绿色荧光蛋白的结构、发光机制及其应用研究
绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白GFP的研究与应用摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一种极具潜力的标记物，有着广泛的应用前景。
通过阅读吴沛桥的《绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用》这篇文献，对GFP有了进一步了解。
关键词：绿色荧光蛋白（GFP）；性质；原理；应用1 引言发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象，一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。
1962 年,Shimomura 等从维多利亚多管水母（Aequoria victoria）中分离纯化生物发光蛋白质——水母蛋白, 并观察到一个在紫外光下发出“非常明亮, 浅绿色荧光”的副产物。
1974 年,Shimomura等纯化得到了这种自发荧光的蛋白（即GFP）。
2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予日裔美国科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁·查尔非(Mratin Chalfie)以及美国华裔科学家钱永健(Rorge Y.Tsien)，他们三人因为在绿色荧光蛋白的发现以及改造方面做出了突出成就。
2 GFP的理化性质从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。
GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。
GFP性质极其稳定，耐高温，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。
其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。
更重要的是，它们在pH7.0~pH12.2的范围内的吸收、发射光谱也是相同的。
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）是一种从水母Aequorea victoria中分离出来的荧光蛋白质，可以发射绿色荧光。
由于GFP具有结构简单，对细胞无毒性和较强稳定性等特点，因此被广泛应用于细胞生物学和生命科学研究中。
以下是关于GFP及其在细胞生物学研究中的应用的介绍。
一、荧光蛋白及GFP的来源荧光蛋白质是一种含有环状芳香族氨基酸残基的蛋白质，能够吸收外部能量并将其转化为荧光发射。
GFP最初是在1955年，美国南加州大学的Osamu Shimomura研究水母发光机制时发现的。
GFP由238个氨基酸组成，分子量约27kDa。
GFP基因被克隆后即可在其他生物中表达，使它成为了生物体内最常用的荧光标记物之一。
二、GFP的结构和原理GFP的荧光由3个氨基酸残基Tyr（酪氨酸）、Ser（丝氨酸）和Gly（甘氨酸）构成的环状结构决定。
当氧气与Tyr形成共轭键时，便使荧光激发能量被吸收，并在GFP分子腔内缓慢扩散，直至荧光发射。
三、GFP在细胞生物学中的应用1、荧光定位GFP被广泛用于生命科学中细胞定位的研究。
由于GFP具有细胞膜透性和结构稳定性等特性，可以将其组装到生物体内，使其具有明亮的绿色荧光。
通过转化所需的基因序列来表达GFP，可以使研究人员直接在活细胞中观察到融合GFP蛋白质的定位和空间分布状况。
2、蛋白质交互作用GFP也被用作蛋白质交互作用的研究工具。
在这种情况下，GFP被连接到研究的蛋白质上，而研究人员观察到GFP与其他蛋白质结合的情况，从而确定蛋白质之间是否相互作用。
3、表达和异常行为GFP还可用于研究蛋白质的表达和异常行为。
