第三章、基因工程常用受体细胞

受体细胞举例：酿酒酵母GRF18
应用
1981年酿酒酵母表达了 第一个外源基因一干扰素 基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。rck公司）
上市产品还有人胰岛素（丹麦Novo－ Nordisk公 司）和人粒细胞集落刺激因子（Immunex公司） 等
低
第二节、宿主细胞分类及特点
分类：原核细胞（大肠杆菌、枯草芽胞 杆菌、链霉菌等）

真核细胞（酵母细胞、哺乳动物
细胞、昆虫细胞）
一、原核表达系统的特点
（一）优点：
1、 结构简单，基因组成及功能相对清楚， 易于遗传操作及转化
2、生理代谢途径及表达调控机制相对清楚， 便于表达调控
3、生长迅速，要求条件低（大肠杆菌倍增 时间为17分钟），易于大规模培养。
第二阶段：酿酒酵母重组乙肝疫苗。起始于20世纪 80年代初，将HBsHg（或s多肽）的编码序列置于 ADH1（酿酒酵母的乙醇脱氢酶1基因）启动子或 PGK（磷酸甘油酯激酶基因）启动子后面，表达出 具有免疫活性的非糖基化HBsHg 。目前已作为乙 肝疫苗商品化，商品名为Recombivax－B或 Engerix－B。
药物蛋白已有20多种，见 李元《基因工程药物》P52表。 如人IL－2、人血清白蛋白、TNF、HBsAg、EGF、破伤 风毒素C片断、人巨细胞病毒抗原、抗凝血因子水蛭素衍 生物等，有些即将进入市 场。
常用毕氏酵母菌
KM71和GS115:都具有HIS4营养缺陷标记。 GS115茵株：具有AOX1基因，是Mut＋，即 甲醇利用 正常型； KM71菌株：AOX1位点被ARG4基因插入， 表型为Muts，即甲醇利用缓慢型
两株胞外蛋白分泌水平较高的短小 芽孢杆菌野生株
芽孢杆菌47株 HPD31株
在合适培养条件下，每升培养液可积累30g蛋 白产物
芽孢杆菌使用的表达载体
pNU210 PYQL pUB18
（四）在基因工程制药中的应用
重组蛋白多肽药物的分泌表达 白细胞介素－2 白细胞介素－3 表皮生长因子（EGF） 人－干扰素 乙肝病毒核心抗原
有限细胞系和无限细胞系
有限细胞系（finite cell line）：正常细胞经 过多次传代后，一般可连续培养30～50代， 就会逐渐失去增殖能力，也就是说它们只能 生长有限的时间，经过若干传代培养后将老 化死 亡，把这类细胞称为有限细胞系。
无限细胞系（infinite cell line）或连续细胞 系（continuous cell line）：当细胞经过自 然或人为的因素转化为异倍体后，能变为无 限细胞系，没有分裂次数的限制。
3m 能产生芽孢；
（二）特点
优点： 1、具有高效分泌机制，可将表达的外源蛋白
高效分泌到培养基中，且多数真核蛋白经 芽孢杆菌分泌后便具有天然构象和生物活 性 2、胞壁不含脂多糖，不产生内毒素
缺点
1、载体受体系统不完备 2、常规方法不易转化 3、野生型芽孢杆菌合成和分泌大量的胞外蛋白酶，
直接影响表达产物的稳定性 4、发酵技术不如大肠杆菌成熟
蛋白糖基化修饰作用接近哺乳动物细胞。 也是一种甲基营养菌。
举例：利用重组酵母生产乙肝疫苗
第一代乙肝疫苗：病毒携带者体内提取 存在问题： 1、来源有限 2、提取过程复杂 3、致病潜在危险 4、成本高
第二代乙肝疫苗－重组乙肝疫苗
第一阶段：大肠杆菌重组乙肝疫苗。20世纪70年代 末尝试用大肠杆菌表达乙肝表面抗原HBsAg，但表 达水平极低
胞且可直接以天然可溶形式分泌到胞外。
缺点
发酵周期长，要添加甲醇 分子生物学基础不清楚，遗传改造难度大。
应用
生产重组真核药物蛋白：
近年来，Invitrogon公司开发了毕赤酵母表达系统 的系列产品，短短几年已经有300多种外源蛋自 在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的 酵母表达系统。
是一种甲基营养菌，能在相 对较为廉价的甲醇培养基中 生长。
优点
除具有一般酵母所具有的特点 外，还有以下几个 优点：
1、具有目前最强，调控机理最严格的启动子之一 －乙醇氧化酶AOX1基因启动子,外源蛋白表达量 高（一般 500-4000mg/L，最高为破伤风毒素C达到 12g/l） 。
2、表达质粒能在基因组的特定位点稳定整合。 3、蛋白产物糖基化修饰作用大多数情况下接近哺乳动物细
三、哺乳动物细胞表达特点
是表达哺乳动物基因（如人基因）的最好受体细 胞。
优点： 1、能识别和剪切内含子并加工为成熟的mRNA，既可表达
cDNA又可表达基因组DNA； 2、表达产物具有正确地高级结构和糖基化、磷酸化等修饰。 3、表达产物可分泌到培养液中，纯化容易。
缺点：
1、细胞生长慢，培养条件刻苛，大规模培养工艺 复杂、费用高
存在问题
1、外源基因表达水平不高。 原因： （1）密码子使用的偏向性（tRNA与外源基因密
码子不匹配） （2）乙醇发酵途径活跃导致生物大分子合成普遍
受到抑制 （3）质粒的不稳定性 2、重组异源蛋白超糖基化修饰
