基因工程第三章
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基因工程第三章分子克隆载体
2、可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复
制。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型
质粒拷贝数较多，可达几百。
严谨控制型 拷贝数少，一般<10个，分子量大；
松弛控制型 拷贝数多，10-200个，分子量小；
复制受限，受细菌宿主DNA复制系 统的控制；
复制不受细菌DNA复制系统限制， 当宿主蛋白质合成受抑制时（如培 养中加入抗生素时），其拷贝数可 猛增至1000-3000之多，该性质对 基因工程技术十分有利。
7、载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段。
第一节 质粒载体
一、质粒的基本特性
质粒(plasmid)：是 独立于许多细菌及某些 真核细胞染色体外共价 闭合环状的DNA分子， 能独立复制的最小遗传 单位，大小在1—200kb 之间。和病毒不同，它们 没有衣壳蛋白（裸DNA）。
绝大多数质粒DNA是双链环形，它具有3种不同的构型:
来自pSCl01的 四环素抗性基因 Tetr
来自RSF2124的 氨苄青霉素抗性基 因Ampr。
特点
1. 具有多个单一的限制性内切酶位点。
2. Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点 （G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。
3. 利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯 霉素使质粒拷贝数进一步扩增。
基因工程
第三章 分子克隆载体
商丘师范学院 马原松
பைடு நூலகம்
第三章 分子克隆载体
教学目的和要求:本章主要阐明用于核酸操作的各种载体: 质粒载体、噬菌体载体和单链丝状噬菌体载体等。通过 本章的学习要求学生了解质粒的基本特性，λ噬菌体的 分子生物学，穿梭载体、整合载体、解离载体等其它载 体；理解大肠杆菌表达载体；掌握质粒载体的工作原理， 噬菌体载体种类及工作原理，粘粒载体、噬菌粒载体的 工作原理。 重点、难点：质粒载体、噬菌体载体的种类和工作原理。 教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等
第三章基因工程常用受体细胞
是一种甲基营养菌，能在相 对较为廉价的甲醇培养基中 生长。
优点
除具有一般酵母所具有的特点 外，还有以下几个 优点： 1、具有目前最强，调控机理最严格的启动子之一 －乙醇氧化酶AOX1基因启动子,外源蛋白表达量 高（一般 500-4000mg/L，最高为破伤风毒素C达到 12g/l） 。 2、表达质粒能在基因组的特定位点稳定整合。 3、蛋白产物糖基化修饰作用大多数情况下接近哺乳动物细
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)） 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 多型汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
一、酿酒酵母
是第一个用于基因药物表达的酵母菌， 遗传背景已相当清楚：有17条染色体， 1996年完成其全基因组测序，基因组为 12068 kb，阅读开放开架5887个，编码 约6000个基因，比单细胞的原核生物和 古细菌大一个数量级。 受体细胞举例：酿酒酵母GRF18
（二）缺点
1、不能识别剪切内含子，不能表达基因组DNA， 只能表达cDNA； 2、缺乏真核生物的蛋白质加工修饰系统，不能进 行蛋白酶解、糖基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、 酰胺化等修饰作用；
蛋白酶解作用：从蛋白前体中切去一段氨基酸序列，从 而获得功能性分子 糖基化意义： 赋予蛋白独特的结合性并增强稳定性
菌体内 稍复杂 简单
不大
哺乳动物
需注意 致癌
第三节、常用原核表达细胞
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 短小芽孢杆菌
一、大肠杆菌表达体系
（一）生物学特性 革兰氏阴性杆菌 大小2～4um×0.4～ 0.1um； 无芽孢； 一般无荚膜(capsule) 裂殖(Fission)分裂， 37℃17分钟繁殖一代。
基因工程第三章
3.2
PCR技术
PCR：聚合酶链式反应 （ Polymerase Chain
Reaction），是指利用耐热DNA聚合酶的反复作
用，通过变性-复性-延伸的循环操作，在体外迅速
将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。
PCR基本原理：变性-复性-延伸
1．变性：通常采用加热变性，即将模板DNA或延伸后 的双链DNA加热到940C，使双螺旋DNA解开成为单链。 2．复性：通过降低反应温度至500C- 650C ，使两种引 物能与两条解开的 DNA 互补链的 3` 端粘合，以提供 DNA聚合酶催化聚合所需的3`-OH。
段的长度。在通常情况下，Taq酶的延伸速率约为2
kb/min，而pfu为1 kb/min 。
（4） 在最后一个循环结束后，需再在72oC下延伸10
min，以产物完整。
单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。 若起始材料是 RNA ，须先通过逆转录得到第一条 cDNA。
为了保证反应的特异性，还应用ng级的克隆
95℃变性处理3min
94℃ 30S 56℃ 30S 72℃ 1min 30个循环
72℃延伸7min