通过表达GFP基因，可以探究研究对象的分泌情况、活动状态、质量控制和分解情况等。
4、细胞轨迹追踪GFP被广泛应用于细胞追踪研究中。
通过转染GFP基因，可以实时跟踪特定细胞类型的运动和位置，比如细胞分裂、游走和迁移等。
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学中的应用
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学中的应用绿色荧光蛋白(GFP)是生物学中非常著名的一个标记蛋白，它可以帮助科学家们观察、追踪细胞内部分子的运动和位置变化。
本文将介绍GFP的结构、功能以及在细胞生物学中的应用。
GFP结构与功能GFP来自于海葵(海洋无脊椎动物)中的一种发光蛋白，它的结构中含有一个环状结构(环状柄)和一个β桶(β-barrel)。
环状柄中含有一个色素分子，称为染料环，贡献了GFP的光学特性。
β桶的作用是保护染料环，并使它的光学特性达到最佳状态。
GFP有着非常特殊的性质，它可以在自然光下发出荧光，荧光颜色为绿色。
当其暴露在213-488nm的紫外线照射下，GFP就会发射从蓝、绿到黄的荧光波长。
GFP的这种特性使得它成为了生物学家们进行光学研究的最佳工具。
1. 显微镜下的成像GFP是一种非常强的标记蛋白，通过将其融合到目标物分子上，可以非常清晰地显示该分子的位置和运动。
利用显微镜技术，研究人员可以观察到细胞器、蛋白质、RNA等生命大分子在细胞内的运动和相互作用，从而揭示其在生物学中的重要作用。
2. 基因表达与细胞注释通过将GFP基因转染到细胞中，可以实现在特定细胞和组织中进行特定基因的表达。
同时，在转染GFP的细胞中，人们也可以通过显微镜监测到特定细胞的位置和分布，用于细胞的标记与识别。
3. 胚胎发育研究GFP还可以用于观察和研究胚胎发育过程中各种细胞分子的运动和定位。
通过将GFP融合到发育过程中的标志性分子中，研究人员可以观察到该分子在胚胎发育的不同阶段中的表达和变化，从而揭示胚胎发育的机制。
总结GFP的发现和应用开创了一种全新的标记技术，使科学家们能够更深入地探究生命大分子的运动、位置和相互作用。
GFP的强烈荧光使得其在细胞生物学研究中具有广泛的应用价值，特别是在显微镜下的成像、基因表达与细胞注释以及胚胎发育研究中。
可以预见，在不久的将来，GFP的应用将会更加广泛，并将继续推动生命科学研究的进步。
gfp的应用原理步骤
gfp的应用原理步骤1. 简介GFP（Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白）是一种来自于蓝绿色发光苔藓（Aequorea victoria）的一种蛋白质，它能发出绿色荧光。
GFP在生物领域具有广泛的应用，特别是作为荧光标记的工具，用来研究细胞生物学和生物化学等方面的问题。
本文将介绍GFP的应用原理步骤。
2. GFP的应用原理GFP的应用主要基于其特殊的结构和发光机制。
GFP的分子结构中包含一个环状的花青质染色体，通过紫外线或蓝光激发后，花青质染色体接受能量并发出绿色荧光。
GFP的应用原理步骤可以大致归纳为以下几个方面：2.1. GFP的基因表达与转染要应用GFP进行生物学研究，首先需要将GFP的基因导入到待研究的目标细胞中。
通常使用基因转染技术，将GFP基因导入细胞质或细胞核中，并使其被目标细胞所表达。
2.2. GFP的定位与追踪一旦GFP基因在目标细胞内表达成功，GFP蛋白质将被合成并定位在细胞的特定位置。
通过显微镜观察，可以实时追踪GFP蛋白的定位，揭示细胞器、细胞结构以及其他目标的位置和形态。
2.3. GFP的功能分析GFP的应用不仅仅局限于细胞定位的研究，还可以用于功能分析。
通过将GFP 蛋白与其他感兴趣的蛋白质进行融合，可以观察到蛋白质在细胞内的表达和功能活性，从而研究蛋白质的功能和相互作用。
2.4. GFP的动力学分析还可以利用GFP技术进行动力学研究，通过观察GFP蛋白在细胞内的动态变化，如运动轨迹、生长速度、参与细胞分裂等，揭示细胞的生物学过程和机制。
