基因工程制药-3 表达
(完整版)生物技术制药习题答案(夏焕章版)
第一章绪论填空题1. 生物技术制药的特征高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。
2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是治疗药物、预防药物、诊断药物。
3.现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；二是基因药物；三是来自动物植物和微生物的天然生物药物；四是合成与部分合成的生物药物；4.生物技术的发展按其技术特征来看，可分为三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。
5.生物技术所含的主要技术范畴有基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程；选择题1.生物技术的核心和关键是（A ）A 细胞工程B 蛋白质工程C 酶工程D 基因工程2. 第三代生物技术（ A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围A 基因工程技术B 蛋白质工程技术C 海洋生物技术D细胞工程技术3.下列哪个产品不是用生物技术生产的（D ）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B高技术、高投入、低风险、高收益、长周期C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作A10% B5% C 1% D 7%名词解释1.生物技术制药采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。
2.生物技术药物一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。
3.生物药物生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。
简答题1.生物技术药物的特性是什么？生物技术药物的特征是：（1）分子结构复杂（2）具有种属差异特异性（3）治疗针对性强、疗效高（4）稳定性差（5）免疫原性（6）基因稳定性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效应和网络效应（10）检验特殊性2.简述生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品？（1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。
《基因工程制药》课程教学大纲
《基因工程制药》实验教学大纲课程代码：BIOP1026课程名称：基因工程制药英文名称：Gene Engineering Pharmaceutical Science实验室名称：生物制药实验室（二）课程学时：90实验学时：36一、本课程实验教学目的与要求本课程是生物制药专业的专业实验课程，是以基因工程基本操作为主线，强调实验方法的经典性、实用性。
实验内容涉及了基因工程制备药物的主要过程，通过本课程的学习使学生掌握基因工程的一些基本原理和实验操作方法，并使其对基因工程制药的上、下游技术有一个完整的概况，力求全面、系统地培养学生基因工程制备药物的实验操作能力，并提高解决问题及分析研究问题的能力，为本科生进入科研实验室打下良好的基础。
二、主要仪器设备及现有台套数恒温培养箱、恒温摇床、高压灭菌锅、电子天平、微量移液器、凝胶成像系统、超净工作台、台式离心机、旋涡混合器、磁力搅拌器、琼脂糖凝胶电泳槽、电泳仪、PCR仪、水浴锅、垂直电泳槽、发酵罐、电转仪。
微波炉、脱色摇床、制冰机三、实验课程内容和学时分配四、考核方式1、实验报告：本门课程要求实验报告应具有“实验目的与要求、原理、实验基本过程、实验结果与讨论”等几个方面的内容。
2、考核方式（1）实验课的考核方式：本课程按等级制评定与考核，评分标准分为：A、B、C、D、E五个等级。
考核主要包括两部分：实验操作技能、实验报告（包括实验预习报告）。
（2）实验课考核成绩确定，实验课成绩占课程总成绩的比例等：在该课程的评定分数中，实验课内容占30%，其中实验课考核又分为两部分，即实验操作技能占实验课总分数的60%、实验报告（包括实验预习报告）占实验课总分数的40%。
