原理是利用不同化合物的物理化学性质，如分子量、极性、亲水性、亲油性等，在高压力下通过固定在柱子中的固定相进行分离。
样品成分通过柱子后，会在检测器中产生信号，根据不同成分的信号大小进行定量分析。
二、步骤HPLC检测方法的步骤主要包括：样品制备、柱子选择、流动相配置、样品进样、分离、检测等。
1. 样品制备：样品制备是HPLC检测方法的第一步。
样品制备的目的是将复杂的样品进行简化，使其易于分离和检测。
常用的样品制备方法包括提取、纯化、水解、酸解等。
2. 柱子选择：柱子是HPLC检测方法中最重要的部分之一。
柱子的选择应根据不同样品的性质和分离要求进行选择。
常见的柱子类型有反相柱、离子交换柱、凝胶柱等。
3. 流动相配置：流动相是HPLC检测方法中的另一个重要组成部分。
流动相的选择应根据不同样品的性质和柱子类型进行选择。
常用的流动相包括水、有机溶剂、缓冲液等。
4. 样品进样：样品进样是HPLC检测方法中的关键步骤之一。
样品进入柱子前必须经过进样器。
进样器的选择应根据不同样品的性质和进样量进行选择。
5. 分离：分离是HPLC检测方法中最核心的部分之一。
分离的目的是将样品中的成分分离出来。
分离过程中，样品成分会根据不同的化学性质在柱子中进行分离。
6. 检测：检测是HPLC检测方法中的最后一步。
检测器会对柱子中流过的各个成分进行检测，根据不同成分的信号大小进行定量分析。
三、注意事项在进行HPLC检测方法时，需要注意以下几点：1. 样品应尽可能纯净，避免杂质的干扰。
2. 流动相的选择应准确，避免对柱子产生损害。
3. 进样量应适当，过多或过少都会影响检测结果。
高效液相色谱法3
2.内标法 内标法分为 工作曲线法 内标一点法 内标二点法 内标对比法 校正因子法 在HPLC中最常用内标对比法。 选择内标物的三个条件(纯、样品中不含有、保留时 间接近)，在HPLC中的要求与GC完全一致。一般可选择 一个化学结构与待测物质相似、物理性质相近的纯物质作 为内标物，加到待测样品溶液中，经过样品前处理后进样。 使用内标法可抵消因仪器稳定性差、进样量不够准确等原 因带来的实验误差。
(一) 多环芳烃的分析 一 多环芳烃的分析(图21－18) 多环芳烃的分析，可用反相或吸附色谱法分析。反 相色谱法用ODS柱，用乙腈−水或甲醇−水为流动相。但用 甲醇−水时，保留时间较长，因此多采用梯度洗脱。多环 芳烃也可用硅胶(YWG等)柱，以不含水的正己烷为流动相， 也能获得较好的分离效果，但需注意溶解样品的溶剂应与 流动相的性质相近。许多多环芳烃是致癌物质，其含量监 测在食品分析与环境保护监测中都有实用意义。
(1)内标对比法： 这种方法不需知校正因子又具有内标法的定量准确 度与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分 析结果(含量)常用标示量％表示:
( Ai / As )样品 (ms )样品 W 标示量% = × × ×100% ( Ai / As )对照 (ms )对照 m
(21.13)
式中(ms)样品与(ms)对照分别是内标物在试样溶液及对照溶液 中的量，W为平均片重(或丸重等)，m是取样量，其它符 号的含义同GC章。若试样溶液与对照溶液中加人内标物 的量相等，所称取的样品重与平均片重相同，则上式的后 二项均等于1。
A的标示量％=(178024／202694)÷(154856／171222)×100％=97.l％ P的标示量％=(820968／202694) ÷(692272／171222)×100％=100.l％ C的标示量％=(407792／202694) ÷(372221／171222)×100％=92.5％
液相色谱法定量分析与案例分享
液相色谱法定量分析与案例分享
定量分析是在定性分析的基础上，需要纯物质作为标准样品。
液相色谱的定量是相对的定量方法，即：由已知的标准样品推算出被测样品的量。
液相色谱法定量的依据
被测组分的量(W)与响应值(A)（峰高或峰面积）成正比,W=f×A。
定量校正因子(f)：是定量计算公式的比例常数，其物理意义时单位响应值（峰面积）所代表的被测组分的量。
由已知标准样品的量和其响应值可以求得定量校正因子。
测定未知组分的响应值，通过定量校正因子即可求得该组分的量。
定量分析常用术语：
样品（sample）：含有带测物，供色谱分析的溶液。
分为标样和未知样。
标样（standard）：浓度已知的纯品。
未知样（unknow）：浓度待测的混合物。
样品量（sampleweight）：待测样品的原始称样量。
稀释度（dilution）：未知样的稀释倍数。
组分（componance）：欲做定量分析的色谱峰，即含量未知的被测物。
组分的量（amount）：被测物质的含量（或浓度）。
积分（integerity）：由计算机对色谱峰进行的峰面积测量的计算过程。
校正曲线（calibrationcurve）：组分含量对响应值的线性曲线，由已知量的标准物建立，用于测定待测物的未知含量。
常用的定量方法
1外标法
标准曲线法，分为外标法和内标法。
外标法在液相色谱中用的最多。
内标法准确但是麻烦，在标准方法中用的最多。
210988827_高效液相色谱串联质谱法测定水果、蔬菜中双胍辛胺的定性定量分析研究
分析检测高效液相色谱串联质谱法测定水果、蔬菜中双胍辛胺的定性定量分析研究尹丽丽（上海华测品标检测技术服务有限公司，上海 201112）摘 要：目的：建立水果和蔬菜中双胍辛胺的高效液相色谱串联质谱法的定性定量分析方法。
