基因组测序技术PPT课件
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基因组测序的原理与方法ppt课件
ppt课件.
大规模基因组测序的 原理与方法
1
ppt课件.
“基因组”----生命科学的“元素周期表 ”
元素周期表
元素周期表的发现奠定了二 十世纪物理、化学研究和发展的 基础
人体解剖图奠定了现 代医学发展的基础
“基因组序列图”将奠定二十一世纪生 命科学研究和生物产业发展的基础！
2
ppt课件.
基因组学的基础理论研究
12
PCR（聚合酶链式反应）原ppt课理件.
反应所需物质：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、dNTP、缓冲液 每个循环包括：变性（90℃）、退火（54 ℃）、延伸（72 ℃）
13
ppt课件.
Sanger 双脱氧末端终止法测序原理
14
DNA自动测序仪的发展 ppt课件.
自动荧光垂直板凝胶电泳测序仪 代表：ABI公司377型垂直板自动测序仪 96个泳道 读长高达700-800 bp 日分析能力达300个样品
STS图谱是最基本和最为有用的染色体物理图谱之一，STS （Sequence Tagged Site)本身是随机地从人类基因组上选 择出来的长度在200～300bp左右的特异性短序列（每个STS 在基因组中是唯一的，STS图谱就是以STS为路标（平均每 100Kb一个），将DNA克隆片段有序地定位到基因组上。
The genom e D N A
3 ,0 0 0 ,0 0 0 K b p
= 7 .3 7 2 8
29
48 superpools
ppt课件.
每 组 个
共 个
48
8
每8个96孔板组成1个superpool，384个96孔板组成48个superpools
30
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大规模基因组测序的 原理与方法
1
ppt课件.
“基因组”----生命科学的“元素周期表 ”
元素周期表
元素周期表的发现奠定了二 十世纪物理、化学研究和发展的 基础
人体解剖图奠定了现 代医学发展的基础
“基因组序列图”将奠定二十一世纪生 命科学研究和生物产业发展的基础！
2
ppt课件.
基因组学的基础理论研究
12
PCR（聚合酶链式反应）原ppt课理件.
反应所需物质：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、dNTP、缓冲液 每个循环包括：变性（90℃）、退火（54 ℃）、延伸（72 ℃）
13
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Sanger 双脱氧末端终止法测序原理
14
DNA自动测序仪的发展 ppt课件.
自动荧光垂直板凝胶电泳测序仪 代表：ABI公司377型垂直板自动测序仪 96个泳道 读长高达700-800 bp 日分析能力达300个样品
STS图谱是最基本和最为有用的染色体物理图谱之一，STS （Sequence Tagged Site)本身是随机地从人类基因组上选 择出来的长度在200～300bp左右的特异性短序列（每个STS 在基因组中是唯一的，STS图谱就是以STS为路标（平均每 100Kb一个），将DNA克隆片段有序地定位到基因组上。
The genom e D N A
3 ,0 0 0 ,0 0 0 K b p
= 7 .3 7 2 8
29
48 superpools
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每 组 个
共 个
48
8
每8个96孔板组成1个superpool，384个96孔板组成48个superpools
30
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生物技术：基因测序与基因组编辑技术讲解培训ppt
VS
详细描述
这些技术各有特点，适用于不同的基因组 编辑需求。例如，基于人工核酸酶的基因 组编辑技术包括人工核酸酶和DNA修复 酶的组合应用，可以实现更加精确和高效 的基因组编辑。基于DNA同源重组的基 因组编辑技术则适用于对精确度要求较高 的基因组编辑实验，如基因敲入等。
05
CATALOGUE
基因测序与基因组编辑技术的 应用案例
详细描述
TALENs由多个氨基酸模块组成，每个模块能够识别一个DNA碱基，从而实现特异性的 DNA序列识别。TALENs技术已经广泛应用于基因敲除、基因敲入和基因激活等基因组
