利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法在结核病中的应用
XpertMTB_RIF技术在结核分枝杆菌利福平耐药性检测中的应用杨俊勇
Xpert MTB/RIF技术在结核分枝杆菌利福平耐药性检测中的应用杨俊勇发布时间：2023-06-07T08:36:43.698Z 来源：《中国医学人文》2023年5期作者：杨俊勇[导读] 探讨Xpert MTB/RIF技术在结核分枝杆菌（MTB）快速检测及利福平耐药检测在黔东南州16县（市）的应用价值，旨在为后续肺结核的诊断与治疗提供指导。
方法：收集我中心结核病实验室2022年1月至10月共1367份检测样本进行Xpert MTB/RIF检测，分析Xpert MTB/RIF法检测的敏感性和特异性。
将1367份培养阳性样本进行分枝杆菌菌群鉴定和药物敏感性试验，评价Xpert MTB/RIF法检测MTB及其对利福平耐药的敏感性和特异性。
结果：MTB检出1323份，MTB未检出44份，RFP耐药基因检出87份；XpertMTB/RIF耐药位点以Probe E为主。
结论：Xpert MTB/RIF技术可快速检测MTB及其对利福平的耐药性，敏感性和特异性较好，具有较高的临床应用价值。
黔东南州疾病预防控制中心贵州黔东南 556000摘要：目的：探讨Xpert MTB/RIF技术在结核分枝杆菌（MTB）快速检测及利福平耐药检测在黔东南州16县（市）的应用价值，旨在为后续肺结核的诊断与治疗提供指导。
方法：收集我中心结核病实验室2022年1月至10月共1367份检测样本进行Xpert MTB/RIF检测，分析Xpert MTB/RIF法检测的敏感性和特异性。
将1367份培养阳性样本进行分枝杆菌菌群鉴定和药物敏感性试验，评价Xpert MTB/RIF法检测MTB及其对利福平耐药的敏感性和特异性。
结果：MTB检出1323份，MTB未检出44份，RFP耐药基因检出87份；XpertMTB/RIF耐药位点以Probe E为主。
结论：Xpert MTB/RIF技术可快速检测MTB及其对利福平的耐药性，敏感性和特异性较好，具有较高的临床应用价值。
利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法在结核病中的应用
利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法在结核病中的应用作者：辛宝林于秀坤来源：《中国实用医药》2016年第09期【摘要】目的探讨利福平和异烟肼耐药基因突变采用PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法的应用价值。
方法 88份送检的结核病患者临床标本，得结核分枝杆菌分离株64株，采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法进行检测，同时采用比例法检测，并以比例法为标准评价快速检测方法的诊断价值。
结果快速检测方法中对利福平耐药24份，仅对异烟肼耐药24份，对利福平和异烟肼均耐药22份，不耐药18份。
以耐药不耐药作为分割点，比例法药敏试验结果为参考标准，快速检测方法的灵敏度100.0%，特异度90.0%，准确度97.7%；两种检验方法一致性好（P>0.05）。
结论 PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法可在12 h内对利福平和异烟肼耐药基因突变的作出判断，与比例法药敏试验一致性好，可信度高，值得临床推广。
【关键词】利福平；异烟肼；耐药；基因突变；结核分枝杆菌；快速检测DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.09.115利福平和异烟肼是结核病的最重要的一线抗结核药物[1]。
近年来结核分枝杆菌基因突变发生耐药的情况也时有发生，世界卫生组织报道每年有新增48.9万例耐多药结核病，其总量占结核病患者的4.8%，而在我国则更为严重。
耐多药结核病的早期确诊有利于患者的病情控制，比例法药敏试验虽然结果可靠，且被公认为判断结核分枝杆菌耐药的金标准，但该方法需要细菌培养，耗时2～4个月，易贻误病情。
随着分子生物学的飞速发展，为结核分枝杆菌耐药性快速检测提供可能。
本中心采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法对送检的疑似耐药结核病患者临床标本进行检测，并将结果与比例法药敏试验进行分析，现报告如下。
1 材料与方法1. 1 材料取2013年10月～2015年5月送检的疑似耐药结核病患者临床标本88份，其中痰65份，肺泡灌洗23份。
耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用(一)(精)
耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用(一)【摘要】目的探讨耐多药结核病（MDR-TB）临床分离株rPOB、KatG 和rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值。
方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术分析了54株同时耐异烟肼（INH）、利福平（RFP）、链霉素（SM）的多耐药临床分离株和45株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变。
结果以结核分支杆菌H37RV为对照，45株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常，其特异性为100%；KatG基因有2株图谱异常，特异性为95.6%。
89株结核分支杆菌临床分离株均未发现rPOB、KatG、rpsL基因缺失，其PCR扩增产物SSCP分析结果表明：54株多耐药临床分离株中，49株rPOB基因图谱异常；32株KatG基因图谱异常；40株rpsL基因图谱异常。
其敏感性分别为rPOB(90.7%)、KatG(59.3%)，rpsL(74.1%)。
结论结核分支杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致。
PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的方法之一。
【关键词】结核分支杆菌；rPOB基因；KatG基因；rpsL基因；SSCP；药物耐受性Studies of Mycobacterium tuberculosis multi-drug resistant gene【Abstract】 Objective To eva luat the importance of rPOB、KatG and rpsL gene mutation detection in multi-drug resistant clinicalisolates of Mycobacterium tuberculosis. Methods rPOB、KatG and rpsL gene mutation of 54multi-drug resistant clinical isolates，which is INH RFP and Sm resistance and 54 drug susceptible strains were analyzed using polymerase chain reaction-single strand conformation (PCR-SSCP).Results SSCP pattern of H37RV strain as control，SSCP pattern of rPOB，rpsL PCR amplification from drug susceptible strains were all the same as control. The specificity was 100%. However，the different SSCP pattern of KatG gene were found in 2 susceptible strains. The specificity was 96.3%. Gene deletion of rPOB、KatG and rpsL were not found in all clinical isolates tested. SSCP patterns of rPOB gene were different from control in 49 drug resistant clinical isolates. SSCP patterns of KatG gene were different from control in 32drug resistant clinical isolates，SSCP pattern of rpsL gene were different from control in 40 drug resistant clinical isolates. The sensitivity were 90.1% (rPOB)，59.3% (KatG) and rpsl (74.1%)，respectively. Conclusion The major mechanism of RFP，INH，SMresistant drug was rPOB、KatG and rpsL gene mutation，respectively PCR-SSCP may be one of the way which applied to drug resistant detection of Mycobacterium tuberculosis.【Key words】 Mycobacterium tuberculosis；rPOB gene；KatG gene；rpsL gene；SSCP；drug tolerance我国是结核病疫情最严重的国家之一，其主要原因是耐药（DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病的广泛分布和迅速传播。