3. GFP的应用步骤应用GFP进行细胞生物学和生物化学研究的步骤如下：步骤1：选择适当的表达载体选择合适的表达载体，将GFP基因插入其中，并与目标蛋白的编码序列进行融合，以实现目标蛋白的表达和GFP的定位。
步骤2：转染目标细胞采用合适的转染技术将表达载体导入目标细胞，并使用适当的筛选标记（如抗生素抗性基因）筛选成功转染的细胞。
dfhbi 1t类绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是一种具有绿色荧光的蛋白质，广泛应用于生物学领域的标记和成像技术中。
绿色荧光蛋白的研究和应用已经成为生命科学领域中的热点和前沿课题。
在这篇文章中，我们将深入探讨绿色荧光蛋白的种类、结构、功能和应用。
1. 绿色荧光蛋白的种类绿色荧光蛋白是由Aequorea victoria（水母）发光器官中分离出来的一种蛋白质。
根据不同的来源和结构特点，绿色荧光蛋白可以分为多种类别，包括标准GFP、改良GFP、超变荧光蛋白和环状GFP等。
每种类型的绿色荧光蛋白都具有不同的荧光特性和适用范围。
2. 绿色荧光蛋白的结构绿色荧光蛋白的结构是其功能的基础。
它是一个由238个氨基酸组成的蛋白质，包括一个β桶结构和一个共轭双键序列。
在特定的条件下，它可以通过自发性氧化反应形成荧光色团，并发出绿色的荧光。
绿色荧光蛋白的结构和光学特性为其在生物标记和成像领域的应用奠定了基础。
3. 绿色荧光蛋白的功能作为一种生物标记物，绿色荧光蛋白的主要功能是在转基因生物中标记特定的细胞、器官或组织，以便于研究者对其进行观察和分析。
通过转基因技术，研究人员可以将绿色荧光蛋白基因导入到目标生物体中，从而实现对其活体成像和实时监测。
绿色荧光蛋白在蛋白质定位、蛋白质-蛋白质相互作用和基因表达调控等方面也发挥着重要作用。
4. 绿色荧光蛋白的应用绿色荧光蛋白的广泛应用领域包括但不限于以下几个方面：a. 细胞成像与实时监测：通过转基因技术将绿色荧光蛋白标记到感兴趣的细胞中，可以实现对其活体成像和实时监测，从而揭示生物体内细胞的运动、分化和凋亡等过程。
b. 蛋白质定位与跟踪：通过融合绿色荧光蛋白与感兴趣蛋白质，可以实现对蛋白质在生物体内的定位与跟踪，从而研究其功能和代谢途径。
c. 蛋白质-蛋白质相互作用研究：利用双融合蛋白技术或FRET技术，可以实现对蛋白质-蛋白质相互作用的实时观察和分析，为研究蛋白质分子机制提供了有力工具。
发光细菌GFP的表达机理及应用
发光细菌GFP的表达机理及应用发光细菌GFP是绿色荧光蛋白的简称，是由Aequorea victoria这种水母所产生的一种蛋白质。
GFP不但具有高度的应用价值，而且还是生物学研究中最有用的分子标记之一。
本文将从发光细菌GFP的表达机理、应用以及未来发展等方面进行介绍。
一、发光细菌GFP的表达机理GFP是一种由238个氨基酸组成的蛋白质，主要在海水深处生活的Aequorea victoria珊瑚中产生。
GFP通过吸收紫外线光激发，产生荧光。
GFP能在任何类型的生物组织内发光，不会产生有害影响。
除了绿色之外，GFP还能产生黄色、蓝色、紫色、红色等颜色的荧光。
这些颜色的荧光由不同种类的GFP进行表达，这些不同种类的GFP都具有不同的结构和光学特性。
GFP的结构包含一个由11肽段组成的β桶状结构和一个由α螺旋段组成的关键性结构域。
通过对这个结构域的分子工程改造，研究人员可以对GFP进行改造，使其在其他物种内表达并发光。
二、发光细菌GFP的应用GFP已成为生物医学领域的热门研究课题。
由于GFP可以与其他蛋白质相结合，并且不会对细胞造成任何影响，能够用于实现对生物系统的准确研究。
GFP可以制作成质粒，通过质粒转染等方法，将其导入到需要研究的细胞内。
利用GFP可准确观察到细胞内各种蛋白质分子的定位和表达等情况。
1、生物病理学：GFP在生物病理学领域已经有了广泛的应用。
与其他标记方法相比，GFP标记具有许多优势。
第一，当有多种标记时，GFP在背景噪音中更易于辨认；第二，直接观察细胞在活体状态下的各种功能，例如细胞的表面形态、细胞器的运动等。