编辑实验。
CRISPR-Cas9系统
总结词
一种基于细菌免疫系统的基因组编辑技术， 通过RNA指导的Cas9蛋白识别并切割DNA 序列。
生物技术：基因测序与基 因组编辑技术讲解培训
汇报人：可编辑
2023-12-23
CATALOGUE
目 录
• 基因测序技术概述 • 基因测序技术分类 • 基因组编辑技术概述 • 基因组编辑技术分类 • 基因测序与基因组编辑技术的应用
案例 • 基因测序与基因组编辑技术的挑战
与前景
01
CATALOGUE
基因测序技术可以用于生物进化研究 中，通过对不同物种的基因序列进行 比较，揭示生物的进化历程和演化机 制。
药物研发
基因测序技术可以用于药物研发过程 中，通过对药物作用靶点的基因序列 进行分析，提高药物的研发效率和针 对性。
基因测序技术的发展历程
1970年代
基因测序技术的雏形出现，主 要是通过化学降解法测定DNA
基因组编辑技术的原理
基因组编辑技术主要基于CRISPR-Cas9系统，通过向导RNA的引导，Cas9核酸酶能够精准地切割目 标DNA序列，从而实现基因组的编辑。
基因组测序技术PPT课件
1 ATACGTTA
2 2GCTGTATGTAAGTCAT
4 C4GATCTGATGTAATGA
3 3TACGTTAG A
5 GTTAGATC
1 ATACGTTA
3 TACGTTAG
4 ACGTTAGA
2
CGTTAGAT
5
GTTAGATC
计算机分析杂交图象 并由探针的重叠情况 推导样品的核酸序列
互补序列为：ATACGTTAGATC 样品序列为：TATGCAATCTAG
在人类基因组进入测序组装阶段就采用此方法， 其基本步骤如下 参考人类基因组图,特别是大量的STS位标作为基点, 进行序列组装，排成重叠克隆群.
先将染色体打成比较大的片段(几十-几百Kb), 利用 分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群(Contig), 分别 测序后拼装. 这种策略叫基于克隆群(contig-based)的策 略.
2000年 12 月，第一个植物基因组—— 拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组 被全部测序 ，大小为125 Mb.
一、测序流程1.构建生物基因组或cDNA DNA的提取和制备→酶切制备克隆用DNA片段 →与载体连接→转化受体细胞 →筛用超声波（或限制性内切酶）切成能够测序 的小片断(200-500bp)→小片断和载体结合，植入 细菌中进行扩增（或用PCR扩增） →从细菌中提 取出繁殖好的质粒→ 酶切，制取测序的DNA片段
A
B
C
大片段contig
小片段测序拼装
A
B
C
两种策略的比较
鸟枪法策略
指导测序策略
不需背景信息
时间短 需要大型计算机 得到的是草图(Draft)
构建克隆群 (遗传、物理图谱) 需要几年的时间
生物科技的基因组测序课件
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汇报人：
基因信息泄露的风险和后果严 重
需要建立完善的基因信息保护 制度和技术保障措施
对基因信息的应用需要遵循伦 理规范和法律规定
基因信息隐私 保护
基因信息安全 管理
基因歧视问题
基因信息交流 与共享问题
基因组测序的未 来展望
新一代基因测序技术将更加准确、快速、经济 基因大数据的积累和分析将助力精准医疗个性化方案制定 人工智能和机器学习在基因测序分析中的应用将进一步提高精准医疗的效率和精度 基因测序技术的不断进步将推动精准医疗领域取得更大的突破和创新
基因组测序的应 用领域
遗传病诊断 癌症治疗 药物研发 个性化医疗
基因组测序在生物制药中的应用： 利用基因组测序技术，发现新的药 物靶点，为新药研发提供基础数据。
基因组测序在个性化治疗中的应用： 根据病人的基因组测序结果，为病 人制定个性化的治疗方案，提高治 疗效果。
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基因组测序的技 术瓶颈
试剂耗材：高质量的试剂与 消耗品价格不菲
仪器设备：高昂的设备价格 与维护费用
数据分析：需要专业的技术 人员进行数据处理与分析
知识产权：对于某些特殊基 因组，存在知识产权问题需
要解决
基因组测序的原理 测序速度慢的原因 提升测序速度的方法 未来测序技术的发展趋势
基因组测序的深度是影响检测准确性和全面性的关键因素 深度过浅可能导致检测结果不准确，漏检基因突变 深度过深则会增加测序成本和数据分析难度 目前基因组测序的深度一般需要在几十倍到几百倍之间