结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药性形成机制及药物敏感性检测技术研究进展
急剧恶 化 ］ 。 。可见 ， 结核 病仍 然是 严重 威胁 人 民生命 和健 康 的重要 公共 卫生问题 。快速准确检测结 核分枝 杆菌 的耐 药性 ， 即药物 敏感性检测 技术 ， 指导 临床 合理 用药 、 效控 制结 核 对 有 病 流行具有重要 意义。近年来 ， 随着 结核分枝 杆菌分 子遗传学
１ 结核分枝杆 菌耐药性形成机制
结核分枝杆菌对 临床 常用 的抗结 核一 线药 物包 括异 烟肼
（ ｏｉ ｉ， Ｈ 、 福 平 （ｉｍ ｉ， ） 吡 嗪 酰 胺 （ｙ ｚ ａ ｉ ， ｉ ｎａ ｄＩ ） 利 ｓ ｚ Ｎ ｒａ ｐ 肿 、 ｆ ｎ ｐｒ ｉ ｍｄ ａｎ ｅ
ＶＡ 、 Ｚ ）链霉 素（ｔ ｐ ｍ ｃ ， Ｍ） ｓｅｔ ｙｉ Ｓ 和乙胺 丁醇 （ｔ ｍ ｕ ｌＥ ） ｒ ｏ ｎ ｅ ａ ｂｔ ，ＭＢ 等 ｈ ｏ 均存在耐药现象 ， 至是 对多 种药 物 同时产 生耐 药的情 况 ， 甚 即 出现 Ｍ ＲＴ ， Ｄ －Ｂ是指结核病患 者排 出的结核分枝杆 菌对 Ｄ －Ｂ Ｍ Ｒ Ｔ 至少包括 ＩＨ和 Ｒ Ｐ在 内的 ２种 或 以上药 物产 生耐 药 。随 Ｎ Ｆ 着对结核分枝杆菌全基 因序列 的揭示 ， 以及 其耐药 性分子机 制 的深入研究 ， 目前对 Ｉ Ｈ、 Ｆ 、Ｍ、 Ｍ Ｎ Ｒ Ｐ Ｓ Ｅ Ｂ和 Ｐ Ａ的耐 药机 制已经 Ｚ
．
氢过氧化物还原酶 的 ａｐ ｈ Ｃ基 因（ｈＣ基 因涉及细菌 对氧化 压 ａｐ
力的反应 ）编码 ｐ酮酰基 载体 蛋 白合成 酶的 Ｋ ｓ ， ａＡ基 因及调 节 分枝 杆菌氧 化一 激反应 的 ｏｙ 应 ｘＲ基 因Ｅ 。ｋｔ ４ ａ ］ Ｇ基 因的变异 （ 包 括突变 、 缺失 、 插入等 ） 导致 的结 核 分枝 杆菌 触 酶． 氧 化物 酶 过 活性 降低或缺失 ， 可以解释 ９ ％以上 的 Ｉ Ｈ耐药 。ｉ Ａ基 因编 ０ Ｎ ｎ ｈ 码还 原型 烟酰胺 二核 苷酸 （ Ａ Ｈ） 赖 的 ｅｏｌ ｃ ＮＤ 依 ｎｙ ａｐ还原 酶 ， — 该 酶催化 △不饱 和脂肪 酸转化为饱和脂肪 酸的还 原反应 ， ＿ 参与分
耐多药结核病(MDR-TB)快速诊断
耐多药结核病使用分子遗传学方法，对来自纯培养物或肺部物质涂片阳性的标本进行结核分枝杆菌复合群及其对利福平和肺结核病的复发当肺结核病（以一个惊人的速度增长着。
世界上大约三分之一的人口感染了肺结核，每年大约有两百万人死于该病。
由于染率的逐年升高，非洲的分枝杆菌的感染率也在显著增加。
抗药性的发展除了全球肺结核感染率的提高外，我们也观察到菌株抗药性和多重抗药性的持续增长。
如果肺结核的病原体对利福平和异烟肼这两种最重要的治疗肺结核的药物不敏感了，这也就意味着其多重耐药性的出现。
虽然在德国预计的肺结核病原体耐药性的比例相对较低，但是有观察表明在过去的几年中分支杆菌的多重耐药性在缓慢增加。
然而在东欧的广大地区，抗药性的比例特别高。
由于地理上相对靠近，这对附近国家也就理所当然的是一个惊人的发展，毕竟这些多重耐药性的菌株的传播在未来几年里很有可能对这些临近国家的肺结核病的情况产生深远影响。
因此，为了保证快速和彻底的治疗，不仅要鉴定肺结核的感染与否，快速测定肺结核病原体的抗药性也变得越来越重要。
GenoTypeGenoType的病人肺部物质，性的安全和快速检测。
鉴定结核分枝杆菌复合体和其对利(MOTT)鉴定和区别公司的分支杆菌检测相关产品系列提供了最适宜的补充。
检测的样本可以是纯培养物或是涂片阳性的肺部物质标本。
内部控制保证了结果的GenoType®系列中的任何测试系统进行联合运用，只需要很低的技术要求，即使是小的实验室也能受益于高效、现代的诊断方技术的分析，通过手动或自动的方式，都可以轻易的与你平常的诊断结合起来。
如果需。
利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题研究
利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题研究近年来，结核病在全球范围内仍然是一个严重威胁健康的疾病。
