血红蛋白的提取
血红蛋白的提取和分离
• 2．(2008年山东理综)科学家发现家蝇体内 存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有 极强的抗菌能力，受到研究者重视。 • (1)分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是 带电性质 、大小及形状 根据蛋白质分子的________ 迁移速度 不同而实现分 不同，在电场中的________ 离。 • (2)可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白的体 外抗菌特性。抗菌实验所用培养基中的牛 肉膏和蛋白胨主要为细菌生长提供 碳源 和________ 氮源 ________ 。
㈡缓冲溶液
• ⒈作用：能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基 本不变。 • ⒉组成：一般由缓冲物质对构成，调节缓冲物质的比例，可 得不同pH值的缓冲液 如：H2CO3 / NaHCO3 、NaH2PO4 / Na2HPO4 • ⒊作用机制：以H2CO3 / NaHCO3 为例 A：当酸性物质（如乳酸）进入后， 与溶液中的 NaHCO3 发生作用，生成乳酸钠和碳酸，而 碳酸可以分解成CO2和H2O，CO2排出则pH不变； B：当碱性物质（如碳酸钠）进入后， 与溶液中的H2CO3 发生作用，形成 NaHCO3 ，溶液pH不 变。 4.意义：准确模拟生物体内生理过程，必须保持反应溶液体 系的pH值基本不变。
P66
㈣血红蛋白
• 在红细胞的组成中，约 90%是血红蛋白。它由 四个肽链组成，包括两 个α—肽链和两个β—肽 链。每条肽链环绕一个 亚铁血红素基团，可携 带一分子氧或一分子二 氧化碳。血红蛋白因含 血红素而呈现红色。
血红蛋白占红细胞 湿重的34%，占干重的 90%。每个红细胞含 2.8亿个血红蛋白
有机溶剂
无色透明的甲苯层 脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层 血红蛋白溶液 红色透明液体
红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物
血红蛋白的提取和分离
血红蛋白的提取和分离1．蛋白质的分离方法(1)原理：蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
(2)分离方法：①凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
②电泳法：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2．实例——血红蛋白的提取和分离(1)样品处理与粗分离(2)纯化与纯度鉴定血红蛋白提取与分离中历次“除杂质”或“分离”的原理(1)凝胶色谱法：相对分子质量较大的分子先流出，分子质量较小的后流出，依此可对血红蛋白进行分离和纯化。
(2)透析法：利用透析袋只允许小分子透出的原理，去除小分子杂质，透析可实现对血红蛋白的“粗分离”。
(3)电泳法：利用分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。
即不清楚血红蛋白释放时蒸馏水和甲苯的作用红细胞中依次加入蒸馏水和甲苯的作用：加入蒸馏水的目的是使红细胞吸水涨破；甲苯溶解细胞膜，从而使血红蛋白释放出来。
【练一练】血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和部分CO2的运输。
请根据血红蛋白的提取和分离过程回答以下问题：(1)将上述实验流程补充完整：A为____________，B为_____________。
(2)洗涤红细胞的目的是去除____________；红细胞洗涤干净的标志是__________________。
释放血红蛋白的过程中起作用的试剂是__________________。
(3)在B过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是_____________________________________________。
在蛋白质分离过程中，如果红色区带___________________________，说明色谱柱制作成功。
5.3 血红蛋白的提取(24张PPT)
④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适 当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
开始进行层析
收集得到的纯化后的 蛋白
分离血红蛋白溶液
有机溶剂 脂类物质 血红蛋白溶液
无色透明的甲苯层 白色脂溶性物质沉淀层
红色透明液体
红细胞破碎物沉淀
暗红色沉淀物
4、透析（粗提取）： 装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。
利用透析袋透析
（二）凝胶色谱操作（纯化）
如P68图5-19
1、凝胶色谱柱的制作： ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙 网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。
利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结 构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)
(三)电泳
1.电泳的概念 指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.
