蛋白质分析概述
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
上世纪80年代末，电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光解吸电离 （MADIL）两种“软电离”技术的 出现，使得蛋白质等生物大分子的 质谱鉴定成为可能。
90年代以后，利用肽质量指纹（PMF）、串联质谱（MS/MS）数据和 序列标签法，搜索已知蛋白 质序列鉴定蛋白质的算法和软件相继出现， 蛋白质组学研究得到飞跃发展。
二维凝胶电泳（2-DE）
二维凝胶电泳（2-DE）
双向荧光差异凝胶电泳
2-DE的优点
1. 一次可分离上千种10～100 kD分子量 的蛋白质
2. 高分辨率
3. 便于计算机分析处理 -蛋白质定位、等电点、分子量的鉴定 -蛋白质的定量 -wk.baidu.com立蛋白质数据库 -不同的图谱可进行比较和分析
4. 与分析鉴定方法相匹配 -转移到PVDF膜上进行N或C端的序列分析 -直接进行蛋白质胶内或膜上酶解与质谱 分析匹配。
蛋白质分析概述
生命科学的主要研究对象
DNA RNA Protein Metabolism
Genome “Genomics” Transcriptome “Transcriptomics” Proteome “Proteomics” Metabolome “Metabonomics”
基因组学
基因组: 一种生物体或个体细胞所具有的一套完整的 基因及其调控序列。
代谢物组学
代谢组：指某一生物或细胞在一特定生理时 期内所有的低分子量代谢产物。
代谢物组学：定量描述生物内源性代谢物质 的整体及其对内因和外因变化应答规律的科 学。
基因组学和蛋白质组学告诉你什么可能会发生，而代谢组学则告诉你什么确 实发生了。
人类蛋白组数量
蛋白质组学研究策略
穷尽法：采用高通量的蛋白质组研究技术，力图查清生物体内的一 切蛋白。 差异法：寻找和筛选有意义因素引起不同群体样本间差异蛋白谱， 揭示细胞对此因素的反应途径、进程与本质，同时获得对某些关键 蛋白的认识和功能分析。
基因组学：研究基因组的结构组成、时序表达模式 和功能，并提供有关物种及其细胞功能的进化信息。
特点：细胞中全部基因及非编码区的整体性考察和 系统性研究。揭示基因与基因间的相互关系、基因 与非编码序列的关系、基因与基因组的关系。
转录组学
转录组: 广义指某一生理条件下，细胞内所有转录产物 的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运 RNA及非编码RNA; 狭义指所有mRNA的集合。
2.高效、灵敏、准确、自动化、可同时分 析多蛋白混合物
3.已逐步取代了传统的Edman降解测序与 氨基酸组份分析法，成为蛋白质鉴定的核 心技术
质谱仪的功能模块
质谱仪由进样器、离子源、质量分析器、离子检测器、控制电脑及数据分析 系统等组成 –电离装置把样品电离为离子 –质量分析装置把不同质荷比的离子分开 –经检测器检测之后可以得到样品的质谱图
2-DE的缺点
1.难以有效分离的蛋白质： -极酸、极碱性蛋白质 -疏水性蛋白质 -极大蛋白质、极小蛋白质 -低丰度蛋白质
2.胶内酶解过程费时、费力，难 以与质谱联用实现自动化。
样品分离
凝胶电泳（1D Gel 、2-DE)
色谱技术（液相色谱、毛细管电泳）
质谱分析
1.可以获得样品分子量、分子式、分子中 同位素构成和分子结构等多方面的信息
质谱仪的主要技术指标
质量范围： 质谱仪所检测的单电荷离子的质荷比范围
分辨率(R)： 质谱仪分开相邻两离子质量的能力。 R = m /m m 为质谱仪可分辨的相邻两峰的质量差 m 为可分辨的相邻两峰的平均质量
质量精确度：生物分析物质量的测量值与实际分子量的接近程度 (用百万分率表示，ppm)
扫描速度: 离子检测速度即质谱仪获取数据的速度
蛋白质组学分类
表达蛋白质组学(Expression proteomics) ---又称定量调节蛋白质组学（quantitative regulation proteomics), 研究在 整体水平上研究生物体蛋白质表达的变化。