特点：具有高精度、高速度和高通 量等优点，同时还能避免PCR扩增 偏差和光学干扰等问题
发展前景：随着技术的不断改进和 成本的降低，第三代测序技术将在 未来发挥更加重要的作用。
基因组测序基本原理ppt课件
基因组测序基本原理
大纲
I. 核酸DNA的发现以及测序历史简介 II. 双脱氧化(Sanger dideoxy method)测序 III.大片段的DNA测序与基因组测序的大发展 VI.人类基因组 V. 1000美元个体化基因组测序计划(The “$1,000 dollar genome)
On WebCT -- “The $1000 genome” -- review of new sequencing techniques by George Church
Part I.核酸测序原理
核酸发现与测序简史
DNA测序的简史
MC chapter 12
DNA测序的方法
A. 双脱氧法 (Sanger dideoxy) (primer extension/chaintermination) method: 最流行也是最广为接受的方法。
Maxam-Gilbert化学剪切法(chemical cleavage method): DNA is labelled and then chemically cleaved in a sequence-dependent manner. This method is not easily scaled and is rather tedious 焦磷酸测序(Pyrosequencing): measuring chain extension by pyrophosphate monitoring。焦磷酸测序技术是新一代 DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无 须荧光标记，操作极为简便，可以快速、准确地确定DNA 序列。
测序的趋势
相对而言一般很少实验室会自己做测序，一则自身测序费用比较高，而且荧光试剂容 易粹灭，同时也比较消耗时间，另外可能出现一些其它问题引起结果不成功。所以大 部分的测序都是送到相关的测序中心或者公司完成:
大纲
I. 核酸DNA的发现以及测序历史简介 II. 双脱氧化(Sanger dideoxy method)测序 III.大片段的DNA测序与基因组测序的大发展 VI.人类基因组 V. 1000美元个体化基因组测序计划(The “$1,000 dollar genome)
On WebCT -- “The $1000 genome” -- review of new sequencing techniques by George Church
Part I.核酸测序原理
核酸发现与测序简史
DNA测序的简史
MC chapter 12
DNA测序的方法
A. 双脱氧法 (Sanger dideoxy) (primer extension/chaintermination) method: 最流行也是最广为接受的方法。
Maxam-Gilbert化学剪切法(chemical cleavage method): DNA is labelled and then chemically cleaved in a sequence-dependent manner. This method is not easily scaled and is rather tedious 焦磷酸测序(Pyrosequencing): measuring chain extension by pyrophosphate monitoring。焦磷酸测序技术是新一代 DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无 须荧光标记，操作极为简便，可以快速、准确地确定DNA 序列。
测序的趋势
相对而言一般很少实验室会自己做测序，一则自身测序费用比较高，而且荧光试剂容 易粹灭，同时也比较消耗时间，另外可能出现一些其它问题引起结果不成功。所以大 部分的测序都是送到相关的测序中心或者公司完成:
全基因组测序ppt课件
测序数据的生成与分析
01
数据质量控制
去除低质量、污染
和重复序列数据。
02
序列比对
将测序数据与参考 基因组进行比对。
04
注释与解读
对变异进行功能注
03
释和临床意义解读
。
变异检测
识别基因组中的单 核苷酸变异、结构
变异等。
03
全基因组测序的实际应用
人类健康与疾病研究
遗传性疾病诊断
人类进化研究