五、实验教材、参考书1、教材：自编参考楼士林主编《基因工程》，科学出版社20072、参考书目：（1）基因工程技术实验指导，钟卫鸿主编，化学工业出版社 2007（2）基因工程实验指导，朱旭芬主编，高等教育出版社，2006（3）基因工程实验技术，彭秀玲编著，湖南科学技术出版社 1997《酶工程制药》实验教学大纲课程代码：BIOP1027课程名称：酶工程制药英文名称：Enzyme Engineering Pharmaceutical science实验室名称：药学院实验中心生物制药实验室课程学时：90实验学时：36一、本课程实验教学目的与要求本课程实验教学的目的是让学生掌握酶制剂的发酵生产方法、酶的固定化原理与操作方法、酶分子的修饰原理和实验方法等，加深学生对抽象的理论内容的理解；通过实验训练，培养学生的动手操作能力和观察能力，正确掌握实验仪器的使用方法和实验操作技能，培养学生独立解决问题的能力和严谨的科学态度。
基因工程3大肠杆菌表达系统
生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 （Bacillus thuringiensis），该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用，可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因，可以获得具有催化活性的酶，用
安全性问题
针对安全性问题，应加强监管和规范操作，确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染，应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产，并采取有效的检 测手段，确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用，用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物， 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因，可以获得具有生物活性的蛋 白质，用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景，可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔，可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
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基因工程在生物制药领域的应用探讨
基因工程在生物制药领域的应用探讨作者：匡光永来源：《中国民商》2021年第08期摘要：随着经济社会的发展，生物制药领域开始引入基因工程技术，使用基因工程技术对自身进行改造和发展。
本文从生物制药领域中的基因操作技术分析概念入手，进行以基因工程为基础的其中几类药物类型的分析，从而了解基因工程生物制药所面临的机遇以及需要解决的问题，从而使其得到更好的发展。
关键词：基因工程;生物制药;前景一、生物制药领域中的基因操作技术分析（一）基因大分子分离技术DNA大分子的分离技术，最常用的是DNA电泳。
在电泳之前，首先要提取基因所在的位置，以细菌的质粒DNA为例，现阶段使用的提取方法是碱裂解法，具体是将含有质粒的大肠杆菌用NaOH和SDS混合的变性液进行处理，再用高速离心机离心处理，从而将质粒DNA分离出来。
进一步地，如果想要分离出目的DNA片段，就需要用到DNA电泳技术，常用的电泳是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
凝胶电泳的原理其实很简单，DNA是一种多聚阴离子，将其放置在电场中，DNA分子就会迁移到正电极的方向，DNA分子的长度越长，携带的净电荷越多，向正电极方向迁移的速率就越快，因此，在电场强度一定的条件下，DNA 分子的迁移速率取决于DNA片段的大小和构型。
电泳的步骤为：配胶-制胶板-样品的处理-点样-电泳-检测。
（二）PCR技术PCR技术，即聚合酶链式反应，是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术，可以实现短时间内少量甚至微量DNA分子的大量扩增。
PCR技术是分子克隆技术的基石，是基因工程中必不可少的技术。