PCR产物纯化
从凝胶上尽量小的切下目的片段 ,放在一个干净 的 EP 管中，称取凝胶的重量，并加入 3 倍体积的 Buffer S1 (即100mg胶加300µL Buffer S1)；盛胶 EP 管于 50℃水浴 10min ，每 2-3min 摇动一次，至 胶彻底融化；溶液加入到吸附柱内， 13000rpm 离 心1min，弃去收集管中的液体；
子中的同源基因或同源序列。
印渍技术： Blotting
印渍技术的原理首先由 Edwen Southern
基因工程第三章 微生物基因工程
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
2、重组异源蛋白包含体表达系统的构建
方法：将外源基因插入到原核表达载体强启动子和有效的SD 序列的下游，表达产物位于胞内，氨基端和羧基端不含有其 他蛋白或多肽序列。
启动子和SD序列可通过一般的重组，PCR扩增甚至化学合成 等方法将两者按照最佳距离及碱基序列连为一体，组成大肠 杆菌表达复合元件。问题是外源基因如何与这类表达复合元 件拼接克隆，才能尽量避免在SD序列与外源基因的起始密码 子之间引入过多的碱基对。（图3-5）
二、大肠杆菌工程菌的构建策略
导致异源重组蛋白在大肠杆菌中不稳定的主要因素有： ①大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白的折叠复性和翻译后加 工系统。 ②大肠杆菌不具备真核细胞完善的亚细胞结构以及众多的 稳定因子。 ③高效表达的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度 的微环境。
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
胰岛素原
19 20
胰岛素
6
7
11 7 基 因 工 程 GENE ENGINEERING
人胰岛素的生产方法
1. 从人的胰中直接提取胰岛素。
2. 由单个氨基酸直接化学合成。 3. 由猪胰岛素化学转型为人胰岛素 4.利用基因工程菌大规模发酵生产重组人胰岛素。
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
2、整合型异源蛋白的表达 阻止重组质粒丢失的方法有： ①对于实验规模而言，将克隆菌置于含有筛选试剂的培养基中 生长，这样可以有效地控制丢失质粒的细菌繁殖速度，维持培 养物中克隆菌的绝对优势。 ②将外源基因直接整合在受体细胞染色体DNA的特定位置上， 使之成为染色体DNA的一个组成部分，从而增加其稳定性。
2、重组异源蛋白包含体表达系统的构建
方法：将外源基因插入到原核表达载体强启动子和有效的SD 序列的下游，表达产物位于胞内，氨基端和羧基端不含有其 他蛋白或多肽序列。
启动子和SD序列可通过一般的重组，PCR扩增甚至化学合成 等方法将两者按照最佳距离及碱基序列连为一体，组成大肠 杆菌表达复合元件。问题是外源基因如何与这类表达复合元 件拼接克隆，才能尽量避免在SD序列与外源基因的起始密码 子之间引入过多的碱基对。（图3-5）
二、大肠杆菌工程菌的构建策略
导致异源重组蛋白在大肠杆菌中不稳定的主要因素有： ①大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白的折叠复性和翻译后加 工系统。 ②大肠杆菌不具备真核细胞完善的亚细胞结构以及众多的 稳定因子。 ③高效表达的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度 的微环境。
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
胰岛素原
19 20
胰岛素
6
7
11 7 基 因 工 程 GENE ENGINEERING
人胰岛素的生产方法
1. 从人的胰中直接提取胰岛素。
2. 由单个氨基酸直接化学合成。 3. 由猪胰岛素化学转型为人胰岛素 4.利用基因工程菌大规模发酵生产重组人胰岛素。
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
2、整合型异源蛋白的表达 阻止重组质粒丢失的方法有： ①对于实验规模而言，将克隆菌置于含有筛选试剂的培养基中 生长，这样可以有效地控制丢失质粒的细菌繁殖速度，维持培 养物中克隆菌的绝对优势。 ②将外源基因直接整合在受体细胞染色体DNA的特定位置上， 使之成为染色体DNA的一个组成部分，从而增加其稳定性。
第三章基因工程载体
16
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
17
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
18
互补显色反应
19
(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供
6
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
7
(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
9
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的 质粒带有一套与传递有关的基因。
(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将 其去除。
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合 成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质 合成的严格控制。
(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗 性等。