2、分子生物学：GFP已经成为分子生物学中最重要的分子标记技术之一。
通过观察GFP标记蛋白分子的表达、定位和交互关系，有助于更好地理解生物化学反应。
利用GFP标记，研究人员可以更好地分离和分析蛋白质、DNA和RNA，进一步深入研究生物化学反应。
3、神经科学：大多数神经科学家利用GFP生物标记技术，将化学物质或电压灵敏的通道与GFP合并。
GFP-绿色荧光蛋白的来源和应用
GFP:绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。
它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。
发光机理:当蛋白质链折叠时,这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段,得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。
但此时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形式。
上述绿色荧光蛋白发色团的形成过程,系由几位科学家分别研究完成的。
绿色荧光蛋白不仅无毒,而且不需要借助其他辅酶,自身就能发光,可以让科学家在分子水平上研究活细胞的动态过程。
当绿色荧光蛋白的基因和我们感兴趣的有机体内所拟研究的蛋白质基因相融合时,蛋白质既能保持其原有的活性,绿色荧光蛋白的发光能力也不受影响。
钱永健的贡献钱永健及其合作者,还解决了绿色荧光蛋白的晶体结构问题,从而允许能够较合理地对具不同性质的变体合成进行设计。
这些新变体有的荧光更强,有的呈黄色,有的呈蓝色,有的呈红色,有的可激活、可变色。
这意味着除绿色以外,还可以用其他颜色荧光蛋白标示不同的蛋白质和细胞。
GFP的发光特性GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder).GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察.GFP的性质GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450～490nm蓝光波长下更稳定.GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等.GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.在生物技术中的应用1.分子标记除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。
绿色荧光蛋白
GFP作为标记蛋白的优点
①荧光稳定 ②检测方便 ③无种属特异性，也无有细胞种类和位置的限制 ④GFP对受体细胞基本无毒害 ⑤易于构建载体，不受假阳性干扰 ⑥不需任何反应底物和辅助因子 ⑦可制成永久标本
绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白的分子生物学 及其应用
绿色荧光蛋白的研究史
1962年Shimomure等首先从维多利亚水母(Aequorea Victoria) 中分离出了GFP (Green-Fluorescent Protein) 。
维多利亚水母 (Aequorea Victoria)
A test tube containing a sample of a cyan (greenish-blue) fluorescent protein from a sea anemone illuminated by ultra-violet light from below.
பைடு நூலகம்