PCR技术的原理来源于DNA的半保留复制，在生物体内，DNA的复制过程分为三个阶段：复制的起始、延伸和终止，PCR也分为三个阶段：高温变性、复性和延伸，这三个阶段不断的循环往复，从而得到大量的目的基因。
PCR技术已广泛应用于基因的克隆，分子探针的制备和基因定位等实验中，在生物制药领域中也常用于诊断试剂的开发。
第三章基因工程制药
究，从而扩大这些物质的引用范围； • （3）利用基因工程技术可以发现，挖掘更多的内源性生理活性物质； • （4）内源生理活性物质在作为药物使用存放的不足之处，可以通过基因工程和蛋白
质工程进行改造和去; • （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
2019
IFN-γ 125Ser IL-2 生长激素（GH） 痢疾疫苗 牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）
2020/4/23
批准年份 2019 2000
2019 2019 2019 2019
2019
药品
125Ala IL-2 人胰岛素 Anti-CD3鼠源单抗
人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） 表皮生长因子（EGF） EGF衍生物 霍乱疫苗（rBS-WC）
双脱氧末端终止测序法
2020/4/23
2020/4/23
模板序列
测序 读片
2020/4/23
近年来，建立了一种使用荧光染料的无放射性标记 的DNA测序法。它使用4种不同颜色的荧光染料分别 标记4种不同的碱基，并在一个凝胶电泳的泳道中进 行电泳，然后通过激光作用诱发荧光，达到检测碱基 的目的。
2020/4/23
作业 查阅资料，准备ppt、课程论文介绍某种
基因工程药物的生产工艺。
2020/4/23
一、基因工程药物
• 1982年第一个基因重组产品——人胰岛素在美国Eli Lilly公司
问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品， 迄今累计已有近30种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会 效益和经济效益。
血友病
2020/4/23
第四章基因工程制药
3.基因工程技术最成功的成就:用于新型生物技术药物的研制
4.基因工程技术的主要工具: * Tool enzyme 工具酶:restriction enzyme, ligase, repair. * Nucleic acid and protein sequence:Basis for gene analyze and synthesis. * Transfer vector: gene transfer * Expression vector: Manufacture plant for gene replication and expression target products. Good Vectors: Ecol. ,---- High efficiency expression but glycoprotein Beer yeast , mammalian cell ----glycoprotein
5、将重组体导入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测 序、确定基因的 转录方向、转录起始点等。）
二、化学合成法
较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成 法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基 因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序， 再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。
10mM Tris 1mM EDTA
纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图
Poly(A)mRNA
2、cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使
oligo(dT)选出的mRNA有5—30%被拷贝。
3、cDNA第二链的合成：
基因工程制药
基因工程制药基因工程制药是指利用生物技术手段，通过基因克隆、遗传工程、细胞培养等技术制备的药物。