个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
12
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
17
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
18
互补显色反应
19
(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供
6
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
7
(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
9
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的 质粒带有一套与传递有关的基因。
(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将 其去除。
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合 成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质 合成的严格控制。
(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗 性等。
个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
12
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
第三章基因工程目的基因的获取分离
用氢氧化钠消化杂合双链 中的 mRNA 链
解离的第一链 cDNA 的 3‘末端就会形成一个发夹环 （发夹环的产生是第一链 cDNA 合成时的特性，原因 至今未知，据推测可能是 由帽子的特殊结构相关）
引导 DNA 聚合酶复制出第 二链，此时形成的双链之 间是连接在一起的
再利用 S1 核酸酶将连接处 （仅该位点处为单链结构） 切断形成平通过几种限制性内切酶切
割，所产生的基因组DNA片段与载体重组并克 隆，由此产N=ln（1DNA片段的出现概率。 f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。
第一：细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；
mRNA
总RNA
tRNA 第二：第一链 cDNA 合成；
rRNA 第三：第二链 cDNA 合成；
2 合成cDNA第一条链 第四：双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
（1）随机引物引导法
并导入宿主中繁殖。
（2）oligo（dT）引导法
（1）随机引物引导法 5´
链 cDNA 为模板合成一段段互补的序列。同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 3'--5'
cDNA 片段。这些 cDNA 片段进而核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链 cDNA 的
在 DNA 连接酶的作用下连接成一 3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。这
条链，即 cDNA 的第二链
种方法合成的 cDNA 在 5'-端存在几个核苷酸缺失， 但一般不影响编码区的完整。
查阅资料自学！
如何找回两膜或硝酸 纤维素滤膜之后，就可以同特异性
的核酸探针进行菌落或噬菌班杂交，
A 应用核酸探针分离克隆的目的基因 以便筛选出具有目的基因的阳性克 隆。这个过程叫做克隆基因的分离
基因工程原理 第3章 DNA分子的切割与连接
IIs系统在识别位点一段距离之外产生限制，其 用途也受到限制。
9
命名法
10
11
识别序列
❖ 大部分II型限制性内切酶识别4-8个碱基的特 定序列，并在该序列内切断DNA，该序列具有 旋转对称的双重轴。
12
EcoR I
13
14
其他的限制性内切酶
15
❖ 同裂酶：具有相同的序特异性和切割位点的 限制酶
❖ Chill on ice and transform 1-5 μl of the reaction into 50 μl competent cells.
38
同聚加尾
PCR产物的T-A克隆
引物引入酶切位点
不需要DNA连接酶的连接方法
Site-specific recombinases
44
实验室里大部分的大肠杆菌菌株含有3个位点特异 的DNA甲基化酶。
❖ 由dam基因编码的甲基化酶 ❖ 由dcm基因编码的甲基化酶 在GC含量50%的DNA中，这两种酶的甲基化位点
出现频率是256-512bp一次。
❖M. EcoK I, 每8kb出现一次。
消除大肠杆菌重组分子宿主菌株 中的限制系统有重要意义
DNA连接酶
31
利用DNA连接酶构建重组质粒
32
应用碱性磷酸酶处理防止载体自连
33
34
的 使 用
35
Adaptor
Ligation Protocol with T4 DNA Ligase
❖ Set up the following reaction in a microcentrifuge tube on ice. (T4 DNA Ligase should be added last. Note that the table shows a ligation using a molar ratio of 1:3 vector to insert for the indicated DNA sizes.) Use NEBioCalculator to calculate molar ratios.