方法：样品经过正丁醇∶正己烷=1∶1混合溶液提取，再用酸化水净化。
以高效液相色谱质谱联用仪检测萃取液中的双胍辛胺的含量，采用HILIC-C18柱分离，在ESI正离子模式下，以质谱多反应监测，采用外标法进行定量分析。
结果：在10～500 ng·mL-1，双胍辛胺的线性良好，相关系数R＞0.995，检出限为0.002 0 mg·kg-1，定量限为0.011 mg·kg-1，双胍辛胺在3个浓度添加水平下，水果回收率在92.7%～108.9%，蔬菜回收率在96.2%～110.0%，水果相对标准偏差为1.15%～4.45%，蔬菜相对标准偏差为1.36%～2.15%。
结论：本研究建立的高效液相色谱串联质谱法测定双胍辛胺的方法准确、快速，能够满足水果、蔬菜中双胍辛胺的分析要求。
关键词：双胍辛胺；高效液相色谱串联质谱；水果；蔬菜Determination of Iminoctadine in Fruits and Vegetables by High Performance Liquid Chromatography-Tandem MassSpectrometryYIN Lili(Shanghai Huabiao Testing Technology Service Co., Ltd., Shanghai 201112, China) Abstract: Objective: A method was developed for the determination of iminoctadine of fruits and vegetables by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method: The sample was extracted with the solution of butyl alcohol and hexane (1∶1), and then cleaned-up by acidified water. Iminoctadine was determined by liquid chromatography mass spectrometer with a HILIC chromatographic column, analyzed in positive electronic spayionization (ESI+) mode with multiple reaction monitoring, and quantified by the external standart method. Result: The calibration curves were linear with the correlation coefficients over 0.995 in the range of 10～500 ng·mL-1 for iminoctadine. The limits of detection were 0.002 0 mg·kg-1. The limits of quantification were 0.011 mg·kg-1. The mean recoveries of iminoctadine at three spiked levels were in the range from 92.7% to 108.9% of fruits and 96.2%～110.0% of vegetables, with the relative standard deviations were in the range from 1.15%～4.45% of fruits and 1.36%～2.15% of vegetables. Conclusion: Determination of iminoctadine in fruits and vegetables by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was established in this study which was accurate and rapid, suitable for analysis of iminoctadine in fruits and vegetables.Keywords: iminoctadine; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; fruits; vegetables双胍辛胺是一种广谱性杀真菌剂，对某些病原真菌有很高的生长抑制活性，其作用方式是抑制病菌类脂的生物合成，是触杀和预防性杀菌剂，对大多数由子囊菌和半知菌引起的真菌病害有很好的效果[1]。
高效液相色谱法测定片剂中的有关物质
高效液相色谱法测定片剂中的有关物质
高效液相色谱法是一种常用的分离和定量分析技术，可以用于测定片剂中的有关物质。
下面是测定片剂中有关物质的高效液相色谱法的一般步骤：
1. 样品制备：将片剂样品研磨或粉碎，并取适量样品称量到容量瓶中，加入适量的溶剂溶解和稀释，制备成一定浓度的溶液。
2. 色谱柱选择：选择合适的色谱柱，如反相色谱柱、离子交换柱等，根据需要选择合适的柱温和洗脱溶剂。
3. 色谱条件设置：设置适当的流速、波长和柱温等条件。