相比传统的制药技术，基因工程制药具有高效、精准、无毒副作用等优点。
本文将从基因工程制药的概念、制备过程、应用、发展现状等方面进行介绍。
一、基因工程制药的概念基因工程制药是指利用遗传工程技术，将DNA序列插入到细胞内，使细胞能够表达人类所需的有效蛋白质，从而制备出符合医疗需求的药物。
基因工程制药的研发已成为制药业的重要领域，具有广阔的市场前景和潜力。
二、基因工程制药的制备过程基因工程制药的制备过程包括基因选择、基因克隆、载体构建、转染细胞、发酵培养和纯化等步骤。
1、基因选择基因工程制药的制备过程首先要选择适合人体治疗的基因，可以是已知的治疗目标基因，也可以是新发现的疾病相关基因。
2、基因克隆基因克隆是将目标基因从DNA分子复制到载体上的过程。
其中包括PCR扩增、酶切、连接和转化等步骤，最终得到包含目标基因的重组载体。
3、载体构建为了使目标基因的表达量达到较高水平，需要将目标基因克隆到适合的载体中。
典型的载体包括质粒和病毒。
4、转染细胞将重组载体转染到宿主细胞中，宿主细胞将目标基因表达成蛋白质。
常用的宿主细胞有哺乳动物细胞和真菌等。
5、发酵培养将转染后的细胞进行大规模培养，加入培养基和营养成分，进行培养和生长。
由于基因工程制药药物的生产量较大，通常采用发酵技术进行生产。
6、纯化将发酵得到的药物纯化出来，使其达到医药级别要求。
通常采用多种分离纯化技术，如超滤、离子交换和透析等，得到纯度高、活性好的药物制剂。
三、基因工程制药的应用基因工程制药已经广泛应用于多种疾病的治疗中，如慢性病、肿瘤、代谢性疾病和遗传性疾病等。
其中常见的基因工程制药药物有类风湿关节炎药物、肿瘤靶向药物、生长激素、重组人胰岛素和重组人血小板等。
1、类风湿关节炎药物抗肿瘤类药物通过影响免疫系统来治疗类风湿关节炎。
这些药物通常在类风湿关节炎患者无法耐受非甾体类抗炎药物和光合作用药物时使用。
基因工程制药中常用的上、下游技术
• HA-tag (YPYDVPDYA)
• Flag-tag (DYKDDDDK) • Myc-tag (EQKLISEEDL)
和Plac杂合成的Ptac，启动强度分别是Ptrp的3倍
和 Plac 的 11 倍。启动子的强弱程度还与所控外源 基因的性质密切相关。
优化转录调控元件
双启动子表达载体
• 为提高转录活性，增加外源基因的 表达量有时将两个启动子串联到一起。 • 两个不同的启动子串联， 如 PR+T7 • 两个相同的启动子串联, 如 T7+T7
异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式
包涵体型表达的优缺点
• 优点：
• 外原基因的表达量极高，对宿主细胞的 生长和代谢影响小 • 抗宿主细胞内蛋白酶降解的能力强 • 目标蛋白的纯度高，易于分离和纯化
• 缺点：
• 必须复性
异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式
分泌型表达
• 分泌型表达的特点： • 在 N 端加上能够跨膜的信号肽序列。这对 重组蛋白的折叠可能有一定好处；由于跨膜是 逐个进行的，蛋白间的交联机会较少；周质中 的蛋白酶活性比胞质低；周质蛋白仅占菌体总 蛋白的4%，使之易于纯化。但分泌到周质中的 重组蛋白其构象不一定是天然构象，在周质中 的重组蛋白也可能形成包涵体。
外源基因染色体定位整合原理
•
根据DNA同源交换原理，在外源 基因两侧各组合一段与染色体特定 部位完全相同的同源序列。外源基 因越长同源序列也需越长。
外源基因在大肠杆菌 中的高效表达的方法
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• 利用低浓度的IPTG诱导可提高可溶蛋白 的含量。
(4)蛋白质的包涵体形式表达与蛋白质 复性
• 包涵体是指在某些生长条件下，大肠杆菌能
积累某些特殊的生物大分子(主要是蛋白质组 成)，它们在细胞内致密地聚集成没有生物活
性的直径约0.1-3.0μm的固体颗粒，或被膜
包裹或形成无膜裸露结构。 • 包涵体主要由蛋白质组成，其中大部分是克 隆外源基因的表达产物。
（3）供给丰富的培养基，创造最佳条件，如供
氧、pH。
包涵体蛋白的分离、纯化
• 包涵体的形成不仅可获得高表达、高纯度的重组蛋
白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白质的破坏。
• 由于包涵体是蛋白质聚集而成的致密颗粒，分离的第一 步是对培养收集的细胞进行 破碎 ，有效的方法是高压