细胞谱蛋白质组学(Cell-map proteomics) ---又称结构蛋白质组学 (structural proteomics)，研究蛋白质在细胞内行为、 运输和相互作用。
功能蛋白质组学（functional proteomics) ---以特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质研究对象。
蛋白质组学与基因组学的比较
相同点: 都属于整体概念, 蛋白质组是基因组的反映，但不是一个基因 组的直接产物。
不同点: 基因组: 1.均一性和完整性 2.非常稳定，不易发生改变 蛋白质组: 1.特殊性和多样性 2.可变性，高度动态
随着国际人类基因组计划的完成，蛋白质序列数据库逐渐完善，串联 质谱 和数据库搜索结合来鉴定蛋白质，可以满足蛋白质组学研究高通 量、自动化 的要求，成为人类蛋白质组表达谱研究的重要方法之一。
蛋白质组研究的基本技术路线
样品分离
凝胶电泳（1D Gel 、2-DE)
色谱技术（液相色谱、毛细管电泳）
一维凝胶电泳（1D Gel）
转录组学：对转录水平上发生的事件及其相互 关系和意义进行整体研究的一门科学。
蛋白质组学
蛋白质组:一个细胞、一个组织或一个机体的基因 组所表达的全部相应的蛋白质。
蛋白质组学:从整体水平上研究细胞内蛋白质组成 及其活动规律的一门科学。
研究目的: 对细胞内各种蛋白质的识别与定量化, 确定它们的细胞内外的定位、修饰、相互作用、 活性及其功能。
蛋白质鉴定的技术流程图
样品制备 蛋白分离 酶切 肽段分离 质谱鉴定 质谱数据处理过程 数据库搜索 质控和评估 最终鉴定列表的获得
蛋白质组信息学整体框架
蛋白质鉴定的发展史
传统的蛋白质鉴定基于1950年Edman 提出的Edman降解法进行氨基酸测序。
1980年，Shimonishi等将质谱和Edman降解法结合对肽段混合物进行测 序，并针对该方法开发了相 应的计算程序
1984年，Sakurai等基于全面搜索模式（穷举法）发展了自动化的从头 （de novo）肽段测序算法， 一些改进的算法也陆续出现，如局部法 （图论法）把质谱峰转化成质谱图中的节点，通过构建最佳 路径寻找 氨基酸序列，大大提高了从头测序的效率
90年代以后，利用肽质量指纹（PMF）、串联质谱（MS/MS）数据和 序列标签法，搜索已知蛋白 质序列鉴定蛋白质的算法和软件相继出现， 蛋白质组学研究得到飞跃发展。
二维凝胶电泳（2-DE）
二维凝胶电泳（2-DE）
双向荧光差异凝胶电泳
2-DE的优点
1. 一次可分离上千种10～100 kD分子量 的蛋白质
2. 高分辨率
3. 便于计算机分析处理 -蛋白质定位、等电点、分子量的鉴定 -蛋白质的定量 -wk.baidu.com立蛋白质数据库 -不同的图谱可进行比较和分析
4. 与分析鉴定方法相匹配 -转移到PVDF膜上进行N或C端的序列分析 -直接进行蛋白质胶内或膜上酶解与质谱 分析匹配。
蛋白质分析概述
生命科学的主要研究对象
DNA RNA Protein Metabolism
Genome “Genomics” Transcriptome “Transcriptomics” Proteome “Proteomics” Metabolome “Metabonomics”
基因组学
基因组: 一种生物体或个体细胞所具有的一套完整的 基因及其调控序列。
代谢物组学
代谢组：指某一生物或细胞在一特定生理时 期内所有的低分子量代谢产物。
代谢物组学：定量描述生物内源性代谢物质 的整体及其对内因和外因变化应答规律的科 学。
基因组学和蛋白质组学告诉你什么可能会发生，而代谢组学则告诉你什么确 实发生了。
人类蛋白组数量
蛋白质组学研究策略
穷尽法：采用高通量的蛋白质组研究技术，力图查清生物体内的一 切蛋白。 差异法：寻找和筛选有意义因素引起不同群体样本间差异蛋白谱， 揭示细胞对此因素的反应途径、进程与本质，同时获得对某些关键 蛋白的认识和功能分析。
基因组学：研究基因组的结构组成、时序表达模式 和功能，并提供有关物种及其细胞功能的进化信息。