结核病菌的耐药性增加已成为临床治疗挑战的重要因素之一。
其中，多药耐药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）所引起的公共卫生问题日益突出。
目前，利福平作为治疗耐药结核病的重要药物，其疗效的高低已成为全球耐药结核病治疗的研究热点之一。
首先，利福平治疗耐药结核病的疗效存在差异。
利福平是第一代环丙沙星衍生物，是MDR-TB治疗的关键药物之一。
在以利福平为基础的治疗方案中，治疗强度和疗程在国际范围内存在差异，这些差异可能会影响利福平的疗效和不良反应。
一些研究表明，在利福平治疗期间，病人是否遵守治疗方案，以及治疗期间的营养状况、药物代谢等因素，都会影响利福平的疗效。
其次，利福平的耐药机制尚未完全阐明。
MDR-TB是指对利福平和异烟肼两种核心抗结核药物耐药的结核菌株。
利福平的耐药机制可能与利福平的磷酸酸化或者其他药物代谢酶有关。
此外，研究人员发现，在MDR-TB菌株耐药机制中，流入和泵出的通道都对利福平的耐药性起到了作用。
但是，利福平耐药的机制仍未完全阐明，需要进一步的研究。
最后，利福平的安全性和耳毒性需要加强研究。
利福平的不良反应包括神经系统症状、视力障碍和耳毒性等。
其中，利福平导致的耳毒性成为制约利福平使用的主要因素之一。
研究表明，耳毒性可能与利福平在人体中的代谢率和药物浓度有关。
因此，需要进一步研究利福平耳毒性的机制，并寻找预防和控制耳毒性的方法。
综上所述，利福平在治疗耐药结核病中发挥着重要作用。
但是，利福平在治疗期间的疗效、耐药机制和安全性等方面还存在一些问题需要研究和解决。
只有更深入地了解利福平的药理学特征和耐药机制，才能更有效地利用利福平来治疗耐药结核病，并保证病人的安全。
结核分枝杆菌中利福平和异烟肼耐药相关基因突变与耐药水平的相关性研究
• 248 •中国防痨杂志2021 年3 月第43 卷第3 期Chin J Am itnberc，March 2021，V〇1. 43，No. 3 .论著•结核分枝杆菌中利福平和异烟肼耐药相关基因突变与耐药水平的相关性研究王希江谭云洪贺文从欧喜超刘东鑫赵雁林【摘要】目的探究结核分枝杆菌中利福平和异烟肼耐药基因突变谱的分布，为研发更为精准的耐药分子诊断技术和临床决策提供依据。
方法收集国家耐药监测点新疆维吾尔自治区柯坪县、岳普湖县和疏勒县193株和 湖南省怀化市、永顺县、祁东县、桃江县和耒阳市592株结核分枝杆菌。
采用微孔板法测定菌株的最小抑菌浓度(m in im u m in h ib ito ry c o n c e n tr a tio n，M IC)。
根据药物敏感性试验（简称“药敏试验”)结果选取利福平和异烟肼耐药菌株，经C T A B/N a C l法提取核酸后进行全基因组测序（w h o le g e n o m e s e q u e n c in g,W G S〉，将所得基因组原始序列过滤后上传至T B p r o f il e r分析工具以确定耐药基因型。
结果785株结核分枝杆菌中，124株（15.80%)为利福平 和(或)异烟肼耐药，包括利福平耐药74株，异烟肼耐药111株，耐多药61株(7. 77%)。
97. 22%(70/72)利福平耐药菌株检测出中出基因位点突变，其中98.57%(69/70)的突变位于利福平耐药决定区（R R I)R)，1株检测出R R D R区以外的与利福平耐药相关的罕见突变I49I F。
利福平耐药突变主要位于450、;'/^/} 445及rpoB 435 密码子，占8L43%(57/70),其中i'/wB S450L突变出现的频率最高（45. 71%，32/70),中必450位点突变对应高浓度利福平耐药452位点突变主要对应低浓度利福平耐药（M I C=2吨/m l)。
耐药结核分枝杆菌的分子流行病学研究及耐药相关基因的分子生物学快速检测
图２异烟肼耐药表型的分布㈥３利福平耐药表型的分布（－－）、我国耐药结核分枝杆菌耐药相关基因谱１．ＰＣＲ．ＲＦＬＰ检测结果１）菌株ＤＮＡ的抽提与鉴定通过ｋａｔＧ２１０ｂｐ基因片段的扩增，对抽提的４２９株结核分枝杆菌的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ鉴定，扩增产物经１．５％琼脂糖凝胶电泳，有４０７株可见单一清晰的目的条带（２１０ｂｐ，见图４），有２２株未见特异性条带。
１２３４５６Ｍ７－－－・－－－－－一７５０ｂｐ‘。
‘‘——５００ｂｐ－－－・－－——一２５０ｂｐ‘。
‘。
‘——１００ｂｐ图４结核分枝杆菌基因组ＤＮＡ的鉴定：Ｍ为ＤＮＡ分子量（ＤＬ２０００），１－６为临床分离株提取的基因组ＤＮＡ为模板扩增的阳性ｋａｔＧ基因目的片段，７为阴性对照。
２）ＰＣＲ—ＲＦＬＰ方法检测ｋａｔＧ基因３１５位点突变结果（见图５）ｋａｔＧ基因扩增阳性的４０７株菌株用于进行ＭｓｐＩ限制性内切酶的酶切消化及ＰＡＧＥ电泳。
如图５所示菌株２—３及５—９泳道中ＫａｔＧ基因被消化成三个片段（７９ｈｐ，５３ｂｐ，６６ｂｐ），为野生型。
１及４泳道的菌株ＤＮＡ在酶切消化后６６ｂｐ片段被一个更小的４８ｂｐ片段所代替，为Ｓ３１５Ｔ突变型。
３）ＲＦＬＰ方法检测ｋａｔＧ基因３１５位突变菌株的耐药谱在ｋａｔＧ基因ＰＣＲ扩增阳性的４０７株菌株中，有ＩＮＨ敏感株１９１株，均未发现３１５位突变。
ＩＮＨ耐药株２１６株，采用ＰＣＲ．ＲＦＬＰ方法发现６５｜３％（１４１／２１６）耐药株存在￥３１５Ｔ突变。
７９ｂｐ—－－－－－一５３ｂｐ．．，．．一４８ｂｐ‘。
’。
一一１１０ｂｐ－－－－－－－－一ｆｉ？ｂｐ一３４ｂｎ图５ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法检测结核分枝杆菌ｋａｔＧ基因３１５位点突变的ＰＡＧＥ电泳图谱：Ｍ．为ＤＮＡ分子量（ｐＵＣ１９ＤＮＡ／Ｍｓｐｌ（ＨｐａｉｄＭａｒｋｅｒ２３），１，４泳道为突变型菌株，２－３及５－８为野生型菌株。
２．ｋａｔＧ基因缺失的检测将以上２２株未见到有特异性条带扩增的菌株基因组ＤＮＡ用另一对引物进行ＰＣＲ反应扩增，结果其中有６株可以见到有单一清晰的目的条带（２７００ｂｐ），另外１４株仍然未见到特异性条带的扩增。
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利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法在结核病中的应用
摘要目的探讨利福平和异烟肼耐药基因突变采用PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法的应用价值。
方法88份送检的结核病患者临床标本，得结核分枝杆菌分离株64株，采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法进行检测，同时采用比例法检测，并以比例法为标准评价快速检测方法的诊断价值。
结果快速检测方法中对利福平耐药24份，仅对异烟肼耐药24份，对利福平和异烟肼均耐药22份，不耐药18份。
以耐药不耐药作为分割点，比例法药敏试验结果为参考标准，快速检测方法的灵敏度100.0%，特异度90.0%，准确度97.7%；两种检验方法一致性好（P>0.05）。
结论PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法可在12 h内对利福平和异烟肼耐药基因突变的作出判断，与比例法药敏试验一致性好，可信度高，值得临床推广。
关键词利福平；异烟肼；耐药；基因突变；结核分枝杆菌；快速检测
利福平和异烟肼是结核病的最重要的一线抗结核药物[1]。
近年来结核分枝杆菌基因突变发生耐药的情况也时有发生，世界卫生组织报道每年有新增48.9万例耐多药结核病，其总量占结核病患者的 4.8%，而在我国则更为严重。
耐多药结核病的早期确诊有利于患者的病情控制，比例法药敏试验虽然结果可靠，且被公认为判断结核分枝杆菌耐药的金标准，但该方法需要细菌培养，耗时2～4个月，易贻误病情。
随着分子生物学的飞速发展，为结核分枝杆菌耐药性快速检测提供可能。
本中心采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法对送检的疑似耐药结核病患者临床标本进行检测，并将结果与比例法药敏试验进行分析，现报告如下。
1 材料与方法
1. 1 材料取2013年10月～2015年5月送检的疑似耐药结核病患者临床标本88份，其中痰65份，肺泡灌洗23份。
1. 2 去污染处理将1～2倍于痰及肺泡灌洗液样本的4%NaOH放置于样本中，震荡混匀，静置20 min，再将pH=6.8的磷酸缓冲液加入样本中，3000 r/min离心1 min，沉淀后去除上清液，将1 ml磷酸缓冲液加入其中，混匀，获得去污染样本。
1. 3 方法
1. 3. 1 比例法药敏试验取适量去污染样本在酸性固体罗氏培养基上接种，在37℃温度下培养7 d，菌群鉴定采用齐-尼氏染色法，共得结核分枝杆菌分离株64株。
制备10-2 g/L和10-4 g/L菌悬液，各取0.01 ml采用划线法接种在含药培养基及对照培养基表面，37℃温度下培养4周，≤1%为敏感。
1. 3. 2 快速检测方法的建立采用PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法。
取去污染样本500 μl加入1.5 ml离心管，以5600 r/min的速度离心15 min 后去上清液，加入去离子水500 μl，再次以5600 r/min的速度离心15 min，沸水浴20 min，超声裂解15 min，取上清液5 μl为DNA模板。