9
命名法
10
11
识别序列
❖ 大部分II型限制性内切酶识别4-8个碱基的特 定序列，并在该序列内切断DNA，该序列具有 旋转对称的双重轴。
12
EcoR I
13
14
其他的限制性内切酶
15
❖ 同裂酶：具有相同的序特异性和切割位点的 限制酶
❖ Chill on ice and transform 1-5 μl of the reaction into 50 μl competent cells.
38
同聚加尾
PCR产物的T-A克隆
引物引入酶切位点
不需要DNA连接酶的连接方法
Site-specific recombinases
44
实验室里大部分的大肠杆菌菌株含有3个位点特异 的DNA甲基化酶。
❖ 由dam基因编码的甲基化酶 ❖ 由dcm基因编码的甲基化酶 在GC含量50%的DNA中，这两种酶的甲基化位点
出现频率是256-512bp一次。
❖M. EcoK I, 每8kb出现一次。
消除大肠杆菌重组分子宿主菌株 中的限制系统有重要意义
DNA连接酶
31
利用DNA连接酶构建重组质粒
32
应用碱性磷酸酶处理防止载体自连
33
34
的 使 用
35
Adaptor
Ligation Protocol with T4 DNA Ligase
❖ Set up the following reaction in a microcentrifuge tube on ice. (T4 DNA Ligase should be added last. Note that the table shows a ligation using a molar ratio of 1:3 vector to insert for the indicated DNA sizes.) Use NEBioCalculator to calculate molar ratios.
基因工程3大肠杆菌表达系统
mRNA转录本5’端的独特的结构特征（核糖 体结合位点，RBS），是决定mRNA翻译效率 的主要因素。
至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方法， 从而提高克隆的外源基因的表达效率。 例如: 在RBS序列中增加AT含量；诱发特异碱基 发生定点突变；以及使用翻译偶联系统进行克隆基 因的表达。
5、容易进行代谢调控；
6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类：
1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、
链霉菌等；
2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物
细胞等。
一、真核基因的大肠杆菌表达体系
目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系 统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆 虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大 肠杆菌表达系统具有明显的优越性。
TAG
TAAGGAGG（N）8
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
• • • • • 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
转录水平
翻译水平
（1）启动子
要使克隆的外源基因高水平表达的最佳 启动子，必须具备以下几个条件： 1）必须是一个强启动子。 2）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达 水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为 重要的条件。 3）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的 方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理 （如热）和化学（如IPTG）诱导 。
（5）翻译终止密码
对mRNA翻译终止而言，一个必不可少的条 件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆 菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码 子，以便阻止发生核糖体的“跳跃”现象。
至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方法， 从而提高克隆的外源基因的表达效率。 例如: 在RBS序列中增加AT含量；诱发特异碱基 发生定点突变；以及使用翻译偶联系统进行克隆基 因的表达。
5、容易进行代谢调控；
6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类：
1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、
链霉菌等；
2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物
细胞等。
一、真核基因的大肠杆菌表达体系
目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系 统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆 虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大 肠杆菌表达系统具有明显的优越性。
TAG
TAAGGAGG（N）8
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
• • • • • 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
转录水平
翻译水平
（1）启动子
要使克隆的外源基因高水平表达的最佳 启动子，必须具备以下几个条件： 1）必须是一个强启动子。 2）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达 水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为 重要的条件。 3）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的 方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理 （如热）和化学（如IPTG）诱导 。
（5）翻译终止密码
对mRNA翻译终止而言，一个必不可少的条 件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆 菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码 子，以便阻止发生核糖体的“跳跃”现象。
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由pSC101派生来的载体。
➢特点是拷贝数低。pLG338、pLG339等
➢适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。
减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。
（3）失控的质粒载体
一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1、pBEU2 温度低（<37 oC），拷贝数很少； 温度增加（>40 oC），拷贝数很快增加到>1000个 。
结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分 子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。