GFP发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分 直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境 的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通 常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得 到了保护。发色团（右图）由蛋白质链上的三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或 丝氨酸）自发形成。
绿色荧光蛋白的研究史
1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了 GFP，开创了GFP应用研究的先河。
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Ｈａｌｅ等。妇利用ＧＦＰ标记，研究了可溶性微管 蛋白ＦｔｓＺ与其内膜受体ＺｉｐＡ间的缔合作用．他们 将ＧＦＰ与ＺｉｐＡ融合，并用ＦｔｓＺ与之直接结合，通 过荧光检测发现，ＺｉｐＡ—ＧＦＰ融合蛋白在细胞壁缢 缩前和缢缩过程中均位于ＦｔｓＺ与膜相关的特殊环 中，说明ＺｉｐＡ—ＦｔｓＺ的相互缔合是细胞分裂必需 的．ＺｉｐＡ可能直接参与ＦｔｓＺ环的形成和功能．
与Ｈｅｉｍ等０１的结果一致．
３绿色荧光蛋白的结构
Ｙａｎｇ等０１的研究表明，ＧＦＰ是由两个相当规 则的内含一个ａ一螺旋和外面包围１１个肛折叠链的 ｝桶状结构（［］－ｂａｒｒｅｌ）组成的二聚体．ｐ桶状结构直 经约３ ｎｍ，高约４ ｎｒｌｌ．ａ一螺旋片段的一部分是修饰 的酪氨酸侧链．其顶部和底部是由小片段ｎ．螺旋形 成的“帽子”．Ｏｒｍｏ［１如等也独立地得出了类似的结 论，并认为｝桶状结构从Ｎ一末端始依次是三条反平 行的｝折叠链，中心的ａ一螺旋和另外三条反平行的 产折叠链（其中由第１１８位氨基酸残基至第１２３位 氨基酸残基组成的第三条链与Ｎ一末端由第１ １位氨 基酸残基至第１３位氨基酸残基组成的ｐ折叠链平 行），然后多肽主链穿过其底部形成该结构的另一 半，即由五个｝折叠链组成的希腊花边基元（Ｇｒｅｅｋ ｋｅｙ ｍｏｔｉｆ），其顶部和底部分别是由三个和一个扭 曲的短ｎ一螺旋覆盖．
生万物，方进数行据生态学规律研究．Ｌｅｆｔ等“７］用ＧＦＰ标记
遗传工程微生物以监测其在水环境中的存活和去 向．朱应等［１”构建了带ｇｆｐ基因的重组棉铃虫病 毒．该病毒一次感染棉铃虫后不再重复感染，室内 饲养３代，各代均可见典型的发绿色荧光的棉铃虫， 表明病毒可以介导ＧＦＰ标记其宿主，预计将为研究 棉铃虫的迁飞和暴发规律提供强有力的手段．
收稿日期：１９９９—１２—０７
ｔ通讯联系人
荛喜器：易翥蠢苗茹妻踌：矬蹴翻磊黪器貉瓣掣２。０４’
万方数据
武汉大学学报（自然科学版）
第４６卷
拶。
—Ｏ＝， —－ＨＯ
包含体
ＯＨ
图１ ＧＦＰ生色基团化学结构及其生物合成示意图
２～２３２个氨基酸对维持发光特性是必需的．截短 Ｃ一末端７个以上氨基酸或Ｎ一末端两个以上氨基酸， 则荧光全部丢失．但Ｈｅｌｍ等［２３的研究表明去掉了 ｃ一末端１２个氨基酸的ＧＦＰ基因与ＨＣＶ Ｃｏｒｅ抗原 基因融合，融合蛋白的荧光光谱与强度均无变化，最 大发射渡谱变宽（４９０～５１０ ｎｍ）．岳莉莉等嘲将 ＧＦＰＳ６５Ｔ Ｃ一端分别截短１２个氨基酸和７５个氨基 酸，发现截短１２个氨基酸时，对荧光特性无明显的 影响．但截短７５个氨基酸后，激发波长更短（３６０ ｎｍ），荧光微弱．她们表达的ＧＦＰ／ＨＢＶｅ抗原和 ＧＦＰ／ＨＣＶｃ抗原两种双功能融合蛋白的荧光特性
Ｃｈａｌｆｉｅ等ｎ１于１９９４年率先在大肠杆菌和线虫 中表达ＧＦＰ，随后在酵母、果蝇、Ｈｅｌａ细胞、植物、转 基因鼠、昆虫细胞等中表达成功．这些研究表明 ＧＦＰ的生色基团（Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）在异源细胞中可自 发形成，其发光无需任何特殊的辅助因子参加．
ＧＦＰ有两个缺点：１）有两个激发峰影响了其特 异性；２）长波激发峰强度较小，不易观察．Ｈｅｉｍ
５ 绿色荧光蛋白基因的应用