全基因组测序可以检测出人类基因中 的突变位点，有助于遗传性疾病的诊 断和预防，如罕见病、癌症等。
02
全基因组测序技术原理
测序平台与技术分类
平台类型
基于Sanger的测序、基于焦磷酸测 序、基于纳米孔的测序和基于合成测 序等。
技术分类
长读长测序和短读长测序，单分子测 序和合成测序等。
测序的基本步骤
样本准备焦磷酸酶反应。 通过测序平台产生原始的测序数据。
测序技术的发展历程
1 2
3
第一代测序技术
基于Sanger的DNA测序方法，测序读长较短，通量较低。
第二代测序技术
基于高通量测序技术，如Illumina平台，实现了高通量、高 灵敏度和高精度。
第三代测序技术
基于单分子测序技术，如PacBio和Nanopore平台，具有超 长读长和实时测序能力。
全基因组测序的应用领域
癌症基因组研究
目的
01
通过对癌症患者的基因组进行测序和分析，了解癌症的发生、
发展和转移机制，为癌症的诊断、治疗和预防提供依据。
成果
02
发现了许多与癌症发生、发展相关的基因突变和变异，为个性
化治疗和精准医学提供了有力支持。
《DNA测序技术》课件
准确性高，降低了测序错误率；
检测灵敏度高，能检测低浓度的变异 。
第三代测序技术的原理
利用纳米孔或高分子 膜对DNA分子进行 固定；
通过识别通过纳米孔 或高分子膜的碱基， 确定DNA序列。
对固定在膜上的 DNA分子进行单分 子测序；
第三代测序技术的应用领域
01
基因组测序
对整个基因组进行高精度测序，用 于基因组学研究；
下一代测序技术的应用领域
临床诊断
下一代测序技术在临床诊断中具有重要作 用，可用于遗传病诊断、肿瘤诊断和个性
化治疗等。
A 基因组学研究
下一代测序技术广泛应用于基因组 学研究领域，包括基因组测序、基
因突变检测、基因表达分析等。
B
C
D
农业研究
下一代测序技术可用于农业研究领域，包 括作物基因组测序、品种鉴定和育种等。
DNA的复制过程
DNA复制的起始
解旋酶解开DNA双螺旋结构，形成复制叉。
DNA复制的终止
复制完成，子链与母链分离。
DNA链的延伸
DNA聚合酶催化子链合成，新合成的DNA 与母链形成氢键。
DNA复制的意义
保证遗传信息的传递和物种的延续。
DNA测序的原理
测序技术的基本原理
通过测定DNA上特定位点的碱基序列，从 而确定DNA分子上的遗传信息。
《DNA测序技术》PPT课件
目录 CONTENTS
• DNA测序技术概述 • DNA测序技术的基本原理 • 下一代测序技术（NGS） • 第三代测序技术 • DNA测序技术的未来发展
01
DNA测序技术概述
DNA测序的定义
DNA测序是指通过一定手段测量DNA 分子中碱基的排列顺序，以揭示其遗 传信息的过程。
检测灵敏度高，能检测低浓度的变异 。
第三代测序技术的原理
利用纳米孔或高分子 膜对DNA分子进行 固定；
通过识别通过纳米孔 或高分子膜的碱基， 确定DNA序列。
对固定在膜上的 DNA分子进行单分 子测序；
第三代测序技术的应用领域
01
基因组测序
对整个基因组进行高精度测序，用 于基因组学研究；
下一代测序技术的应用领域
临床诊断
下一代测序技术在临床诊断中具有重要作 用，可用于遗传病诊断、肿瘤诊断和个性
化治疗等。
A 基因组学研究
下一代测序技术广泛应用于基因组 学研究领域，包括基因组测序、基
因突变检测、基因表达分析等。
B
C
D
农业研究
下一代测序技术可用于农业研究领域，包 括作物基因组测序、品种鉴定和育种等。
DNA的复制过程
DNA复制的起始
解旋酶解开DNA双螺旋结构，形成复制叉。
DNA复制的终止
复制完成，子链与母链分离。
DNA链的延伸
DNA聚合酶催化子链合成，新合成的DNA 与母链形成氢键。
DNA复制的意义
保证遗传信息的传递和物种的延续。
DNA测序的原理
测序技术的基本原理
通过测定DNA上特定位点的碱基序列，从 而确定DNA分子上的遗传信息。
《DNA测序技术》PPT课件
目录 CONTENTS
• DNA测序技术概述 • DNA测序技术的基本原理 • 下一代测序技术（NGS） • 第三代测序技术 • DNA测序技术的未来发展
01
DNA测序技术概述
DNA测序的定义
DNA测序是指通过一定手段测量DNA 分子中碱基的排列顺序，以揭示其遗 传信息的过程。
基因测序 ppt课件
边合成边测序（来源：illumina官网）
17
第二部分
Ion Torrent PGM半导体测序
芯片就是测序仪，4种dNTP依次流过半导体芯片PCRDNA聚合产生的氢离子直接检测，每 个碱基只需数秒
PGM测序原理
18
第二部分
19
第二代测序技术特点
测序成本比较