基因工程第三章
3.质粒的不相容性(incompatibility,又称不亲和性)： 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的
第三章 基因工程载体
基因工程第三章
1. 载体 （Vectors）
➢定义：在基因工程操作中，把能携带外
源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
多克隆位点(multiple cloning site)
复制起始点
MCS
ori
pUC
遗传标记 Ampr
基因工程第三章
2. 基因工程对载体的要求
（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。 （2）有选择性标记。 （。3）多克隆位点：供外源基因插入的限制酶位点 （4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。 （5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。 （6）具有对受体细胞的可转移性 （7）具有较好的安全性，不能任意转移
Amp 、Cm、 Kan、 Tet、Sm
显性质粒dominant plasmid、 隐蔽质粒concealed palsmid
基因工程第三章
三、质粒载体的构建
1、 质粒构建基本策略 1.加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于选 择转化体 2.增加或减少合适的酶切位点，便于重组 3.缩短长度，提高导入效率，增加装载量 4.改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 5.根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件
2、可转移性：在天然条件下，很多天然质 粒都可通过细菌接合作用从一种宿主细胞 内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖 于质粒上的tra基因产物。
基因工程第三章
Conjugative plasmid 接合型质粒（自我转移的 质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。 Non Conjugative plasmid 非接合型质粒 （不能自我转移的质粒）：质粒不能从一个细胞 自发的转移到另一个细胞。
氯霉素扩增：在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体
复制的氯霉素存在时，松弛型质粒可继续扩增， 其拷贝数可达2000-3000个，称氯霉素扩增效应
基因工程第三章
➢严紧型复制质粒 （stringent plasmid ）：
只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染 色体不复制时，它也不能复制,通常每个 细胞内只含有1个或几个质粒分子（1-3拷 贝）,如F因子。
基因工程第三章
2.质粒构建原则
1、选择合适的出发质粒: Ori、选择标记、MCS 2、正确获得构建质粒载体的元件 3、组装合适的选择标记基因 4、选择合适的启动子 5、提高外源DNA的容量 6、需要灭活出发质粒上的某些编码基因 7、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单
基因工程第三章
Review
基因工程第三章
3. 人工构建的质粒载体的类型 （1）高拷贝数的质粒载体
➢ColE1、pMB1、pMB9为松弛性质粒。 ➢具有低分子量、高拷贝数的优点。 ➢具有氯霉素扩增效应：每个细胞的拷贝数
100需要表达大
量的基因产物。
基因工程第三章
（2）低拷贝数的质粒载体
基因工程第三章
二、质粒（plasmid）的基本特征
1、自主复制性 ：质粒DNA携带复制起始区 （ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。
➢松弛型复制质粒（relaxed plasmid ）:在整个细胞
周期中随时可以复制，每个细胞中有许多拷贝, 一般10-60 拷贝,如Col E1质粒。
不同质粒，不能在同一个寄主细胞系中稳定地共 存的现象。在细胞增殖过程中，其中必有一种会被 逐渐地排斥（稀释）掉。
➢不亲和群（incompatibility group)：
指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相容的质粒。
➢基因工程中，作为受体的细胞最好不含内源质粒。
基因工程第三章
4、携带特殊的遗传标记：野生型的质粒DNA上往 往携带一个或多个遗传标记基因，这使寄主生 物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性：抗生素、重金属、毒性阴离子等 物质合成: 细菌毒素、有机碱
质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细 胞相应的表型。只有带有选择标记基因的转 化菌细胞才能在选择培养基上生长。 可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而 减轻实验的工作量，提高了选择的敏感性。
基因工程对载体的要求: 质粒的基本特征:自主复制性、 可转移性、质粒
的不相容性、携带特殊的遗传标记
质粒构建基本策略：
加入合适的标记基因、 增加或减少合适的酶切位点、 缩短长度 改变复制子 加装特殊的基因元件
基因工程第三章
质粒构建基本原则:
合适的出发质粒 正确获得载体元件 合适的选择标记基因 选择合适的启动子 提高外源DNA的容量 需要灭活出发质粒上的某些编码基因 构建过程应力求简单
基因工程第三章
➢ 载体 的种类
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
基因工程第三章
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid）
独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状 DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）。并不是细胞生长所必需的，但可以赋予细 胞某些抵御外界环境因素不利影响的能力。分子量 在1-500kb之间广泛存在于细菌.。
基因工程第三章
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因 内部。外源DNA片段插入会导致选择记号基因 （如tetr、ampr、cmlr等）失活。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
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（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
➢特点是拷贝数低。pLG338、pLG339等
➢适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。
减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。
（3）失控的质粒载体
一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1、pBEU2 温度低（<37 oC），拷贝数很少； 温度增加（>40 oC），拷贝数很快增加到>1000个 。
结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分 子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。
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3.质粒的不相容性(incompatibility,又称不亲和性)： 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的