根据目标物的性质和样品矩阵的特点，选择合适的检测波长和色谱条件，以提高分离效果和检测灵敏度。
4. 样品注射：用自动进样器或手动注射器将制备好的样品注入到色谱柱中。
5. 色谱分离：通过调整洗脱溶剂浓度梯度或使用不同的洗脱溶剂组合，将目标物和其他干扰物逐渐从色谱柱中洗脱出来。
6. 结果分析：根据色谱检测器所得到的响应信号，通过定量分析软件对色谱峰进行峰面积计算，进而根据内标法或外标法进行定量测定。
7. 方法验证：对该方法进行准确性、重复性、线性、灵敏度和选择性等方面的验证，确保测定结果的准确性和可靠性。
需要根据具体的有关物质，选择合适的色谱柱和洗脱溶剂，并进行合适的优化和验证，以确保测定的准确性和可靠性。
色谱定性定量分析方法
⑥稳定性（stability）：
意义： 考察分析样品与试剂在一定时间内稳定性。 内容：
根据样品与试剂测定时实际可能所处的环 境进行考察。
⑦耐用性（ robustness ）：
意义： 考察测定条件发生小变动时测定结果的变化。
内容：
流动相的组成和pH、商品柱的品牌尺寸、 柱温等
广泛用于药物中的杂质、体内外代谢产物的结构鉴定
重现性: 不同实验室，不同人测定的精密度 1、色谱信号的测量:
意义： 待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围；
相对保留值 α, (t-t0)/(tr -t0）
2、选择合适的离子源，利用LC-MS获得杂质的准分量不同浓度的对照品，比较测定值和加入值确定。
ELSD响应的自然对数与样品的浓度或质量呈线 性关系；
质谱（MS-ESI）检测器高浓度时的响应与样品 的质量可能呈二次或更复杂的方式。
四、色谱分析方法验证
目的：
证明所采用的色谱分析方法适合于相应的检验 要求，判断能否用于药品分析。
效能指标：评价分析方法的尺度
效能指标包括: 精密度、准确度、专属性、检测限、定量限、
tr
内容： LC-ESI-MS的
要求，判断能否用于药品分析。 内容： 药物制剂含量测定时的专属性考察内容：
重复性 广药泛品用 质于量药标物准中分的析杂方质法:、验体证内外代同谢产一物的实结构验鉴定室,同一人多次测定的精密度
中间精密度 2药、品选质择量合标适准的分离析子方源法，验利证用LC:-MS同获得一杂质实的准验分子室离子，峰。不同人，不同仪器测定的精密度
线性与范围、耐用性、稳定性、系统适用性等
不同分析测定方法的要求
药品质量标准分析方法验证 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验
高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站 开始记录并出图11。 5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次， 获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分 别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。 6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
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滞后体积变化的影响
设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果：
梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性
固定滞后体积，改善了梯度性能 梯度百分比
梯度曲线
好的梯度 滞后曲线
保留时间
普通的低压梯度系统 梯度百分比
不好的梯度 滞后曲线
保留时间
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的 固定相。
色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适 的溶剂进行洗净。
▫ 对压力、温度及流速等变化不敏感 • 长时间操作的稳定性 • 低死体积 • 非破坏性 • 选择性
灵敏度：信噪比
• 灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的6比:1值
（S/N）
• 检测限（LOD）：S/N = 2~4
• 定量限（LOQ）：S/N = 8~10
• 好的信噪比有利于：
S
▫ 更好的色谱峰确认
一些商品化仪器
流动相 脱气装置
四元泵
检测器 柱温箱 样品盘
控温箱
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源，
待设备通过自检后，打开计算机启动 色谱管理软件 准备流动相
过滤，脱气 色谱泵排气
用新配制的流动相灌注泵
高效液相色谱仪组成
▫ 输液系统 ▫ 进样系统 ▫ 分离系统 ▫ 检测系统 ▫ 数据记录处理系统
RS变化值 1.6
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱
对溶剂的要求水
• 溶剂:
色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）
• 试剂:
