实验一细菌基因组DNA的提取剖析
实验一 大肠杆菌基因组提取
实验一大肠杆菌基因组提取简介大肠杆菌(Escherichia coli)是一种常见的肠道菌，其基因组结构简单，可以用于实验室中的基因工程。
本实验将介绍如何从大肠杆菌中提取基因组DNA，并进行后续的测序和分析。
材料- 大肠杆菌菌株- SDS（1%）- NaCl(5M)- EDTA(0.5M)- 三氯乙酸(CTAB)细胞裂解缓冲液（含Tris-HCl,pH8.0、NaCl、CTAB和EDTA）- 氯仿- 异丙醇- TE缓冲液（pH8.0）- 75%酒精- 100%酒精步骤1. 建立大肠杆菌沙门氏菌联合培养通过将大肠杆菌菌株与沙门氏菌菌株联合培养，可以使大肠杆菌更具韧性，可以在更苛刻的条件下生存。
因此，在进行基因组提取前，可以将大肠杆菌与沙门氏菌一同培养。
具体步骤如下：1.1 从大肠杆菌与沙门氏菌培养基中选择处于对数生长期的菌株；1.2 筛选出同步菌种进行接吻结合；1.3 将大肠杆菌沙门氏菌接种于 LB 培养基中，进行生长，收集状态良好的菌落。
2. 细胞裂解收集培养的大肠菌细胞，经过洗涤后，加入细胞裂解缓冲液中。
在催化剂SDS的作用下，细胞质膜溶解，使DNA释放到缓冲液中。
2.1 用洗液洗细菌达到OD600为0.6时离心6000g， 10分钟；2.2 将上清液倒掉，沉淀用NaCl水洗涤后，离心6000g， 10分钟；2.3 将沉淀重悬于 Tris-HCl 缓冲液中，加入 SDS 、 NaCl和 EDTA，并在65℃下进行快速震荡混匀，直到完全均匀混合。
3. 蛋白酶和RNA酶的处理使用丙酮和氯仿的混合物沉淀DNA，过滤掉蛋白酶和RNA酶。
3.1 向上清液中加入等体积异丙醇，避免产生气泡，盖紧座析管盖，冰上静置10min 。
3.2 离心12000g 10min，弃取上清层。
将沉淀重悬于 TE 缓冲液中，加入20ug/ml RNase 处理，65℃将体系涡旋5min；3.3 加入等体积氯仿，振荡10min，然后离心12000g 10min ，弃取上清液。
基因组dna提取实验报告
基因组dna提取实验报告基因组 DNA 提取实验报告一、实验目的本次实验的主要目的是从不同的生物样本中提取高质量的基因组DNA，以便进行后续的分子生物学实验，如 PCR 扩增、基因测序等。
通过本次实验，掌握基因组 DNA 提取的基本原理和操作方法，了解影响 DNA 提取质量的因素，并对提取的 DNA 进行质量检测和分析。
二、实验原理基因组DNA 提取的基本原理是利用细胞裂解液破坏细胞膜和核膜，使细胞内的物质释放出来，然后通过蛋白酶 K 消化蛋白质，去除 RNA 等杂质，再利用酚/氯仿等有机溶剂抽提，将蛋白质、多糖等杂质去除，最后通过乙醇沉淀或异丙醇沉淀得到纯净的基因组 DNA。
三、实验材料与试剂（一）实验材料1、新鲜的动物组织（如肝脏、肌肉等）2、植物叶片3、细菌培养物（二）实验试剂1、细胞裂解液（含 TrisHCl、EDTA、NaCl、SDS 等）2、蛋白酶 K3、酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）4、无水乙醇5、 70%乙醇6、 RNA 酶 A7、 3M 醋酸钠（pH 52）8、 TE 缓冲液（10 mM TrisHCl，1 mM EDTA，pH 80）（三）实验仪器1、离心机2、移液器3、恒温水浴锅4、紫外分光光度计5、电泳仪及电泳槽四、实验步骤（一）动物组织基因组 DNA 提取1、取约 01g 新鲜的动物组织，放入 15ml 离心管中，加入 1ml 细胞裂解液，用剪刀将组织剪碎，然后在冰上放置 10min。
2、向离心管中加入20μl 蛋白酶 K（20mg/ml），充分混匀，在 55℃水浴锅中孵育过夜，直至组织完全消化。
3、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），轻轻颠倒离心管10min，使溶液充分混匀。
4、 12000rpm 离心 10min，将上清液转移到新的离心管中。
5、重复步骤 3 和 4 一次。
6、向上清液中加入 1/10 体积的 3M 醋酸钠（pH 52）和 2 倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒离心管，可见白色的 DNA 沉淀出现。
细菌基因组DNA的提取
二、实验原理
核酸制备的一般原则
分离纯化核酸总的原则： (1)应保证核酸一级结构的完整性 (2)排除其他分子的污染
核酸纯化应达到的要求： (1)核酸样品中不应该存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子： (2)其他生物大分子的污染应降低到最低程度 (3)排除其他核酸分子的污染
三、核酸制备的步骤
破碎细胞
提取 纯化
裂解液的制备 将DNA结合 加入漂洗液 加入洗脱
到吸附柱上
缓冲液
获得DNA 溶液
四、实验步骤
（1）取细菌培养液 1ml，10000r/min离心1min，尽量吸净上清。 （2）向菌体沉向管中加入20μl Proteinase K溶液，混匀。 （4）加入220μl缓冲溶液GB,振荡15s，70℃放置10min，溶液变清亮，简短离心去除管盖内壁的水珠。 （5）加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 （6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离 心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 （7）向吸附柱CB3中加入500μl缓冲溶液GD（使用前先检查是否加入无水乙醇），12000rpm离心 30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 （8）向吸附柱CB3中加入600μl 漂洗液PW（使用前先检查是否加入无水乙醇），12000rpm离心30s， 倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 （9）重复操作步骤8。 （10）将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数 分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 （11）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μlTE,室温放置 2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
实验一 基因组DNA的提取
六、操作步骤
1.5ml离心管中加入500μl提取缓冲液 离心管中加入500μl提取缓冲液, 1. 在1.5ml离心管中加入500μl提取缓冲液, 60℃水浴预热 水浴预热。 60℃水浴预热。 植物组织0.1g, 剪碎, 2. 植物组织0.1g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨 成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟 时间长,DNA产量高), 水浴保温30 分钟( ,DNA产量高 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不 时摇动。 时摇动。 加入500μl氯仿/戊醇/乙醇溶液, 500μl氯仿 3. 加入500μl氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混 需带手套, 防止损伤皮肤) 室温下静置5分钟, 匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀) 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
实验一、基因组DNA DNA的提取 实验一、基因组DNA的提取
一、实验目的： 实验目的： 1.了解真核生物基因组DNA提取 的一般原理。 2. 2.掌握DN理，是将分散好 的一般原理， 提取 的一般原理 的真核生物组织细胞在含SDS和蛋白酶 和蛋白酶K 的真核生物组织细胞在含 和蛋白酶 的溶液中消化分解蛋白质，再用酚： 的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：异戊 醇抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA 醇抽提的方法去除蛋白质，得到的 经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。 经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。
三、材料
植物组织
四、设备
移液器，冷冻高速离心机， 移液器，冷冻高速离心机，台式高速 离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心 离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心 管。
细菌基因组DNA的提取和鉴定
8.小心取出上清液用预冷两倍体积的无水乙 醇沉淀,15000r/min高速离心15min,离心弃 上清. 9.用400μL70％的乙醇洗涤两次. 10.真空干燥后,用50μLTE或超纯水溶解DNA, -20℃冰箱放置备用. 11.取两支试管,一支加入0.015mol/LNaCl5ml, 加入适量DNA样品和4ml的二苯胺,另一支
细菌基因组DNA的 提取与鉴定
实验目的
• 掌握细菌基因组DNA提取和鉴定的 原理 • 熟悉细菌基因组DNA提取和鉴定的 方法 • 了解细菌基因组DNA提取和鉴定的 意义
实验原理
• 提取原理 DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的 形式存在的,因此出脱氧核糖核蛋白复合物 后,必须将其中蛋白质去除。在碱性条件下， 用表面活性剂SDS将细菌细胞壁破裂，然 后用高浓度的NaCl沉淀蛋白质等杂质，经 过氯仿抽提进一步去掉蛋白质等杂质，经 乙醇沉淀，得到较纯的的总DNA.
试管ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ加入0.015mol/LNaCl5ml和4ml的二 苯胺 12.对两管进行水浴加热5-10min,对比两管现 象,记录实验结果. 注：裂解缓冲液（40mmol/LTris-HCl，pH 20mmol/L乙酸钠,1mmol/LEDTA,1％SDS） TE缓冲液（10mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA-Na2（pH8.0））
• 鉴定原理 DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因 此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
实验方法
1.菌体培养：接种供试菌于LB液体培养基， 37℃振荡培养16-18h，获得足够的菌体。 2.菌体收集：取1.5mL培养液于1.5mL离心管 中,12000r/min离心30s,弃上清,收集菌体. 3.辅助裂解:如果是G+菌（革兰氏阳性杆菌）, 应先加溶菌酶100μg/mL50μL.37℃处理1h. 4.裂解:向每管加入200μL裂解缓冲液,用吸管 头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞.
细菌基因组DNA的提取
四、注意事项——核酸分离、纯化
四、注意事项——核酸沉淀、溶解
当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
原因
02
材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融
尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融
01
小心吸出上清液转入新的eppendorf管，用预冷的两倍体积的无水乙醇沉淀，放置－20℃冰箱30min，然后13000rpm离心15min，可见白色丝状沉淀物。
02
小心吸出液体，弃上清液，用预冷的400µl 70％乙醇洗涤2次，室温干燥后，用50µlTE （含20µg/ml的Rnase）溶解DNA，－20℃冰箱放置备用。
核酸制备的步骤： 破碎细胞
01
一、实验原理
核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。
细菌基因组DNA的提取
菌体培养
37 ℃、16— 18h
菌体收集
200μL裂解缓冲液
12000r/min、 30s
弃上清液
12000r/min，10加Tris饱和苯 酚
混匀
12000rmin，3min
取水层加氯仿
混匀12000r/min、3min 取上层清液加 12000r/min、3min 无水乙醇
沉淀加400μL
弃上清 70%乙醇
洗两次
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真空干燥 溶解 DNA
-20 ℃ 冰箱
五、实验注意事项
1、材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少 ，纯度低。
2、采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动 作要轻柔。
3、离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。
4、沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 。
灭菌
6、将DNA分装保存于缓冲液中，避免
反复冻融
10 10
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七、问题与讨论
1、简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因。
酚氯仿抽提DNA后，会使溶液分层，上层为水相，含有
DNA；中间为蛋白（有时看不到）；下层为有机相。原因是 酚
氯仿可以使蛋白质变性，从而从溶液中析出，但是蛋白密度 会小于酚氯仿，所以离心后它分布在中间；而DNA溶于水而不
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（5）1%SDS（十二烷基硫酸钠）：1gSDS溶于100ml
蒸馏水，灭菌后-4℃保存
（6）mol/LNaCl：称取292.5gNaCl，溶于1000ml蒸馏 水，灭 菌后-4℃保存。
（7）无水乙醇及70%乙醇
（8）超纯水
（9）TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl， 1mmol/LEDTA-Na2（pH：8.0）
分子生物学实验
实验一基因组DNA的提取1.实验目的：基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。
通过本实验熟悉不同生物的基因组DNA提取原理和方法，并具备根据不同材料调整提取液成分以获得高质量DNA的能力。
2.实验原理利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。
加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。
在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。
一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。
而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。
在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。
尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
材料植物愈伤组织，真菌菌丝，细菌培养液。
设备微量移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml 和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。
试剂1.尿素提取液(7 mol /L Urea、50 mm ol /L Tris-HC l pH 8.0、62.5mmol /L NaCl、1% SDS )2.CTAB 提取液( 0.1 m ol /L Tris.HCl pH 7.5、1.5% CTAB、0.7 m o l /L NaCl、10 mm ol /LED TA) ，用前加入1%β-巯基乙醇3.CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。
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三、操作步骤
1、细菌 37℃ 过夜培养，取1ml培养物 12000rpm 室温离心 1min。
2、沉淀物加入180ul TE缓冲液，充分重悬细菌；再加入20ul 50mg/ml溶菌酶，混匀后于 30℃温育10min。 3、12000rpm 离心 5min, 弃上清后加入200 ul Buffer BTL，漩涡震荡悬浮细胞。 4、加入25ul 蛋白酶K溶液，振荡器混匀，于55℃温育30min，每隔10min 漩涡震荡一次。 5、加入220ul Buffer BDL，颠倒混匀，于65℃温育10min。 6、加入220ul 无水乙醇，以最大速度漩涡震荡20s。 7、转移样品至DNA 纯化柱中，纯化柱下端安装2ml收集管,12000rpm离心1min使DNA结 合在纯化柱上，弃去收集管。 8、将DNA纯化柱安装到新的2ml收集管中，加入500ul Buffer HB，12000rpm离心1min， 弃去滤液。
四、注意事项——材料准备
最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
四、注意事项——细胞裂解
材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量 少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： • 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡
2、核酸制备的一般原则
分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在有机溶剂和过高浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。
核酸制备的步骤：
破碎细胞
提取
纯化
核酸提取的一般过程
细胞破碎 机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 DNA提取 SDS（十二烷基硫酸钠 ）法 ：SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与 蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵 ）法 ：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可 以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质 变性，使DNA与蛋白质分离。 DNA纯化（去杂质） 蛋白质： 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1） 抽提。 RNA ：常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质： 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖： 提取液中加1％PVP。
9、DNA纯化柱中加入700ul DNA Wash Buffer，12000rpm离心1min，弃去滤液。
10、重复步骤9一次。12000rpm离心2min，干燥DNA纯化柱。 11、将DNA纯化柱转移至1.5ml EP管中，加入50ul 预热（65℃）的Elution Buffer, 室温放 置3min，12000rpm离心1min。
细菌基因组DNA的提取
一、实DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA， 如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA （cpDNA），质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和 噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
核酸样品的保存
温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存 保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
二、材料、设备及试剂
菌种 ：大肠杆菌DH5α 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器，水浴锅（ 37℃ 、60 ℃ ） 试剂：LB液体培养基 、无水乙醇、细菌基因组DNA提取试剂 盒。