1.高通量，成本降低，敏感性高 2.简单快速自动化 3.读长较短50-300bq左右 4.PCR可能引入偏倚跟错配
5
第二部分
第二代基因测序技术
具代表性的第二代测序平台：
1.荧光标记 -美国Illumina 公司的基因组测序仪（genome analyzer，GA）
-瑞士Roche 公司的454
-美国ABI 公司的寡聚物连接检测测序（sequencing by oligo ligation det1
第二部分
DNA模板杂交和一链合成
1.单链DNA分子与FlowCell表面 的对应接头杂交
2.以杂交的单链DNA为模板， FlowCell上的接头为引物， 合成第一链
含有P7和P5两种接头 的FlowCell表面
接头序列
5’-3’ 延伸
12
第二部分
变性 冲走模板链 新和成的链留在 flowcell上
特点：
1.测序长度可达1000bp 2.准确性高，几乎100% 3.通量低，成本高，耗时长，不适合大规模应用
3
Sanger法核心原理
第一部分
第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因 组计划(human genome project,HGP)主要基于第一代DNA测序技术。 目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪 仍被广泛地应用。
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2000年 12 月，第一个植物基因组—— 拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组 被全部测序 ，大小为125 Mb.
一、测序流程1.构建生物基因组或cDNA DNA的提取和制备→酶切制备克隆用DNA片段 →与载体连接→转化受体细胞 →筛用超声波（或限制性内切酶）切成能够测序 的小片断(200-500bp)→小片断和载体结合，植入 细菌中进行扩增（或用PCR扩增） →从细菌中提 取出繁殖好的质粒→ 酶切，制取测序的DNA片段
5ˊP 3ˊHO
5ˊP 5ˊP
OH 3ˊ P 5ˊ 制备单链DNA
OH 3ˊ
加放射性引物
DNA聚合酶， HO dATP，dTTP， dGTP，dCTP
OH 3ˊ P32 5ˊ
ddGTP
ddATP
ddTTP ddCTP
聚合产物分别在 4个泳道电泳
ddGTP ddATP ddTTP ddCTP
5 ˊ 32P -GTCATGTGCTAG
5 ˊ 32P GTCATGTGCTA 5 ˊ 32P GTCATGTGCT 5 ˊ 32P GTCATGTGC 5 ˊ 32P GTCATGTG 5 ˊ 32P GTCATGT 5 ˊ 32P GTCATG 5 ˊ 32P GTCAT 5 ˊ 32P GTCA 5 ˊ 32P GTC 5 ˊ 32P GT 5 ˊ 32P G
从下到上依次读出DNA 片段的核苷酸序列
（二）Maxam-Gilbert的化学降解法
1.基本原理 是用化学试剂处理具有末端放射性
标记的DNA片段，造成碱基的特异性切 割并产生一组具有不同长度的DNA链降 解产物，经凝胶电泳分离和放射自显 影之后，可直接读出待测DNA片段的核 苷酸序列。
2 技术路线
化學法
断裂处
32P
ATCGATCG
AT
32P
ATCG
ATCGAT
無放射線片段
断裂处
不能顯像
Maxam-Gilbert 法所用的化学技术
碱基 G
A+G
C+T C
特异修饰方法
Ph8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性
pH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从 而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤 的糖苷键
肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后 易除去
1.5mol/L NaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶
5ˊP 3ˊHO 5ˊHO 3ˊHO 5ˊ32P 3ˊHO 5ˊ32P
碱性磷酸 单酯酶
多核苷酸 磷酸激酶
除去 5ˊ磷酸基 γ-32P-ATP
OH 3ˊ P 5ˊ
OH 3ˊ OH 5ˊ
OH 3ˊ P32 5ˊ 分离单链DNA
2001年 12月，线虫（Caenorhabditis ele gans）基因组测序完成.