二、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
是近年来发 展最为迅速，应 用最为广泛的酵母细胞。
N－乙酰葡萄糖胺 半乳糖 果糖
唾液酸等
N-连接糖基化(N-linked glycosylation)
新合成蛋白进行糖基化修饰的一种方式。 糖通过与蛋白质的天冬氨酸的自由NH2基连
接，所以将这种糖基化称为N-连接的糖基化。
O-连接的糖基化（O-linked glycosylation）
高尔基体中进行的另一种蛋白质的糖基化， 将糖链转移到多肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟 赖氨酸的羟基的氧原子上。
37℃17分钟繁殖一代。
（二）特点
优点：
1、载体受体系统完备 2、外源基因表达水平高，可达总蛋白5％～
30％； 3、下游技术成熟
缺点：
1、 胞内表达蛋白易形成无活性的包涵体，需进行复性操作； 可溶性表达的胞内真核蛋白易被细菌蛋白酶水解
2、蛋白分泌机制不健全，外源真核基因很难实现分泌表达， 且分泌产物大多只能分泌到细胞周质（细胞质与外膜之见 的间隙）；少数分泌表达的蛋白表达效率比包含体形式低 很多。
不大
哺乳动物 完 整 外分泌 糖基化蛋白
较难成本高 简单 可高产
可达天然 产物
需注意 致癌
第三节、常用原核表达细胞
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 短小芽孢杆菌
一、大肠杆菌表达体系
（一）生物学特性 革兰氏阴性杆菌 大小2～4um×0.4～
0.1um； 无芽孢； 一般无荚膜(capsule) 裂殖(Fission)分裂，
2、培养液中产物浓度较小 3、转化细胞筛选麻烦
主要基因工程表达体系比较
表达体系 产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性
潜在危性
大肠杆菌 多肽蛋白质 菌体内 融合蛋白质
容易
一般
部分高产
对原核好 对真核差
不大
酵 母 多肽蛋白质 菌体内 糖基化蛋白 外分泌
容易 可高产
菌体内 真核的接近 稍复杂 天然产物
共同特点:为组氨醇脱氢酶缺陷株，与带有his 标记基因的表达质粒配合使用
三、乳酸克鲁维酵母
具有可稳定存在的附加体型质粒pKD1载体 及高拷贝整合型质粒pMIRK1
外源基因表达水平比酿酒酵母高，如由重组 乳酸克鲁维酵母合成的人IL－1β是重组酿酒 酵母的80－100倍。
四、多型汉逊酵母表达系统
（二）缺点：
1、生长相对细菌缓慢 2、对有些生物活性蛋白仍无法表达或正确修饰，
比如蛋白超糖基化
超糖基化修饰作用
酵母菌糖蛋白的N－糖基外链的组成成分只有甘露 糖，但其分支结构极为复杂的的现象称为超糖基化 修饰作用。
O－寡聚多糖链 N－糖基外侧链
酵母菌 甘露糖单体 甘露糖
高等真核生物 唾液酸基团 甘露糖
（三）基因制药目前普遍使用的芽孢菌表达 系统及载体
枯草芽孢杆菌：蛋白分泌能力强，但同时至少分 泌6种蛋白酶
短小芽孢杆菌：蛋白分泌能力与枯草芽孢杆菌接 近，但胞外蛋白酶活性远低于枯草芽孢杆菌，且 可分泌蛋白酶抑制剂
多重蛋白酶基因缺陷枯草芽孢杆菌 受体菌
DB428﹥WB500 ﹥WB600 DB428、WB500 、WB600蛋白酶活性分别 只及野生型的3.1％、0.8％、0.3％，若加入 蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）则 WB600胞外检测不到蛋白酶活性。
第四节、基因制药常用酵母表达细胞
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)） 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 多型汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
一、酿酒酵母
是第一个用于基因药物表达的酵母菌， 遗传背景已相当清楚：有17条染色体， 1996年完成其全基因组测序，基因组为 12068 kb，阅读开放开架5887个，编码 约6000个基因，比单细胞的原核生物和 古细菌大一个数量级。
第三章：基因药物体外表达的 受体细胞
第一节、宿主细胞选择原则
1、容易获得较高浓度的细胞； 2、安全，不致病； 3、遗传背景清楚，容易进行DNA重组操作及遗传改造； 4、产物的产量高（表达水平和稳定性） 、生物活性高 5、产物容易提取纯化。 6、容易进行代谢调控； 7、易培养（生长速度、营养需求、氧耗量等），培养成本
五、实验室常用的大肠杆菌
用于接受质粒： C600 W3110 HB101 JM83 JM101（Aps、Tcs、Cms）
用于接受l-DNA： LE392、ED8654
二、芽孢杆菌（Bacillus subtilis）表 达体系
（一）生物学特性 革兰氏阳性杆菌 大小0.7～0.8×2～