ＧＦＰ分子量小，能够在异源细胞中稳定表达并 发射荧光，不需要任何辅助因子参加，对细胞没有毒 性，因而得到广泛应用．
１）作为报道基因构建基因工程载体 常用的质粒克隆载体的报道基因如ＬａｃＺ，是利 用酶促催化反应，需要加入外源底物和诱导物（如
第２期
刘祖强等；绿色荧光蛋白的结构，发光机制及其应用研究
Ｃｕｈｉｔｔ等口３认为生色基团自身环化的驱动力来 自蛋白质三维结构的形成，由此Ｋｏｌｂ等“３提出一个 假说，即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行． ＧＦＰ被包含体捕获后即完全失去形成生色基团的 能力，因为此时新合成的ＧＦＰ不可能正确折叠．
为了确定ＧＦＰ荧光发射中需要分子的哪些部 分，Ｄｏｐｆ等”１构建了ＧＦＰ Ｎ ｒ末端和Ｃ一末端部分缺 失的表达载体．通过表达和检测发现，ＧＦＰ的
ＩＰＴＧ，Ｘ—ｇａｌ），不仅操作繁琐且价格昂贵．李寿东 等Ｈｚ］构建了以ｇｆｐＳ６５Ｔ基因作为筛选标记的新型 克隆载体，建立了以绿／白斑筛选法筛选阳性重组子 的新方法，替代ＬａｃＺ蓝／白斑筛选，不需Ｘ—ｇａｌ，经 济，简单可行．
２）目的基因的功能研究 将目的基因与ｇｆＰ基因连接后，通过观测融合 蛋白的荧光特性研究其表达和功能．哺乳动物细胞 表达两种ＤＮＡ拓扑酶．该酶的Ｎ一末端和中部结构 域序列高度保守，而其ｃ一末端结构域（ｃ—ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ，ＣＴＤ）具有种属特异性．为了确定体内核 定位是否仅有ＣＴＤ参与就可完成，Ａｄａｃｈｉ等［１”将 Ｃ一末端基因与ｇｆｐ基因连接，并在ＧＡＬｌ启动子驱 使下在酵母细胞中表达．通过检测ＧＦＰ信号，发现 两种拓扑酶的ＣＴＤ均得到表达，而且拓扑酶Ｉ— ＧＦＰ仅在细胞的有丝分裂期发现，拓扑酶Ｉ—ＧＦＰ 主要出现于细胞分裂间期．结果说明，拓扑酶的 ＣＴＤ即足以充当核定位的信号． ３）蛋白质缔合作用研究
４）病原体与其宿主关系的研究 将病原体用ＧＦＰ活体标记，可以在全真条件而 不是模拟条件下实时研究病原体与其宿主的关系． Ｃａｓｐｅｒ等ｏ”将ｇｆｐ基因插入ＴＭＶ基因组，体外转 录获得感染性ＲＮＡ，并以之接种烟叶．观察发现， ＴＭＶ在接种点和整个植株均可表达ＧＦＰ．持续观 察ＧＦＰ的出现情况，发现整株感染时ＴＭＶ以两种 方式运动：细胞间慢的传播，伴随病毒复制的ｇｆＰ表 达；维管介导的快速转运，病毒不复制，ｇｆＰ不表达． Ｂａｒｒｅｔｔ等ｏ“将ｇｆＰ克隆于苜蓿银纹夜蛾核型多角 体病毒（ＡｃＭＮＰＶ）的多角体启动子下游，发现感染 ２４ ｈ后在昆虫的中肠上皮细胞和血细胞中发现绿 色荧光，表明在这些组织中病毒复制表达了极晚期 蛋白．随后的感染发生在整个体腔的气管细胞，并 进而发生在其它组织． ５）ＧＦＰ基因在生态学中的应用 将ｇｆＰ直接导入目标生物或将ｇｆＰ克隆到病 毒、细菌或质粒上，通过它们的介导而间接标记目标
参考文献：
［１］Ｃｈａｌｆｉｅ Ｍ，Ｔｕ Ｙ，Ｅｕｓｋｉｒｅｈｅｎ Ｇ，ｅｔ“．Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｒｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ Ａ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓ—
ｓｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２６３（５１４８）：８０２—８０４．
［２３ Ｈｅｌｍ Ｒ，Ｃｕｂｉｔｔ Ａ Ｂ．Ｔｓｉｅｎ Ｒ Ｙ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｇｒｅｅｎ
生成的． 生色基团位于螺旋中部，距桶状结构的几何中
心不到０．２ ｒｉｍ，在其周围是极性和非极性的氨基酸 侧链．Ｐｈｅ６４和Ｐｈｅ４６在生色基团附近将Ｔｒｐ６３与 生色基团分开，使生色基团得到保护．
