ESI-MS 分析蛋白质非共价键复合物
质谱在蛋白质中的应用
蛋白质组学研究中个典型研究流程
蛋白质研究中个典型研究流程
现代质谱简介
质谱分析蛋白优点： 1. 可用于分析大分子。 2.可用于分析不纯化合物。因为生物体系相对较复杂，物 质提纯不易，因此新型质谱的出现使一些研究成为可能。 3.样品消耗量很低。 4.仪器操作简便，检测速度快，适用于大批量的样品研究 。
质谱质谱中氨基酸残基的元素组成和精确质量数中常 见氨基酸残基的元素组成和质量数
质谱在蛋白质研究中的其他应用
除了前面介绍的肽与蛋白质序列测定以外 ，还包括质谱与其他分离手段连接（如与毛细 管电泳、HPLC相连等）以加快测样速、度，提 高质谱检测精度（如使用傅立叶回旋分析器与 ESI和MALDI相连等。 其中有一项工作是非常重要的，即蛋白质 的定量
差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序（Ladding sequencing)，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸 残基。
质谱中常见氨基酸残基的元素组成和质量数
待测离子经活化后具有较高的能量，诱发碎裂 ，产生多组不同类型的碎片峰。所以首先需要区分 出各组峰的类型归属，才能通过比较相邻的同种离 子的质量差，判断相应的氨基酸残基.质谱中常见 氨基酸残基的元素组成和质量数见下表。
质谱在小肽与蛋白质序列测定中的应用
质谱在蛋白质研究中的主要作用在于检测确定相应蛋白质 的归属，其中测定小肽及蛋白质序列是确定蛋白质的根本。 质谱用于肽和蛋白质的序列测定方法有3种。主要如下：
质谱用于肽和蛋白质的序列测定方法
第一种方法叫蛋白图谱（protein mapping),用特异性的酶解 或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产 物肽分子质量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相 对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列. 第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚 稳离子，通过分析相邻同种类型峰的质量差，识别相应的氨基 酸残基. 第三种方法与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解 使蛋白质或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间
文献综述-蛋白质的乳化性质
文献综述蛋白乳化性质的研究摘要：乳化性质是蛋白质的一项重要功能性质，包括乳化活性和乳化稳定性。
本文主要通过对蛋白乳化性质的介绍，综述了其测定方法、不同的处理方式和不同的物化因素对乳化性的影响。
关键词:蛋白质乳化性测定方法影响因素1 前言乳化性质（Emulsibility）是蛋白质的一项重要的功能性质，是指油品和水形成乳状液的能力,包括乳化活性（Emulsifying Properties）和乳化稳定性（Emulsifying stability）两个方面.乳化活性是指蛋白质在促进油水混合时，单位质量的蛋白质（g）能够稳定的油水界面的面积(m2）；乳化稳定性是指蛋白质维持油水混合不分离的乳化特性对外界条件的抗应变能力。
蛋白质乳化性是指蛋白质能使油与水形成稳定的乳化液而起乳化剂的作用［1］。
2 乳化性质的测定方法2.1 乳化活性的测定方法2。
1.1 分光光度法阮诗丰[2]等人采用722S型分光光度计对大豆分离蛋白乳化活性进行了测定。
课题中具体的试验方法如下:用微量取样器取出底部的乳状液50μL,用0.1％(W/V）SDS(十二烷基硫酸钠）溶液稀释到一定倍数后放入比色皿中，以相同的SDS溶液作参比液，立即测定其在500nm处的吸光度A。
根据赵国华等［3]的方法进行简化，乳化活性EA用零时刻的吸光度来表征：EA=A0或用乳化活性指数，即每克蛋白质的乳化面积来表示［4］：10000 C NA2303.2EAI500⨯⨯⨯⨯⨯=φ式中：C：溶液中样品蛋白质浓度；Φ：油相体积分数；N:稀释倍数用分光光度计法测定多种大豆分离蛋白的乳化活性，每种测定均重复多次,计算结果的标准方差(SD：Standard deviation）和变异系数(CV：coefficient of variation）来反映此测定方法重复性。
邓塔[5]等人在研究大豆蛋白乳化性质的课题中,以脱脂大豆粉为实验对象，取一定体积质量分数为2.0%的蛋白质溶液，加入同体积的大豆色拉油，以6400r/min 的速度高速搅拌2min，之后在0min取样100，以0.1%（w/v)SDS（十二烷基磺酸钠,pH=7。