特点：细胞中全部基因及非编码区的整体性考察和 系统性研究。揭示基因与基因间的相互关系、基因 与非编码序列的关系、基因与基因组的关系。
转录组学
转录组: 广义指某一生理条件下，细胞内所有转录产物 的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运 RNA及非编码RNA; 狭义指所有mRNA的集合。
2.高效、灵敏、准确、自动化、可同时分 析多蛋白混合物
3.已逐步取代了传统的Edman降解测序与 氨基酸组份分析法，成为蛋白质鉴定的核 心技术
质谱仪的功能模块
质谱仪由进样器、离子源、质量分析器、离子检测器、控制电脑及数据分析 系统等组成 –电离装置把样品电离为离子 –质量分析装置把不同质荷比的离子分开 –经检测器检测之后可以得到样品的质谱图
2-DE的缺点
1.难以有效分离的蛋白质： -极酸、极碱性蛋白质 -疏水性蛋白质 -极大蛋白质、极小蛋白质 -低丰度蛋白质
2.胶内酶解过程费时、费力，难 以与质谱联用实现自动化。
样品分离
凝胶电泳（1D Gel 、2-DE)
色谱技术（液相色谱、毛细管电泳）
质谱分析
1.可以获得样品分子量、分子式、分子中 同位素构成和分子结构等多方面的信息
质谱仪的主要技术指标
质量范围： 质谱仪所检测的单电荷离子的质荷比范围
分辨率(R)： 质谱仪分开相邻两离子质量的能力。 R = m /m m 为质谱仪可分辨的相邻两峰的质量差 m 为可分辨的相邻两峰的平均质量
质量精确度：生物分析物质量的测量值与实际分子量的接近程度 (用百万分率表示，ppm)
扫描速度: 离子检测速度即质谱仪获取数据的速度
蛋白质组学分类
表达蛋白质组学(Expression proteomics) ---又称定量调节蛋白质组学（quantitative regulation proteomics), 研究在 整体水平上研究生物体蛋白质表达的变化。
细胞谱蛋白质组学(Cell-map proteomics) ---又称结构蛋白质组学 (structural proteomics)，研究蛋白质在细胞内行为、 运输和相互作用。
功能蛋白质组学（functional proteomics) ---以特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质研究对象。
蛋白质组学与基因组学的比较
相同点: 都属于整体概念, 蛋白质组是基因组的反映，但不是一个基因 组的直接产物。
不同点: 基因组: 1.均一性和完整性 2.非常稳定，不易发生改变 蛋白质组: 1.特殊性和多样性 2.可变性，高度动态
随着国际人类基因组计划的完成，蛋白质序列数据库逐渐完善，串联 质谱 和数据库搜索结合来鉴定蛋白质，可以满足蛋白质组学研究高通 量、自动化 的要求，成为人类蛋白质组表达谱研究的重要方法之一。
蛋白质组研究的基本技术路线
样品分离
凝胶电泳（1D Gel 、2-DE)
色谱技术（液相色谱、毛细管电泳）
一维凝胶电泳（1D Gel）
转录组学：对转录水平上发生的事件及其相互 关系和意义进行整体研究的一门科学。
蛋白质组学
蛋白质组:一个细胞、一个组织或一个机体的基因 组所表达的全部相应的蛋白质。
蛋白质组学:从整体水平上研究细胞内蛋白质组成 及其活动规律的一门科学。
研究目的: 对细胞内各种蛋白质的识别与定量化, 确定它们的细胞内外的定位、修饰、相互作用、 活性及其功能。
蛋白质鉴定的技术流程图
样品制备 蛋白分离 酶切 肽段分离 质谱鉴定 质谱数据处理过程 数据库搜索 质控和评估 最终鉴定列表的获得
蛋白质组信息学整体框架
蛋白质鉴定的发展史
传统的蛋白质鉴定基于1950年Edman 提出的Edman降解法进行氨基酸测序。
1980年，Shimonishi等将质谱和Edman降解法结合对肽段混合物进行测 序，并针对该方法开发了相 应的计算程序
1984年，Sakurai等基于全面搜索模式（穷举法）发展了自动化的从头 （de novo）肽段测序算法， 一些改进的算法也陆续出现，如局部法 （图论法）把质谱峰转化成质谱图中的节点，通过构建最佳 路径寻找 氨基酸序列，大大提高了从头测序的效率