2 .原理：
①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离 的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反 的电极移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及 分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移 速度，从而实现样品中各种分子的分离。
两个α－肽链 血红蛋白 两个β一肽链
四个亚铁红素基团
(一)凝胶色谱法 （分配色谱法）： 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法
1、原理： 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。
血红蛋白的分离和提取
细胞为材料，学习初步分离血红蛋白的方法。
样品处理及粗分离1.红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。
采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500 r/min离心2 min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液），缓慢搅拌10 min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。
❖为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂柠檬酸钠，比例是每100mL血液加入3.0g柠檬酸钠。
2.血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。
在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
3.分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的溶液分为4层（图5-18）。
从上往下数，第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。
将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
4.透析取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0)，透析12h。
❖透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的。
透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。
凝胶色谱操作可以自己制作色谱柱，有条件的学校也可以直接购买商品色谱柱。
1.凝胶色谱柱的制作取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端磨平。
柱底部的制作方法如下（图5-19）。
首先选择适合封堵玻璃管口的橡皮塞，中间打孔，孔径大小要能够紧密插入0.5 mL的移液管。
血红蛋白的提取与分离课件
血红蛋白的提取与分离
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㈢电泳：
电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
1）原理：
不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、 电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用 力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在 电场中的运动方向和运动速度不同。
思考：蛋白质为什么带有电荷？
在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷 2）影响蛋白质分子运动速度的因素
就可以制得（ 在不同PH范围内 ）使用的 缓冲液。
思考：说出人体血液中缓冲对。
NaH2PO4 / Na2HPO4
H2CO3 / NaHCO3
血红蛋白的提取与分离
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思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲 液是什么？它的目的是什么？
使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲 液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白 的正常结构和功能，便于观察（红色） 和材料的科学研究（活性）
高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲
液（pH为7.0）充分（ 洗涤平衡 ）12小时。
注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有 气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终 生物大分子物质的分离效果。不能发生洗 脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重 新填装。
血红蛋白的提取与分离
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3）样品加入与洗脱
(1)红细胞的洗涤
①目的：去除（ 杂质蛋白 ） ②方法：（ 低速短时间 ）离心（速度越 高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一 同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头 吸管吸出上层透明的（黄色血浆），将下 层（ 暗红色）的红血红细蛋白的胞提取液与分离体倒入（烧杯）20
再加入用（ 五倍体积）的（ 生理盐水） 质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤 ⑤低速离心（低速短时间）
血红蛋白的提取和分离自制
端时，用试管搜集流出液，每（ 5ml ） 搜集一试管连续搜集
血红蛋白的提取和分离自制
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开始进行层析
血红蛋白的提取和分离自制
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搜集得到纯化后蛋白
血红蛋白的提取和分离自制
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试验录像
血红蛋白的提取和分离自制
血红蛋白的提取和分离自制
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原理: 当不一样蛋白质经过凝胶时
相对分子质量较小 轻易进入
凝胶内部通道
相对分子质量较大
无法进入凝胶 内部通道
只能在凝胶外部移动
旅程较长 移动速度较慢
旅程较短 移动速度较快
相对分子质量不一样蛋白质所以得以分离。
血红蛋白的提取和分离自制
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血红蛋白的提取和分离自制
SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物,
SDS所带负电荷量大大超出了蛋白质分子原有
电荷量。因而掩盖了不一样种蛋白质间电荷
差异, 使电泳迁移率完全取决于
(
分子大小
)。
血红蛋白的提取和分离自制
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电泳检测PCR结果
血红蛋白的提取和分离自制
琼脂糖凝胶电泳
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课堂小结:
血红蛋白的提取和分离自制
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4.透析：装入透析袋并置 于磷酸缓冲液中（PH为7.0） 透析。
血红蛋白的提取和分离自制
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血红蛋白的提取和分离自制
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利用透析袋透析
血红蛋白的提取和分离自制
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血红蛋白的提取和分离自制
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二、凝胶色谱纯化
血红蛋白的提取和分离自制
血红蛋白的提取及分离
“血红蛋白的提取和分离”的实验分析及教学组织人民教育出版社课程教材研究所吴成军东北师范大学附属中学赵伟涛“血红蛋白的提取和分离”是人教版选修模块《生物技术实践》中的实验内容，其目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法，该实验虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，因此，学生的学习兴趣很高。
下面结合人教版教材对该实验进行分析并提出相应的教学建议。
1.习得实验原理和方法1．1 初步获取血红蛋白的原理和方法（样品的处理和粗分离）实验步骤实验目的实验原理操作方法结果判断①洗涤红细胞获取较纯净的红细胞通过离心将密度不同的物质分离低速离心，去除上清液，反复加生理盐水并离心直到上清液未呈现黄色为止②释放血红蛋白破裂红细胞，释放血红蛋白低渗溶液中红细胞破裂；甲苯溶解膜脂，加速细胞破裂（相似相溶原理）加蒸馏水，再加甲苯，磁力搅拌器充分搅拌无明显现象③分离血红蛋白溶液初步得到血红蛋白溶液通过离心将密度不同的物质分离离心（较高速）试管溶液分为4层④透析去掉液体中的小分子物质小分子物质容易透出透析袋透析（12小时）透析袋中物质的颜色更红1．2 分离纯化蛋白质的原理与方法──凝胶色谱法（分子筛效应）凝胶是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质直径小于凝胶网孔，由于静电吸附和扩散作用容易进入凝胶内部的通道，可以自由地进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动的过程中，它们从凝胶颗粒的网孔扩散到凝胶颗粒间的孔隙，再进入另一凝胶颗粒的网孔，如此不断地进出，使流程增长，而最后流出层析柱。
而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒的网孔，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着洗脱液流动，流程较短，因此首先流出层析柱。
分子量介于二者之间的物质，虽然能够进入凝胶网孔，但比小分子难，因此进入凝胶网孔的几率比小分子小，向下移动的速度比小分子快，而比大分子慢。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
高一生物血红蛋白的提取和分离介绍
高一生物血红蛋白的提取和分离介绍高一主要学习的内容是细胞，学生需要知道和掌握这些的知识，下面是店铺给大家带来的有关于血红蛋白的提取和分离知识点的介绍，希望能够帮助到大家。
高一生物血红蛋白的提取和分离知识点该知识点包括凝胶色谱法、缓冲溶液、电泳、实验操作及操作提示等几个要点知识。
1. 凝胶色谱法：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
凝胶实际上是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质比较容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
2. 缓冲溶液：缓冲溶液的作用是能够抵制外界的酸和碱对溶液pH 的影响，维持pH基本不变。
缓冲溶液通常由1-2种缓冲溶剂溶解于水中配制而成的。
生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是7.35～7.45，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。
3.电泳：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物大分子，如蛋白质、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
两种常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，在测定蛋白质分子量时通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率取决于蛋白质所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。
4. 实验操作及操作提示：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。