一些主要模式生物基因组测序概况
2000年：3月，Celera公司完成果蝇 （Drosophila me lanogaster）基因组 （180 Mb）的全部测序工作，在当时所 有已测序的基因组中是最大的 ，同时这 也证明了“全基因组鸟枪法”的可行性；
基本原理:
Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧 链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如 下： ①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成 准确的DNA互补链；
②该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作 底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端， 从而终止其延伸反应。
将双链DNA样品变为单链 ↓
每个单链的同一方向末端都用放射性同位素 标记,以便显示DNA条带
↓ 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的 降解DNA群体
↓ 电泳,读取DNA的核苷酸顺序
Maxam-Gilbert测序法的特异断裂
32P ATCGATCGAT
Specific Reaction to G
3. 测序：上测序仪测序 。 4. 利用重叠技术，排出DNA大片段的序列。
二、DNA测序的方法
双脱氧链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序
（一）Sanger的双脱氧链末端终止法
1.基本原理: 通过合成与单链DNA互补的多核苷
酸链，由于合成的互补链可在不同位置 随机终止反应，产生只差一个核苷酸的 DNA分子，从而来读取待测DNA分子的 顺序。
OH 3ˊ
G 硫酸二甲酯
G+A 甲酸
分别在4个 试管中进行 特异断裂
T+C
C
肼
肼＋NaCl
5 ˊ 32P -GTCATGTGCTAG
5 ˊ 32P GTCATGTGCTA 5 ˊ 32P GTCATGTGCT 5 ˊ 32P GTCATGTGC 5 ˊ 32P GTCATGTG 5 ˊ 32P GTCATGT 5 ˊ 32P GTCATG 5 ˊ 32P GTCAT 5 ˊ 32P GTCA 5 ˊ 32P GTC 5 ˊ 32P GT 5 ˊ 32P G
加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸
A 高酶活性 B 无5’→3´外切酶活性 C 无3´→5´外切酶活性
分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓
将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓
ddATP/ddCTP/ddGTP/ ddTTP 的3’碳原子连 接的是氢原子,不是羟 基
根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特 异性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC 和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3' 外切酶活性。
2.技术路线与要求
制备单链模板 ↓
将单链模板与一小段引物退火 ↓
A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性 B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA
基因组测序技术
一些主要模式生物基因组测序概况
1995年 7月，第一个基因组——流感嗜血杆 菌（Haemophilus influenzae）的全序列发 表，大小为1.8 Mb；
1996年 10月，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 的基因组全部测序完成；
1997年 9月，大肠杆菌（Escherichia coli）基 因组全部测 序完成，全长5 Mb；
一、测序流程1.构建生物基因组或cDNA DNA的提取和制备→酶切制备克隆用DNA片段 →与载体连接→转化受体细胞 →筛用超声波（或限制性内切酶）切成能够测序 的小片断(200-500bp)→小片断和载体结合，植入 细菌中进行扩增（或用PCR扩增） →从细菌中提 取出繁殖好的质粒→ 酶切，制取测序的DNA片段
5ˊP 3ˊHO
5ˊP 5ˊP
OH 3ˊ P 5ˊ 制备单链DNA
OH 3ˊ
加放射性引物
DNA聚合酶， HO dATP，dTTP， dGTP，dCTP
OH 3ˊ P32 5ˊ
ddGTP
ddATP
ddTTP ddCTP
聚合产物分别在 4个泳道电泳
ddGTP ddATP ddTTP ddCTP
5 ˊ 32P -GTCATGTGCTAG
5 ˊ 32P GTCATGTGCTA 5 ˊ 32P GTCATGTGCT 5 ˊ 32P GTCATGTGC 5 ˊ 32P GTCATGTG 5 ˊ 32P GTCATGT 5 ˊ 32P GTCATG 5 ˊ 32P GTCAT 5 ˊ 32P GTCA 5 ˊ 32P GTC 5 ˊ 32P GT 5 ˊ 32P G
从下到上依次读出DNA 片段的核苷酸序列
（二）Maxam-Gilbert的化学降解法
1.基本原理 是用化学试剂处理具有末端放射性
标记的DNA片段，造成碱基的特异性切 割并产生一组具有不同长度的DNA链降 解产物，经凝胶电泳分离和放射自显 影之后，可直接读出待测DNA片段的核 苷酸序列。