ｃ一末端的环状结构位于桶状结构外，其最后的 约７个氨基酸呈无序排列．这些氨基酸残基不形成 “桶片”，故其缺失不影响荧光特性．Ｎ一末端是桶状 结构末端的“帽子”，故其缺失会引起荧光的丢失．
４ 绿色荧光蛋白的发光机制
Ｙｏｕｖａｎ等ｒ１－３提出了ＧＦＰ荧光发生机制的简
单模型．这个模型中，在高ｐＨ或在生色基团附近
引入突变时，假定Ｔｙｒ６６处于酚盐形式ｉ在低ｐＨ
下，则处于酚羟基形式（图２）．
ｏ
Ｏ
二生－０
十Ｈ
图２绿色荧光蛋白发光机制示意图 生色基团通过Ｔｙｒ６６的脱质子状态（酚盐）和 质子化状态（酚羟基）的转换决定荧光发射．由于酚 的激发态酸性远大于其基态，故仅脱质子态的结构 发射荧光． 此模型为Ｙａｎｇ等［９３的晶体学证据所支持．
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ⅳ４ｔｕｒｅ，１９９５，３７３（６５１６）：６６３ ６６４．
［３］Ｃｒａｍｅｒｉ Ａ，Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎ Ｅ Ａ，Ｔａｔｅ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ·１９９６，１４（３）：
等…利用点突变使Ｓｅｒ６５突变为Ｔｈｒ６５，结果荧光 强度比野生型增加４～６倍，吸收波长和发射波长分 别增至４９０ ｎｍ和５１０ ｎｍ．Ｃｒａｍｅｒｉ等…用ＤＮＡ改 组（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）获得一个荧光强度比野生型大 ４２倍的突变体．
２ 绿色荧光蛋白的生色基团
ＧＦＰ的生色基团由位于第６５～６７位的３个氨 基酸：丝氨酸一脱水酪氨酸一甘氨酸形成的对羟基苯 咪唑啉酮（４－Ｐ—ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｅ一５一ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ）构成 （图１）．ＧＦＰ的生色基团是蛋白质自身催化环化的 结果．Ｈｅｉｍ等“］发现重组ＧＦＰ的发光特性需在有 分子氧存在的环境下才能出现．推测其生物合成过 程如图１所示．
争折叠彼此紧密结合，象桶板一样形成桶状结 构的外围，并且形成一个规则的氢键带．桶状结构 和位于其末端的短ａ一螺旋以及环状结构一起组成 一个单独的致密结构域，没有可供扩散的配体进入 的缝隙．这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗
万变方性数剂据的特点，同时也解释了生色基团为什么只能
自身环化，因为酶是很难进入其内部催化生色基团
第４６卷第２期 ２０００年４月
武汉大学学报（自然科学版） Ｊ．Ｗａｈａｎ Ｕｎｉｖ．（Ｎａｔ Ｓｅｉ Ｅｄ）
文章编号：０２５３—９８８８（８０００）０８—０２１１－０４
ＶｏＩ．４６ Ｎｏ．２ Ａｐｒ．２０００，８１１～２１４
绿色荧光蛋白的结构、发光机制及其应用研究
刘祖强，胡 敏，齐义鹏＋
（武汉大学生命科学学院病毒研究所，武汉４３００７２）
ｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）中分离纯化的绿色荧光蛋白（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ），由于其作为生物标记物 的独特优点，受到众多学者的青睐，得到广泛的研究 和应用．
１ 绿色荧光蛋白的发光特性
绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）是从水母分离出的一种天 然荧光蛋白．分子量约２７×１０３，为一个由２３８个氨 基酸残基组成的单链多肽．其荧光发射峰在５０９ Ｄｉｌｌ，最大激发波长为３９５ ｎｍ，并在４７０ ｎｎｌ处有一 肩峰．ＧＦＰ的化学性质相当稳定，其变性需在９０℃ 或ｐＨ＜４．０或ｐＨ＞１２．０的条件下用６ｍｏｌ／Ｌ盐酸 胍处理．