匀浆结合溶菌酶处理，然后5000~20000g离心 ，可使大
抑制子基因及PR启动子、pRC23的PL启
动子及SD序列
优点:
①cIts857抑制子基因与PL启动子同在,以便选用
蛋白酶活低的宿主细胞,使表达产物不易降解; ②SD序列后面紧跟多克隆位点,便于插入带起始 ATG的外源基因,可表达非融合蛋白; ③强的转录终止信号可防止出现“通读”现象, ④质粒小,有利于增加其拷贝数及容量,可以插入 较大片段的外源基因; ⑤PR与PL启动子串联,可以增强启动作用。本系 统为温度诱导,外源基因表达量可达到细胞总 蛋白的20%-30%, 包涵体形式存在, 不易被降 解,均一性好。
即可将包涵体从细胞裂解物中分离出来）
• 减少对宿主菌的毒害
包涵体形成的原因
• 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物 中翻译后修饰所需的酶类，致使中间体大量积累，容 易形成包涵体沉淀。
• 缺乏蛋白质折叠过程中需要的某些酶和辅助因子，
或环境不适，无法形成正确的次级键等，也是原因之 一。
• 表达量越高越容易形成包涵体。可能因为合成速度
以CNBr处理去除融合多肽示意图
凝血因子Xa切割融合蛋白示意图
GST融合表达载体 pGEX6p-3
GST纯化
例
• 上清液加入1mL 50%的 谷胱甘肽-琼脂糖珠 混 悬液中，室温下轻轻混匀超过2min。加50mL冰浴预 冷的PBS液洗涤，混匀， 500g离心10s。用PBS液洗 涤2次，用1～2mL冰冷的PBS重悬琼脂糖珠，并移入 一个1.5mL微量离心管中。 • 室温下500g离心10s收集琼脂糖珠，弃上清液。加
• 表达非融合蛋白的操纵子:
细菌或噬菌体的启动子一细菌的核糖体结合位 点(SD序列)一真核基因的起始密码子一结构基 因一终止密码。 • 要求：SD序列与翻译起始密码ATG之间的距离 要合适 • 特点：非融合蛋白能够较好地保持原来的蛋白 活性；容易被蛋白酶破坏；非融合蛋白N末端 带有甲硫氨酸,可能引起人体免疫反应。
（1）化学裂解
可采用诸如溴化氰（Met↓）、BNPS-3-甲基吲哚 （ Trp↓ ） 、 羟 胺 （ Asn↓Gly ） 等 试 剂 或 低 pH （Asp↓Pro）来进行融合蛋白的化学裂解。
（2）酶解
• 温和；高度专一性。 • 有用的酶有：凝血酶、肠激酶、Xa因子、凝乳酶、胶 原酶等。这些酶都具有较长的底物识别序列（比如在 凝乳酶中为7个氨基酸），从而降低了蛋白质中其他无 关部位发生断裂的可能性。 • 肠激酶和凝血酶应用最多，因为它们切割各自的识别 序列的羧基端，就使带有天然氨基端的被融合部分得 以释放。
融合表达质粒pBG-2的结构
pET系统
• LB培养基或M9培养基中生长良好； • 产物以包涵体形式存在于细胞内 • 外源基因最大表达量可占细胞总蛋白的 50%。中试生产中,可以用乳糖代替IPTG 作为诱导剂, 降低发酵成本； • 新的PET系统带有his标记, 标记与克隆 位点之间有酶切割位点,使产物能方便地 使用金属整合物分离材料进行分离,一步 达到高纯度、高收率。
(1)表达载体需要具备的条件
1、能够独立复制，复制能力强，多用松弛型； 2、具有灵活的多克隆位点； 3、具有方便的筛选标记； 4、具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA 聚合酶识别； 5、具有很强的终止子； 6、mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码 AUG和SD序列； 7、一般具有阻遏子，使启动子受到控制
• 宿主细胞有两类：
原核细胞表达体系（大肠杆菌、枯草芽孢杆
菌、链霉菌）； 真核细胞表达体系（酵母、哺乳动物细胞）
1.原核细胞表达体系
• 大肠杆菌(Eschertchia coli) EPO能否 研究的比较多，技术成熟； 在本体系 进行表达? 操作方便；成本低； 不存在翻译后修饰作用，对蛋白质产物 不能糖基化； • 枯草芽孢杆菌 分泌能力强；具有若干种有
表达载体的基本结构
Ribosome Promoter binding site
Terminator
Gene
DNA RNA transcript
(2)基因工程药物常用的表达载体 • pBV220(3.66kb)系统，
• pET系统
pBV220表达系统
• pBV220系统组成:
pUC8的多克隆位点、核糖体rrnB基 因终止信号、pBR322第4245－3735位、 pUC18第2066－680位、 噬菌体cIts857