2 技术路线
化學法
断裂处
32P
ATCGATCG
AT
32P
ATCG
ATCGAT
無放射線片段
断裂处
不能顯像
Maxam-Gilbert 法所用的化学技术
碱基 G
A+G
C+T C
特异修饰方法
Ph8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性
pH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从 而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤 的糖苷键
肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后 易除去
1.5mol/L NaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶
5ˊP 3ˊHO 5ˊHO 3ˊHO 5ˊ32P 3ˊHO 5ˊ32P
碱性磷酸 单酯酶
多核苷酸 磷酸激酶
除去 5ˊ磷酸基 γ-32P-ATP
OH 3ˊ P 5ˊ
OH 3ˊ OH 5ˊ
OH 3ˊ P32 5ˊ 分离单链DNA
2001年 12月，线虫（Caenorhabditis ele gans）基因组测序完成.
一些主要模式生物基因组测序概况
2000年：3月，Celera公司完成果蝇 （Drosophila me lanogaster）基因组 （180 Mb）的全部测序工作，在当时所 有已测序的基因组中是最大的 ，同时这 也证明了“全基因组鸟枪法”的可行性；
基本原理:
Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧 链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如 下： ①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成 准确的DNA互补链；
②该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作 底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端， 从而终止其延伸反应。
将双链DNA样品变为单链 ↓
每个单链的同一方向末端都用放射性同位素 标记,以便显示DNA条带
↓ 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的 降解DNA群体
↓ 电泳,读取DNA的核苷酸顺序
Maxam-Gilbert测序法的特异断裂
32P ATCGATCGAT
Specific Reaction to G
3. 测序：上测序仪测序 。 4. 利用重叠技术，排出DNA大片段的序列。
二、DNA测序的方法
双脱氧链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序
（一）Sanger的双脱氧链末端终止法
1.基本原理: 通过合成与单链DNA互补的多核苷
酸链，由于合成的互补链可在不同位置 随机终止反应，产生只差一个核苷酸的 DNA分子，从而来读取待测DNA分子的 顺序。
OH 3ˊ
G 硫酸二甲酯
G+A 甲酸
分别在4个 试管中进行 特异断裂
T+C
C
肼
肼＋NaCl
5 ˊ 32P -GTCATGTGCTAG
5 ˊ 32P GTCATGTGCTA 5 ˊ 32P GTCATGTGCT 5 ˊ 32P GTCATGTGC 5 ˊ 32P GTCATGTG 5 ˊ 32P GTCATGT 5 ˊ 32P GTCATG 5 ˊ 32P GTCAT 5 ˊ 32P GTCA 5 ˊ 32P GTC 5 ˊ 32P GT 5 ˊ 32P G
加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸
A 高酶活性 B 无5’→3´外切酶活性 C 无3´→5´外切酶活性
分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓
将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓
ddATP/ddCTP/ddGTP/ ddTTP 的3’碳原子连 接的是氢原子,不是羟 基
根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特 异性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC 和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3' 外切酶活性。
2.技术路线与要求
制备单链模板 ↓
将单链模板与一小段引物退火 ↓
A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性 B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA
基因组测序技术
一些主要模式生物基因组测序概况
1995年 7月，第一个基因组——流感嗜血杆 菌（Haemophilus influenzae）的全序列发 表，大小为1.8 Mb；
1996年 10月，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 的基因组全部测序完成；
1997年 9月，大肠杆菌（Escherichia coli）基 因组全部测 序完成，全长5 Mb；