分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体 积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再 生。
HPLC检测器应提供的功能
• 对样品有响应并有一个输出信号 • 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并
且所设计的校正技术应该促进这种关系
理想的HPLC检测器
• 高灵敏度；可忽略的基线噪音 • 宽的线性范围 • 独立于流动相及操作参数的响应
2．梯度洗脱的主要条件 ① A 流动相/弱溶剂组成；
强溶剂 A%
② B 流动相/强溶剂组成；
③ 梯度时间；
④ 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。
time
5 2 1
梯度洗脱
3
2 1
梯度：低压混合
• 低压梯度 ▫ 用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 ▫ 对脱气要求高 ▫ 不易调节梯度的滞后体积
• 如设计不当，梯度的 准确性受影响 ▫ 滞后体积（系统 体积）设计合理
▫ 更好的定量
▫ 更好地完成色谱峰纯度/均一性
N
吸• 光目度前（实A验bs室or中ba最nc流e 行UV的/V选is择）检测 ▫ 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多 波长，25%是PDA）
• 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 • 吸光度与样品浓度呈线性关系 • 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
高效液相色谱定性定量分析方法
基本原理和特点
➢基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固 定相时,由于与 固定相(stationary phase)发生作用(吸附, 分配,离子吸引,排阻,亲和)的大小,强 弱不同,在固定相中 滞留时间不同,从而先后从固定相中流出.
➢特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动 化。
• 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um 的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。
过滤与脱气
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是 使用无机盐配制的缓冲液。
脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
1．梯度洗脱的特点
（1）改善分离, 加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于 痕量组分的检测； （3）增加峰容量； （4）强烈滞留的组分不容易残留在 柱上, 保持柱性能长期良好； （5）下次分析时, 流动相需要一段 平衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍 有差异, 可能会引起基线漂移
吸• 光这度种检检测测器器（简U单V/、Vi可s）靠－ 优点 • 多数人熟悉并喜欢这种技术 • 可以作梯度实验并且是非破坏性的 • 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 • 一般来说灵敏度还可以
梯低压梯度滞A DB后C：系溶 系统剂 统体(输泵积送)的影阻 混响尼 合器 器
度 比例阀
进样器
色谱柱
检测器
滞后(系统)体积
注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路
滞后(系统)体积
高 压
溶剂输送 系统(泵)
梯 度
溶剂输送
系统(泵)
进样器
梯度混合器
死体积/谱带展宽体积 (无色谱柱时)
色谱柱
液相色谱流程图
溶剂
HPLC色谱柱
数据处理系统
自动进样器 色谱泵
检测器
废液
液相色谱的流动相
色谱液柱：相Zo柱rbax-S-ta-b4保l.e6B*o2留n5d0mmC值,158um与pH的关系
流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 温度： 50℃ 流速： 1.0mL/min.
pH变化值 0.1
检测器
梯度滞后大小的影响
滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 ▫ 例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 ▫ 对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受
滞后体积的不同会使方法转换麻烦 ▫ 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 ▫ 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好