高效液相色谱定性定量分析方法==
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高效液相色谱简介及操作
HPLC和经典液相色谱法的比较
3.高效液相色谱法的分类
• 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色 谱法和凝胶色谱法四大类。
4.如何阅读色谱图？？
tR：保留时间；tM：死时间； ：调整保留时间； W：峰宽
• 定性分析：在同一色谱系统中相同物质具 有相同的保留值 • 定量分析：组分含量与其响应值（峰高或 面积）成正比
2 色谱柱使用的注意事项
• 色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。 • 当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存（一般 为甲醇）。 • 每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱。
3 其他注意事项
• 未经提取净化的蛋白样品、血样、生物样品绝对禁 止直接进样分析。 • 要注意流动相的脱气。 • 避免使用高粘度的溶剂作为流动相。 • 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或缓冲液建 议不超过两天，最好每天更换。
（5）色谱柱平衡后，打开检测器（开灯） （6）测定样品 （7）清洗仪器
色谱柱及流路清洗 进样阀清洗 进样针清洗
四、主要注意事项
1 泵使用的注意事项
•
• •
• •
防止任何固体微粒进入泵体（用0.22 um或0.45 um 的微孔滤膜过滤） 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流 动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。 泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运 转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、 密封圈，最终产生漏液。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。 流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量 的稳定性和分析结果。
c. 荧光检测器 (FLD) 只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基 酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。
高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)
高效液相色谱测定饮料中的苯甲酸
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
三．仪器和试剂： 1． 高效液相色谱仪，VWD（254nm）检测仪。 2．色谱柱：C18 3．超声波发生器或水泵(用于过滤或排气) 4．注射器：50微升 5．容量瓶：100ml若干 6．移液管：2ml、4ml、8ml 7．流动相：甲醇：乙酸+乙酸氨（PH=3.5）=60：40， 制备前，先调节水(用酸或缓冲盐)的PH=3.5，进入系统 色谱前，用超声波发生器或水泵脱气。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
三．仪器和试剂： 1． 高效液相色谱仪，VWD（254nm）检测仪。 2．色谱柱：C18 3．超声波发生器或水泵(用于过滤或排气) 4．注射器：50微升 5．容量瓶：100ml若干 6．移液管：2ml、4ml、8ml 7．流动相：甲醇：乙酸+乙酸氨（PH=3.5）=60：40， 制备前，先调节水(用酸或缓冲盐)的PH=3.5，进入系统 色谱前，用超声波发生器或水泵脱气。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
高效液相色谱法3
2.内标法 内标法分为 工作曲线法 内标一点法 内标二点法 内标对比法 校正因子法 在HPLC中最常用内标对比法。 选择内标物的三个条件(纯、样品中不含有、保留时 间接近)，在HPLC中的要求与GC完全一致。一般可选择 一个化学结构与待测物质相似、物理性质相近的纯物质作 为内标物，加到待测样品溶液中，经过样品前处理后进样。 使用内标法可抵消因仪器稳定性差、进样量不够准确等原 因带来的实验误差。
(一) 多环芳烃的分析 一 多环芳烃的分析(图21－18) 多环芳烃的分析，可用反相或吸附色谱法分析。反 相色谱法用ODS柱，用乙腈−水或甲醇−水为流动相。但用 甲醇−水时，保留时间较长，因此多采用梯度洗脱。多环 芳烃也可用硅胶(YWG等)柱，以不含水的正己烷为流动相， 也能获得较好的分离效果，但需注意溶解样品的溶剂应与 流动相的性质相近。许多多环芳烃是致癌物质，其含量监 测在食品分析与环境保护监测中都有实用意义。
(1)内标对比法： 这种方法不需知校正因子又具有内标法的定量准确 度与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分 析结果(含量)常用标示量％表示:
( Ai / As )样品 (ms )样品 W 标示量% = × × ×100% ( Ai / As )对照 (ms )对照 m
(21.13)
式中(ms)样品与(ms)对照分别是内标物在试样溶液及对照溶液 中的量，W为平均片重(或丸重等)，m是取样量，其它符 号的含义同GC章。若试样溶液与对照溶液中加人内标物 的量相等，所称取的样品重与平均片重相同，则上式的后 二项均等于1。
A的标示量％=(178024／202694)÷(154856／171222)×100％=97.l％ P的标示量％=(820968／202694) ÷(692272／171222)×100％=100.l％ C的标示量％=(407792／202694) ÷(372221／171222)×100％=92.5％
高效液相色谱方法及应用
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专属型检测器
它对不同组成的物质响应差别极大，因此只能选 择性的检测某些物质，如紫外检测器、荧光检测 器和电导检测器。
通用型检测器
它对大多数物质的响应相差不大几乎适用于所有 物质，如示差折光化学检测器 。但它的灵敏度低， 受温度影响波动大、使用时有一定局限性。
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紫外吸收检测器
简称紫外检测器（ ultraviolet absorption detector ， UV），是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测 器。 因为大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外吸 收性质，所以该检测器是液相色谱中应用最广泛的检测 器，几乎所有液相色谱仪都配置了这种检测器。 它不仅有较好的选择性和较高的灵敏度，而且对环境温 度、流动相组成变化和流速波动不太敏感，因此既可用 于等度洗脱，也可用于梯度洗脱。
1、适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应， 可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选 择性；另一方面可以通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非 极性、极性和离子型化合物。 2、由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定 液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创 造了条件。 3、键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和 热稳定性。 4、固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。
9
HPLC与GC差别
相同：兼具分离和分析功能 均可以在线检测 不同：
1．分析对象的区别 2．流动相的区别 3．操作条件区别
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HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但 对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测，占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、 难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均 可检测，用途广泛，占有机物的80%
高效液相色谱法的计算方法
高效液相色谱法的计算方法高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。
1、对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。
色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。
常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。
后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。
注样量一般为数微升。
除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。
在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。
正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。
一般色谱图约于20分钟内记录完毕。
2、系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。