第三章 基因工程载体
基因工程第三章
1. 载体 （Vectors）
➢定义：在基因工程操作中，把能携带外
源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
多克隆位点(multiple cloning site)
复制起始点
MCS
ori
pUC
遗传标记 Ampr
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2. 基因工程对载体的要求
（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。 （2）有选择性标记。 （。3）多克隆位点：供外源基因插入的限制酶位点 （4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。 （5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。 （6）具有对受体细胞的可转移性 （7）具有较好的安全性，不能任意转移
Amp 、Cm、 Kan、 Tet、Sm
显性质粒dominant plasmid、 隐蔽质粒concealed palsmid
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三、质粒载体的构建
1、 质粒构建基本策略 1.加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于选 择转化体 2.增加或减少合适的酶切位点，便于重组 3.缩短长度，提高导入效率，增加装载量 4.改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 5.根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件
2、可转移性：在天然条件下，很多天然质 粒都可通过细菌接合作用从一种宿主细胞 内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖 于质粒上的tra基因产物。
基因工程第三章
Conjugative plasmid 接合型质粒（自我转移的 质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。 Non Conjugative plasmid 非接合型质粒 （不能自我转移的质粒）：质粒不能从一个细胞 自发的转移到另一个细胞。
氯霉素扩增：在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体
复制的氯霉素存在时，松弛型质粒可继续扩增， 其拷贝数可达2000-3000个，称氯霉素扩增效应
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➢严紧型复制质粒 （stringent plasmid ）：
只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染 色体不复制时，它也不能复制,通常每个 细胞内只含有1个或几个质粒分子（1-3拷 贝）,如F因子。
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2.质粒构建原则
1、选择合适的出发质粒: Ori、选择标记、MCS 2、正确获得构建质粒载体的元件 3、组装合适的选择标记基因 4、选择合适的启动子 5、提高外源DNA的容量 6、需要灭活出发质粒上的某些编码基因 7、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单
基因工程第三章
Review
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3. 人工构建的质粒载体的类型 （1）高拷贝数的质粒载体
➢ColE1、pMB1、pMB9为松弛性质粒。 ➢具有低分子量、高拷贝数的优点。 ➢具有氯霉素扩增效应：每个细胞的拷贝数
100需要表达大
量的基因产物。
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（2）低拷贝数的质粒载体
基因工程第三章
二、质粒（plasmid）的基本特征
1、自主复制性 ：质粒DNA携带复制起始区 （ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。
➢松弛型复制质粒（relaxed plasmid ）:在整个细胞
周期中随时可以复制，每个细胞中有许多拷贝, 一般10-60 拷贝,如Col E1质粒。
不同质粒，不能在同一个寄主细胞系中稳定地共 存的现象。在细胞增殖过程中，其中必有一种会被 逐渐地排斥（稀释）掉。
➢不亲和群（incompatibility group)：
指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相容的质粒。
➢基因工程中，作为受体的细胞最好不含内源质粒。
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4、携带特殊的遗传标记：野生型的质粒DNA上往 往携带一个或多个遗传标记基因，这使寄主生 物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性：抗生素、重金属、毒性阴离子等 物质合成: 细菌毒素、有机碱
质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细 胞相应的表型。只有带有选择标记基因的转 化菌细胞才能在选择培养基上生长。 可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而 减轻实验的工作量，提高了选择的敏感性。
基因工程对载体的要求: 质粒的基本特征:自主复制性、 可转移性、质粒
的不相容性、携带特殊的遗传标记
质粒构建基本策略：
加入合适的标记基因、 增加或减少合适的酶切位点、 缩短长度 改变复制子 加装特殊的基因元件
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质粒构建基本原则:
合适的出发质粒 正确获得载体元件 合适的选择标记基因 选择合适的启动子 提高外源DNA的容量 需要灭活出发质粒上的某些编码基因 构建过程应力求简单
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➢ 载体 的种类
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
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第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid）
独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状 DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）。并不是细胞生长所必需的，但可以赋予细 胞某些抵御外界环境因素不利影响的能力。分子量 在1-500kb之间广泛存在于细菌.。
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（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因 内部。外源DNA片段插入会导致选择记号基因 （如tetr、ampr、cmlr等）失活。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
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（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors