禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法山东标准2020版
禽腺病毒的结构及其血清4型检测方法研究进展
禽腺病毒的结构及其血清4型检测方法研究进展
王凯莉;刘成;楚肖冉;司振书;路建彪;李玉保;曹胜亮
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2023(44)1
【摘要】近年来,由血清4型禽腺病毒引起的肝炎-心包积液综合征给养禽业带来严重的经济损失,该病毒的主要结构蛋白有六邻体、纤突和五邻体,可通过琼脂胶聚免疫扩散试验(AGIDT)、聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等进行诊断,其中聚合酶链反应是最常用的分子生物学诊断方法;血清学检测方法中将禽腺病毒重组蛋白作为包被抗原建立的ELISA方法最为常用。
论文对禽腺病毒基因组和蛋白结构及FAdV-4检测方法进行了综述,以期为该病的快速检测及科学防控提供理论和技术支持。
【总页数】6页(P111-116)
【作者】王凯莉;刘成;楚肖冉;司振书;路建彪;李玉保;曹胜亮
【作者单位】聊城大学农学院
【正文语种】中文
【中图分类】S852.659.1;S852.657
【相关文献】
1.Ⅰ群禽腺病毒血清4型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
2.禽腺病毒血清4型纳米PCR检测方法的建立与初步应用
3.禽腺病毒血清4型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用
4.血清4型禽腺病毒POCT荧光微
球免疫层析检测方法的建立5.禽腺病毒血清4型SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用
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一种检测禽腺病毒血清4型的引物组、试剂盒及其检测方法与应用[发明专利]
![一种检测禽腺病毒血清4型的引物组、试剂盒及其检测方法与应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/c07b4a841eb91a37f0115c24.png)
专利名称：一种检测禽腺病毒血清4型的引物组、试剂盒及其检测方法与应用
专利类型：发明专利
发明人：王红宁,翟熙雯,雷昌伟,梅雪然,吴暄
申请号：CN201910430677.1
申请日：20190522
公开号：CN110042176A
公开日：
20190723
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种检测禽腺病毒血清4型的引物组、试剂盒及其检测方法与应用，所述引物组包括外引物和内引物，其中外引物为F3和B3，内引物为FIP和BIP，所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述FIP为5端生物素标记的序列，所述BIP为5端异硫氰酸荧光素标记的序列。
本发明结合环介导等温扩增技术与横向流动试纸条技术，针对FAdV‑4重要的因子52k基因设计一套引物，建立FAdV‑4的LAMP‑LFD快速检测技术，本发明提供的LAMP‑LFD试剂盒操作简便，安全可靠、灵敏高效、特异性好，特别适合于现场快速可视化检测。
申请人：四川大学
地址：610000 四川省成都市一环路南一段24号
国籍：CN
代理机构：成都顶峰专利事务所(普通合伙)
代理人：王霞
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Ⅰ群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立
Ⅰ群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立张启龙;孙丹;韦海涛;宋彦军;周德刚;冯小宇;王林【摘要】利用纯化的Ⅰ 群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了Ⅰ 群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法.结果显示,抗原最佳包被浓度为1μg/mL;最佳封闭液为1％牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60 min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60 min;最佳显色时间为10 min.用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2019(053)008【总页数】7页(P1-7)【关键词】Ⅰ群禽腺病毒4型;Hexon蛋白;间接ELISA;检测【作者】张启龙;孙丹;韦海涛;宋彦军;周德刚;冯小宇;王林【作者单位】北京市动物疫病预防控制中心,北京 102629;北京市兽药监察所,北京102629;北京市动物疫病预防控制中心,北京 102629;北京市动物疫病预防控制中心,北京 102629;北京市动物疫病预防控制中心,北京 102629;北京市动物疫病预防控制中心,北京 102629;北京市动物疫病预防控制中心,北京 102629【正文语种】中文【中图分类】S852.65肝炎-心包积液综合征(Hepatitis and hydropericardium syndrome，HHS)是由禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4)新基因型引起的以禽心包积液、肝脏黄染、肿大和出血为特征的传染病[1]。
HHS首次于1987年在巴基斯坦的安卡拉地区发生，又名安卡拉病，随后在亚洲、欧洲和南美洲等地区流行[2-4]。
2013年以来该病在我国河南、山东、江苏、河北、陕西等地大面积流行，给家禽养殖业造成了巨大经济损失[5-7]。
《中国药典》2020版—禽源性病毒荧光定量 PCR(Q-PCR)检查法
禽源性病毒荧光定量PCR（Q-PCR）检查法本法适用于禽源性生物制品的检测，包括流感全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗种子批毒种的外源性禽病毒检测。
本法用提取的供试品RNA，反转录成cDNA后，或用提取的供试品DNA，针对3种外源性禽病毒设计特异性引物探针，进行荧光定量PCR 检测特异性扩增信号，从而测定供试品中外源性禽源病毒核酸序列，以检查供试品的外源性禽病毒污染。
要求检测的 3 种禽源性病毒：（1）禽腺病毒I 型（DNA 病毒）（2）禽腺病毒III 型（DNA 病毒）（3）外源性禽白血病病毒（逆转录病毒）试剂（1）RNA/DNA 提取试剂：RNA/DNA 的提取可使用酚-氯仿法、磁珠法、离心柱法等。
提取试剂中应含裂解液、洗涤液、洗脱液等，按试剂说明书要求配制。
（2）反转录试剂：含逆转录酶、RNA 酶抑制剂、dNTP 混合液、随机引物、逆转录反应缓冲液等，按试剂说明书要求配制。
（3）引物序列、探针序列见表1。
表 1 引物序列及探针序列（4）扩增缓冲液每20µl 反应体系中，含有上下游引物各5µmol，探针2.5µmol及适量荧光定量PCR混合液（Mix）。
（5）质粒标准品稀释液为DNA 稀释缓冲液或无RNA 酶水稀释。
（6）对照溶液以失活后无感染性的禽源性病毒为阳性对照。
以无RNA 酶水作为阴性对照。
提取核酸和逆转录步骤同（1），置-70℃保存备用。
（7）质粒标准品溶液及灵敏度供试品的制备选择病毒目的核酸序列，人工合成DNA，目的序列转入pMD19-T 质粒中，作为质粒标准品。
测定质粒标准品的DNA 核酸浓度后，对其进行10 倍稀释，从109Copies/µl 稀释至100Copies/µl。
取107Copies/µl～103Copies/µl 质粒标准品溶液作标准曲线各点。
101Copies/µl 稀释度作为灵敏度对照。
Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体实验室产品制备
Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体实验室产品制备于洪涛;赵丽;王昊【摘要】试验应用自行分离鉴定的Ⅰ群4型禽腺病毒HY株,制备了3批Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体,并进行了性状、装量、无菌、支原体、外源病毒、安全、效力、甲醛和辛酸残留量检测.试验结果表明,试制的3批卵黄抗体呈淡黄色澄明液体;装量符合规定标准要求;无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染,安全性好,预防效果好.【期刊名称】《饲料博览》【年(卷),期】2018(000)001【总页数】5页(P36-40)【关键词】卵黄抗体;实验室产品【作者】于洪涛;赵丽;王昊【作者单位】哈药集团生物疫苗有限公司,哈尔滨150069;哈药集团生物疫苗有限公司,哈尔滨150069;哈药集团生物疫苗有限公司,哈尔滨150069【正文语种】中文【中图分类】S852.65;S83腺病毒是全球家禽和野禽常见的传染病原之一[1-3]。
多数腺病毒可在健康禽体内存在并复制，不表现临床症状或临床症状非常轻微，但可成为混合感染时的条件性病原；腺病毒有时也可作为原发性病原，引起禽类的多种病症[4-6]。
腺病毒可分为A、B、C、D、E 5个种12个血清型，我国主要流行A、B、C 3种基因型，共6个血清型（火鸡1型、1型、4型、5型、8a/b型），但是近期在豫南、皖北、苏北、鲁西北和胶东地区流行的禽腺病毒主要是血清4型和8a/b型，造成鸡群的死亡率较高，并且发病急，有蔓延的趋势。
安卡拉病（心包积水-肝炎综合征）就是由Ⅰ群腺病毒，血清4型引起来的。
该病多发于肉鸡，近期也开始感染麻鸡以及产蛋鸡的育成鸡，并且育成鸡发病死亡率还非常高。
Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型交叉保护性较差，因此在防控上必须选用与流行株匹配的疫苗株和卵黄抗体才能有效遏制疫情的蔓延。
并目前市场上没有商品化的疫苗或卵黄抗体，我公司通过自行分离的Ⅰ群4型禽腺病毒HY株，制备免疫原免疫蛋鸡，制备了3批Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体实验室制品，并且经过检验，该3批制品有较好的安全性及效力，为公司下一步申报该产品的新兽药注册证书奠定基础。
DB13_T2593-2017禽腺病毒4型PCR检测方法
ICS11.220B 43 DB13 河北省地方标准DB13/T 2593—2017 禽腺病毒4型PCR检测方法2017-11-22发布2017-12-22实施前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由河北农业大学提出。
本标准起草单位：河北农业大学。
本标准主要起草人：袁万哲、王建昌、孙继国、刘聚祥、李丽敏、陈立功、李睿文、张磊、白云、陈赛娟、李杰峰。
禽腺病毒4型PCR检测方法1 范围本标准规定了禽腺病毒4型PCR检测方法的技术要求。
本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽腺病毒4型。
2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
2.1DNA脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）2.2EB溴化乙锭（ethidium bromide）2.3PCR聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）2.4dNTP脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）3 试剂或材料包括各种市售病毒核酸提取试剂盒，1.0%琼脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭（EB，10 ug/μL）或核酸染料，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，DNA分子量标准（100 bp），2×Taq MasterMix 或商品化的一步法PCR反应试剂。
警示:电泳中用到的EB在操作中应戴手套和口罩。
试验中被EB污染的物品要进行无害化处理；DEPC 在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。
3.1 病毒核酸提取试剂盒。
3.2 1.0 %琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。
3.3 50×TAE缓冲液，配制方法见附录A中A.2。
3.4 溴化乙锭（EB，10 ug/μL）或核酸染料，配制方法见附录A中A.3。
3.5 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，配制方法见附录A中A.4。
禽Ⅰ群腺病毒血清4型感染的诊断与防治
图1 病死鸡心包积液、肝色浅质脆、肿大充血二、病理剖检病变IBH 特征性病理剖检变化表现在肝脏和骨髓。
肝脏肿大，边缘钝圆，表面有不同程度的出血点或条索状出血斑，质脆，褪色，呈淡黄色，胆囊充盈，内有大量胆汁淤积。
偶尔可见肝脏有大小不一的坏死灶，并伴随血细胞浸润，使肝脏触之有凹凸不平的感觉。
骨髓呈灰白色或黄色胶冻样病变、体积变小，法氏囊萎缩，内膜有出血点或出血斑，且切面无光泽。
胸腺点状出血、萎缩、且颜色变深。
脾脏体积变化不大，偶见个别病例脾脏肿大、出血。
肾脏呈灰白色、肿大，表面有癖斑和疲点。
肺充血、水肿，除此之外，可见大腿部肌肉、胸肌以及皮下组织图2 病死鸡的心、肝、法氏囊、肾、脾、肺病理切片四、实验室诊断1.引物的设计合成。
根据 GenBank 中已发表的Ⅰ群禽腺病毒 Hexon 基因核酸序列设计完成两对引物，预计扩增片段为500 bp。
上游引物为P1: 5'CGAGGTCTATACCAACACG-AGCA-3';下游引物为P2: 5'-CGGCGCAGG TTAA-TGAAGTTATC-3'。
引物由吉林库美生物工程技术有限公司合成。
2.病毒分离与鉴定。
取疑似鸡包涵体肝炎病鸡的肝脏剪碎，按 1∶5（W/V）比例加入灭菌PBS进行匀浆处理，将匀浆液反复冻融 3次，4 000 r/min离心30 min，取上清液备用。
上清液中加双抗（青霉素、链霉素）各3 000 U/ml，置4℃过夜，以8 000 r/min离心10 min，取制备的上清液以卵黄囊途径接种5日龄SPF 鸡胚，0.2 ml/胚，于 37℃孵育，每日观察2次，收获 24～144 h内死亡的鸡胚尿囊液，收集死胚尿囊液，进行HA试验及PCR鉴定。
3.病毒DNA的提取及PCR扩增。
病毒液采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA DNA Extraction Kit Ver.5.0 提取试剂盒，按说明书进行病毒DNA的提取。
血清4型禽腺病毒研究进展
血清4型禽腺病毒研究进展朱庆贺;张鹏宇;王观悦;王爽;陈曦;杨旭东;史同瑞【摘要】近年来,血清4型禽腺病毒( FAdV-4)在我国爆发,造成家禽行业严重的经济损失.病毒感染引起死亡率高,临床剖检可见明显的心包积液综合征的症状.病毒极具传染性,可垂直及水平传播,通过受感染肝脏组织匀浆可以分离和检测病毒.目前实验室诊断主要通过琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验、限制酶分析、聚合酶链式反应、实时荧光定量PCR、高分辨率的融化曲线分析等进行检测.疾病预防主要通过灭活疫苗的接种,而减毒活疫苗和亚单位疫苗也相继被开发.对FAdV-4的流行病学、发病特征、病毒诊断方法以及预防策略等方面进行了综述,以期为FAdV-4的深入研究奠定基础.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2018(052)011【总页数】6页(P80-85)【关键词】4型禽腺病毒;流行;诊断;疫苗【作者】朱庆贺;张鹏宇;王观悦;王爽;陈曦;杨旭东;史同瑞【作者单位】黑龙江省兽医科学研究所,黑龙江齐齐哈尔161000;黑龙江八一农垦大学,黑龙江大庆163000;黑龙江省兽医科学研究所,黑龙江齐齐哈尔161000;黑龙江省兽医科学研究所,黑龙江齐齐哈尔161000;黑龙江省兽医科学研究所,黑龙江齐齐哈尔161000;黑龙江省兽医科学研究所,黑龙江齐齐哈尔161000;黑龙江省兽医科学研究所,黑龙江齐齐哈尔161000【正文语种】中文【中图分类】S852.654型禽腺病毒（Fowl avianadenovirus serotype 4，FAdV-4）主要是以心包积水为主要临床症状的鸡急性传染病，临床中又称为“鸡心包积水综合征（Hydropericardium syndrome，HPS）”。
该病发病急，传播速度快，主要引起4～8周龄肉鸡感染，死亡率可达40%～90%。
该病最早于巴基斯坦的安卡拉被报道，由此又成为“安卡拉病”。
近年来，我国河南、山东、安徽、辽宁、吉林、江西和湖北等省份出现大面积爆发，给我国养鸡业造成了严重的经济损失。
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禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法
1 范围
本标准规定了禽腺病毒4型（FAdV-4）荧光定量PCR检测方法。
本标准适用于鸡咽喉和泄殖腔拭子及肝脏组织中FAdV-4的检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 试验原理
实时荧光定量PCR检测是在PCR反应体系中，除采用特异的引物外，还加入了与DNA双链非特异性结合的SYBR Green I荧光染料。
当它与DNA双链结合时，发出荧光，从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。
随着PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
4 试剂或材料
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1 10×磷酸盐缓冲液PBS：pH值7.2。
4.2 研钵。
4.3 病毒DNA提取试剂盒。
4.4 SYBR Green I qPCR混合物。
4.5 阳性对照：浓度为1.0×105拷贝/μL的阳性质粒。
4.6 阴性对照：水。
4.7 DEPC水。
5 仪器设备
5.1 微量可调移液器：最大量程为10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。
5.2 台式低温高速离心机：最高转速16 000 r/min。
5.3 分析天平：精度为0.01 g。
5.4 荧光定量PCR仪：温度范围4.0 ℃～99.9 ℃。
5.5 冰箱：规格为4 ℃和-20 ℃。
5.6 二级生物安全柜。
6 引物
P1：5’- GTCTATACCAACACGAGCACC-3’
P2：5’-TTTTGTACCCGTCGCAGAG-3’
7 样品
7.1 采集工具
棉拭子，剪刀，镊子，1.5 mL离心管。
7.2 样品采集
7.2.1 咽喉拭子/泄殖腔拭子
7.2.1.1 咽喉拭子采样：将棉拭子深入喉头来回刮3次，取咽喉分泌液，放于含抗生素（青霉素2 000 U/mL+链霉素2 mg/mL）的10×磷酸盐缓冲液PBS（pH值7.2）的1.5 mL离心管中。
7.2.1.2 泄殖腔拭子采样：将棉拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便（需有可见粪便），放于含抗生素（青霉素10 000 U/mL+链霉素10 mg/mL）的PBS中。
7.2.2 组织样品
待检禽无菌采集整个肝脏，装入一次性采样袋或其他灭菌容器，编号。
7.3 样品运输与保存
样品放于保温箱中加冰，密封，24 h内送至实验室，如不能立即检测，需将样品放于-20 ℃冰箱保存。
7.4 样品处理
7.4.1 咽喉拭子/泄殖腔拭子
将装有咽喉拭子/泄殖腔拭子的1.5 mL离心管在振荡器上充分混合后，取出棉拭子，4 ℃条件下5 000 r/min离心10 min，取上清液转入新的1.5 mL离心管中，编号备用。
7.4.2 组织样品
将组织置于灭菌的研钵中，按照质量体积比（1：5～10）加入灭菌PBS进行充分研磨，4 ℃条件下5 000 r/min离心10 min，取上清液转入新的1.5 mL离心管中，编号备用。
8 试验步骤
8.1 病毒DNA提取
用病毒DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取待检样品的DNA。
病毒DNA提取成功后置于-20 ℃保存备用。
8.2 荧光定量PCR反应体系
详见表1。
表1 荧光定量PCR反应体系
每次均应设阴性对照。
* 内含DNA聚合酶，dNTP Mixture，Mg2+和荧光染料SYBR Green。
8.3 荧光定量PCR反应程序设定
详见表2。
表2 荧光定量PCR反应程序设定
9 结果判定
9.1 结果分析条件设定
阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。
9.2 试验成立条件
9.2.1 阴性对照无Ct（或Cp）值并且无扩增曲线。
（参见附录A.1）
9.2.2 阳性对照Ct（或Cp）值≤35，并出现特定扩增曲线。
（参见附录A.2）
9.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此试验视为无效。
9.3 结果描述及判定
9.3.1 阴性
无Ct（或Cp）值并且无扩增曲线，表明样品中无FAdV-4。
9.3.2 阳性。