(1) 色谱柱的理论板数(N，用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。
在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2)，按n＝5.54(t R/W h/2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。
高效液相色谱法
正相色谱：以极性物质做固定相，非极性物质作
流动相，即流动相的极性<固定相的极性。正相色 谱适用于极性化合物的分离，极性小的先出柱， 极性大的后出柱。（反之为反相色谱）
高效液相色谱仪
压力表 储液器 高压泵
进样器
梯度洗 提装置
色 谱 柱
记录仪 检测器
馏分收集器
一 高压输液系统 1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni 合金)，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行 泵内。 2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。 3.高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
二 分离和进样系统 （一）进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱 本身所产生的峰形展宽相对要小些。即， HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些 因素包括：进样系统、连接管道及检测器 的死体积。进样装置包括两种。 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装 置简单、死体积小。但进样量小且重现性 差。
2．化学发光检测器
是近年发展起来的高选择性、高灵敏度
（二）荧光检测器（FD） 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光 光度计，已基本淘汰。 目前使用的荧光检测器多是具有流通池 的荧光分光光度计（直角光路）。 检测限可达 1× 10-10g ／ ml ，比紫外检测 器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生 物能发荧光的物质。
主要用于氨基酸、
多环芳烃、维生素、 甾体化合物、酶类、 黄曲霉素、卟啉类 化合物、农药等的 检测。
利用固定相与流动相之间对待分离组分子溶解
度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般 为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段
高效液相色谱法的计算方法
高效液相色谱法的计算方法高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。
1、对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。
色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。
常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。
后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。
注样量一般为数微升。
除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。
在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。
正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。
一般色谱图约于20分钟内记录完毕。
2、系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。
(1) 色谱柱的理论板数(N，用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。
在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2)，按n＝5.54(t R/W h/2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。
(2) 分离度(R)定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)
Βιβλιοθήκη 高效液相色谱测定饮料中的苯甲酸
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站 开始记录并出图11。 5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次， 获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分 别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。 6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站 开始记录并出图11。 5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次， 获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分 别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。 6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
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表现：系统压力波动大
措施： • 打开排液阀，以异丙醇为流动相输液 • 拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗
线路过滤器
故障：堵塞
线路过滤器
现象：系统压力波动大或压力 偏高
压力传感器
措施：5％稀硝酸，超声波清洗
判断依据：关闭排液阀，断开出 口管路，设定流速1mL/min，
排液阀 流动相
如压力>3kgf/cm2，则堵塞。
色谱柱柱内体积和平衡时间
色谱柱 尺寸 (mm)
4.6 x 50 4.6 x 30 4.6 x 15 4.6 x 150
柱内 体积 (Vm)
0.5 mL 0.3 mL间 流速 1.0 mL/min
5 min 3 min 1.5 min 15 min
色谱柱 尺寸 (mm)
选用适宜的容器
1．梯度洗脱的特点
（1）改善分离, 加快分析速度； （ 2 ）改善峰形 , 减少拖尾 , 有利于 痕量组分的检测； （3）增加峰容量；
（ 4 ）强烈滞留的组分不容易残留在
柱上, 保持柱性能长期良好； （ 5 ）下次分析时 , 流动相需要一段 平衡时间；不同溶剂的 UV吸收程度稍 有差异, 可能会引起基线漂移
图1；好的梯度系统
图2；一般的二元梯度系统
图3；一般的四元梯度系统
为何如此重要？
五个小肽的5ng进样，好的色谱系统非常容易鉴别出所有 峰。在不好的色谱系统中，第一个峰则消失在基线噪音中。
基线噪音对积分的影响
1.183
Caffeine @ 271 nm
1.183
1.224
维护流程图
线路过滤器
单向阀 柱塞密封圈 进样器
UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O Blank 背景吸收对紫外检测器噪音的影响
1.50 1.40 1.30 1.20 1.10 1.00 0.90 0.80 AU 0.70
H20 with 0.1% TFA 50% ACN with 0.1% TFA
泵的保养： • • • • • 使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污 染；
柱的保养： • • • • • • • • • 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；
色谱柱清洗保存
• 反相色谱柱：用20%甲醇溶液清洗10个柱体积，保存在 90%的甲醇溶液中。 • 分子筛色谱柱：用纯水清洗10个柱体积，保存在5%叠氮 化钠水溶液中。 • 离子色谱柱：用0.02M盐，pH6.5溶液清洗10个柱体积， 保存在含5%叠氮化钠0.02M盐，pH6.5溶液中。短期保存 在低盐的流动相中。
滞后体积的不同会使方法转换麻烦
▫ 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 ▫ 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好
普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml
滞后体积变化的影响 设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果： 梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性
检测器
吸滤头
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吸滤头－－定期清洗，更换溶剂时 单向阀－－定期清洗，压力波动大时 泵－－自动清洗 在线过滤器－压力大时清洗
吸滤头
材料：不锈钢烧结，孔径10um
故障：堵塞 表现：管路中不断有气泡生成
措施：用5％稀硝酸，超声波清洗，
再用蒸馏水清洗
单向阀
故障：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好
高效液相色谱定性定量分析方法
基本原理和特点
基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固 定相时,由于与 固定相(stationary phase)发生作用(吸附, 分配,离子吸引,排阻,亲和)的大小,强 弱不同,在固定相中 滞留时间不同,从而先后从固定相中流出.