采用BLAST软件对katG、inhA和rpoB基因合适的扩增区域进行引物扩增，其中katG基因2个探针，inhA基因2个探针，rpoB基因11个探针。
PCR扩增体系（引物1 μl，
2.5 mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷混合物4 μl，10×PCR缓冲液5 μl，MgCl2 3 μl，DNA聚合酶5.0 U，去离子水3 μl，提取的DNA模板5 μl）进行PCR扩增。
扩增条件：第一阶段：95℃15 min，95℃30 s，58℃ 2 min，10个循环；第二阶段：95℃25 s，53℃40 s，70℃40 s，30个循环；第三阶段：70℃8 min。
取20 μl PCR扩增产物加入杂交盘中，与20 μl变性裂解液混匀，室温静置5 min 后，加入1 ml杂交缓冲液，放入探针试条。
将杂交盘放入GTblot-20全自动杂交仪，杂交成功后取出试纸吸水纸干燥，判读。
1. 4 统计学方法采用SPSS19.0统计学软件处理数据。
计数资料以率（%）表示，采用χ2 检验。
P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
比例法药敏试验中仅对利福平耐药26份，仅对异烟肼耐药23份，对利福平和异烟肼均耐药19份，不耐药20份。
快速检测方法中对利福平耐药24份，仅对异烟肼耐药24份，对利福平和异烟肼均耐药22份，不耐药18份。
以耐药不耐药作为分割点，比例法药敏试验结果为参考标准，快速检测方法的灵敏度100.0%（68/68），特异度90.0%（18/20），准确度97.7%（86/88），两种检验方法一致性好（P=0.1573>0.05）。
3 讨论
目前，基于分子生物学研究的利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法包括实时PCR单链构象多态性分析、实时PCR熔解曲线法、噬菌体法、基因芯片法及PCR线性杂交酶显色法等，后两种方法应用最为广泛。
这些方法预测耐药表型均基于结核分枝杆菌的rpoB、katG和inhA基因特定区域或位点突变[2]。
约96%的利福平耐药性与rpoB突变相关，30%～60%的异烟肼耐药性与katG 基因突变相关，故上述基因区域可基本覆盖耐药基因突变情况，为检测技术的灵敏度和准确性提供保障。
PCR线性杂交酶显色法也可见于慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究[3]。
该技术应用于结核分枝杆菌的检测时，通过多重聚合酶链反应结合反向杂交技术，与固定在硝化纤维条带上的特异基因杂交[4]，显色判读。
在此过程中PCR扩增效果不受细菌存活量的影响、杂交后化学信号放大，是PCR线性杂交酶显色法的灵敏度高的主要原因。
本研究结果显示快速检测方法的灵敏度100.0%，特异度90.0%，准确度97.7%，结果与李大登等[5]报道一致。
本研究纳入为疑似耐药结核病患者，故耐药阳性检出率为77.27%（68/88），远高于其他报道的总耐药率29.14%[6]，符合事实。
此外，与比例法药敏试验相比，PCR线性杂交酶显色法成本更低，更利于在地市级结核病医院实验室应用[7]。
另外本研究中PCR线性杂交酶显色法整个操作过程≤6 h，可
做到当天送检当天出结果，符合快速检测的要求。
综上所述，采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法进行检测，与比例法药敏试验一致性好，可信度高，值得临床推广。
参考文献
[1] 欧维正，骆科文，王燕，等.基因芯片与比例法药敏性试验检测结核分支杆菌对利福平和异烟肼耐药性的比较研究.检验医学，2013，28（5）：404-407.
[2] 王峰，崔运勇，胡思玉，等.实时聚合酶链反应熔解曲线法快速检测耐多药结核分支杆菌.中华结核和呼吸杂志，2011，34（12）：888-893.
[3] 赖国旗，张文露，胡源，等.反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究.西南师范大学学报（自然科学版），2012，37（3）：113-119.
[4] 范齐文，吴文娟.结核病实验诊断技术.微生物与感染，2012，7（3）：190-196.
[5] 李大登，马俊，魏小妹. PCR-线性杂交酶显色法检测结核分枝杆菌耐药性效果分析.山东医药，2015，55（18）：75-76.
[6] 多丽娜，王婷婷，宋兴勃，等.分子线性探针技术分析四川地区结核分枝杆菌耐药情况.南方医科大学学报，2011，31（5）：822-824.
[7] 李强，夏辉，欧喜超，等.应用线性探针技术与传统药敏试验检测耐药结核病的成本比较.中国防痨杂志，2013，35（3）：187-190.。