实现分泌表达的条件
• 合适的信号肽(碱性磷酸酶信号肽(phoA)、
膜外周质蛋白信号肽(OmpA)、霍乱弧菌 毒素B亚单位(CTXB)等)；
• 培养条件：培养温度影响着分泌的速度，分泌 速度又与蛋白质的正确折叠有关； • 启动子的强度和诱导剂的浓度也有影响； • 目前普遍接受的观点：
低温，低强度的启动子和较低浓度 的诱导剂，可能实现分泌表达。
太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能
正确配对，过多的蛋白间可能存在非特异性结合，蛋 白质无法达到足够的溶解度等。
减少包涵体形成的策略
（1）降低重组菌的生长温度。
（2）促进重组蛋白质可溶性表达的生长 添加剂： 高浓度的多醇类、蔗糖可以阻止分泌到周质的 蛋白质的聚集反应。其它添加剂还有乙醇（诱 导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二 硫化合物（改变细胞周质的还原态，影响二硫 键的形成）等。
• 缺点：
动物细胞生产周期长，培养条件苛刻等
二. 大肠杆菌中的基因表达
大肠杆菌应用最广泛、最成功的表达 体系，常常作为高效表达的首选体系
1.载体
• 载体的作用是把外源DNA带进宿主细胞，并使
之在细胞内建立稳定的遗传状态，在细胞内繁 殖、传代或进行表达。 • 载体主要有质粒、粘性末端质粒、噬菌体和病 毒。 • 载体按照其用途可分为：克隆载体、表达载体、 转移载体、探针载体。
pRSET
2.影响目的基因在大肠杆菌中表达的
因素
（1）外源基因的拷贝数:高拷贝的表达质粒 （2）外源基因的表达效率： 强启动子 核糖体结合位点（RBS）有效性 SD序列和起始密码ATG的间距 选择偏爱的密码子 （3）表达产物稳定性,不易被降解 （4）细胞的代谢负荷：防止表达产物的毒性 （5）优化工程菌的培养条件
Gene
DNA
Vector
mRNA
Host cell
protein
tet四环素诱导产生的a-synuclein蛋白质
一. 宿主细胞的选择
• 对宿主细胞的要求：
容易获得较高浓度的细胞，能利用价廉易得 原料，不产生内毒素、不致病，需氧低，发热量 低，适当的发酵温度，易进行代谢调控，易进行 DNA重组技术操作，产物的产量、产率高，易进 行分离纯化等。
于二硫键的正确形成。
信号肽序列
• 信号肽：15-30个疏水Aa残基组成，N-端的小段肽链
是以带正电荷的赖氨酸和精氨酸为特征，随后是以疏 水Aa为主的肽段，在邻近切割位点处常有几个侧链很 短的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸等。
• N–端带正电荷的一段：有助于新生肽链与带负电荷的 细胞质膜结合； • 疏水肽段：能形成α-螺旋结构，两段螺旋以反平行的 方式形成发夹结构之后，容易进入内膜的脂双层； • 邻近切割位点的氨基酸：倾向于形成β-折叠，这可能 是信号肽酶所识别的结构。 • 信号肽后面的氨基酸：也影响蛋白质的穿膜和随后的 切割。
1mL GST洗脱缓冲液 （ 50mmol/L Tris· ， Cl
pH8.0/ 5mmol/L还原型谷胱甘肽）洗脱融合蛋白。混 匀2min,500g离心10s，收集上清液。重复洗脱二三 次，经SDS-PAGE分析各分部收集的样品。洗脱的蛋 白质分成小份，加甘油10%贮存于-70℃。
(2) 药物蛋白基因的非融合表达
第三章 基因工程制药
生物信息和疾病
复制
3.5 目的基因表达
DNA
转录
病毒细菌 入
体细胞基
RNA
翻译
基因突变
多基因突
蛋白质
基因功能 ？？？
合成目的基因产物包括转录、翻译、加工 等过程，首先使目的基因编码序列在RNA聚合酶 催化下转录成mRNA，mRNA与核糖体结合，由 tRNA将氨基酸引入，按mRNA的遗传信息翻译为 多肽。通常，新生多肽需经过翻译后加工，如 糖基化、磷酸化等才能成为有功能的蛋白。
价值的信全不致病；表达
的蛋白基本能正确折叠,不形成包涵体
异源和同源蛋白在芽孢杆菌表达的实例
2.真核细胞表达体系
(1)酵母表达体系 主要优点：
①强启动子可促使外源基因达到高效表达,如明 胶表达量可高达14.8g/L;
eg.乙肝，干扰素等
②高密度培养, 可使菌丝干重达到100g/L甚至
（3）药物蛋白基因的分泌型表达
细胞外膜蛋白、周质蛋白、内膜蛋
白以带有N-端信号肽的前体形式在细胞
质中合成，随后穿膜运送到周质或定位
到内、外膜上。在穿膜的过程中，信号
肽被信号肽酶切除。
信号肽 + 外源基因