特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动
液相柱---保留值与pH的关系
pH变化值 0.1
RS变化值 1.6
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱
对溶剂的要求 • 水： 去离子水 纯净水 • 溶剂: 色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇） 自动纯水仪 商品瓶装水
化。
一些商品化仪器
检测器 柱温箱 流动相 脱气装置 样品盘
控温箱
四元泵
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源， 待设备通过自检后，打开计算机启动
色谱管理软件
准备流动相 过滤，脱气 色谱泵排气 用新配制的流动相灌注泵
高效液相色谱仪组成
▫ 输液系统 ▫ 进样系统 ▫ 分离系统
气泡对测定的影响：
1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积
2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形
3）检测器中的气泡产生基线波动
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
理想的HPLC检测器 • 高灵敏度；可忽略的基线噪音 • 宽的线性范围 • 独立于流动相及操作参数的响应 ▫ 对压力、温度及流速等变化不敏感 • 长时间操作的稳定性 • 低死体积 • 非破坏性 • 选择性
灵敏度：信噪比
6:1 • 灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值 （S/N） • 检测限（LOD）：S/N = 2~4 • 定量限（LOQ）：S/N = 8~10 S • 好的信噪比有利于： ▫ 更好的色谱峰确认 ▫ 更好的定量 ▫ 更好地完成色谱峰纯度/均一性
准确性受影响 ▫ 滞后体积（系统
体积）设计合理
低 B 阻尼器 溶剂输送 压 A C 梯度滞后：系统体积的影响 混合器 系统(泵) 梯 D 度 比例阀 滞后(系统)体积
色谱柱 进样器 检测器
注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路 滞后(系统)体积 高 压 梯 度
溶剂输送 系统(泵)
死体积/谱带展宽体积 (无色谱柱时)
N
吸光度（ Absorbance UV/Vis）检测 • 目前实验室中最流行的选择 ▫ 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多 波长，25%是PDA） • 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 • 吸光度与样品浓度呈线性关系 • 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
吸光度检测器（ UV/Vis）－ 优点 • 这种检测器简单、可靠 • 多数人熟悉并喜欢这种技术 • 可以作梯度实验并且是非破坏性的 • 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 • 一般来说灵敏度还可以
Parabens at 254 nm
0.15
0.10 AU 0.05 0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
Minutes
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
吸光度检测器（UV/Vis）－ 缺点 • 由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器 • 对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器 • 样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波 长检测，或使用折衷的波长 • 受流动相组成的影响： ▫ 用截止波长以上至少5～10nm作为工作波长 ▫ 缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响
固定相。
色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适
的溶剂进行洗净。
采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体 积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再 生。
HPLC检测器应提供的功能 • 对样品有响应并有一个输出信号 • 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并 且所设计的校正技术应该促进这种关系
灯的保养：
• 在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成 后，马上关闭检测器。 • 样品池要保养
谢谢！
今天用的图片都为 摄影协会 王诏同学所拍摄
0.60
0.50 0.40
0.30
0.20 0.10 0.00 200.00 210.00 220.00 230.00 240.00 250.00 nm 260.00 270.00 280.00 290.00
色谱条件 溶剂混合的基线噪音
色谱柱： C18, 5 µm, 3.9x150mm at 35º C. 流动相： A: 0.1% TFA in Water. B: 0.1% TFA in Acetonitrile. 梯度： 5 - 40% B in 35 min. 流速： 1.0 mL/min. 样品： 水（10 µL inj. vol.） 检测： 214 nm
固定滞后体积，改善了梯度性能 梯度百分比 梯度曲线 好的梯度 滞后曲线 保留时间
普通的低压梯度系统 梯度百分比 不好的梯度 滞后曲线
保留时间
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的
2.1 x 50 2.1 x 30 2.1 x 15