【国家自然科学基金】_电喷雾质谱(esi-ms)_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140801
推荐指数 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
ms/ms l-天冬氨酸 friedel-crafts反应 dna 4″-烷氧基-1 4′-溴-4-羟基-1 1′:4 1′-联苯 12-氨基乙酰脱氢枞胺
1 1 1 1 1 1 1 1 1
2011年 科研热词 推荐指数 电喷雾质谱 4 质谱 2 药物化学 2 脂三肽 2 电喷雾串联质谱 2 环六脂肽 2 氧载体 2 氧合反应 2 抗真菌剂 2 卡泊芬净 2 黄酮类成分 1 鸡骨草 1 高效液相色谱 1 青天葵 1 锰配合物 1 钴 1 配伍 1 解离常数 1 血管紧张肽ⅲ 1 肠内菌代谢 1 细胞色素c 1 组氨酸 1 磷酸酯 1 相思子碱 1 相互作用 1 皂苷 1 甘遂 1 甘草附子汤 1 甘草 1 水解产物 1 氨基甲酸酯 1 氟虫腈 1 毒性 1 次乌头碱 1 杀虫活性 1 术附汤 1 晶体结构 1 微波辅助提取 1 固相反应 1 合成 1 化学合成 1 乙二胺钴 1 乌头碱 1 中乌头碱 1 下箴刺桐碱 1 三氮唑 1 n-苯甲酰基-脱氢枞胺衍生物 1
蛋白质组学研究内容和相关技术
一、什么是蛋白质组？与基因组差别？蛋白质组学的主要研究内容及技术体系？答：蛋白质组：Proteome，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在1994年提出的。
基因组：Genome，一个细胞或者生物体所携带的一套完整的单倍体序列，包括全套基因和间隔序列。
可是基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。
因此，基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。
二者区别：蛋白质组研究和基因组研究依然是形影相随的两个重要领域，它们之间既为互相补充又能互相帮助，但二者之间仍有一些区别：蛋白质组：多样性，无限性，动态性，空间性，互相作用。
基因组：同一性，有限性，静态性，周期性，孤立性。
蛋白质组学的主要研究内容：（1）表达蛋白质组学(expressionproteomics)：是对蛋白质组表达模式的研究，即检测细胞、组织中的蛋白质，建立蛋白质定量表达图谱，或扫描表达序列(EST)图谱。
在整个蛋白质组水平上提供了研究细胞通路、疾病、药物相互作用和一些生物刺激引起的功能紊乱的可能性，对寻找疾病诊断标志、筛选药物靶点、毒理学研究等具有重要作用。
（2）细胞图谱蛋白质组学(cellmapproteomocis)：是对蛋白质组功能模式的研究，即确定蛋白质在亚细胞结构中的位置和鉴定蛋白质复合物组成等，便于研究蛋白质在细胞内的行为、运输及蛋白质相互作用网络关系，它对确定蛋白质功能和疾病诊疗的靶位极有价值。
蛋白质组学技术体系：（1）蛋白质组学分离技术，在整个蛋白质组学的研究中，分离技术是最基础的部分。
蛋白质组学考试试题
蛋白质组学考试试题一、选择题（每题 3 分，共 30 分）1、以下哪种技术不是蛋白质组学研究中常用的分离技术？（）A 双向凝胶电泳B 高效液相色谱C 质谱分析D 亲和层析2、蛋白质组学研究的核心内容是（）A 蛋白质的表达水平B 蛋白质的修饰C 蛋白质之间的相互作用D 以上都是3、在质谱分析中，用于测定蛋白质分子量的是（）A 飞行时间质谱B 离子阱质谱C 四级杆质谱D 以上都可以4、蛋白质组学研究中，用于定量蛋白质表达水平的方法是（）A 同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）B 双向凝胶电泳定量C 质谱定量D 以上都是5、以下哪种蛋白质修饰不属于翻译后修饰？（）A 磷酸化B 甲基化C 乙酰化D 转录6、蛋白质组学研究中，样品制备的关键步骤不包括（）A 细胞破碎B 蛋白质提取C 蛋白质消化D 蛋白质结晶7、用于研究蛋白质相互作用的技术有（）A 酵母双杂交B 免疫共沉淀C 荧光共振能量转移D 以上都是8、以下关于蛋白质组学数据分析的说法错误的是（）A 需要对大量的数据进行处理和筛选B 可以使用生物信息学工具进行分析C 数据分析的结果可以直接得出结论，无需验证D 数据的质量控制很重要9、蛋白质组学在以下哪个领域有重要应用？（）A 疾病诊断B 药物研发C 农业科学D 以上都是10、以下哪种不是蛋白质组学研究中的样品来源？（）A 组织B 细胞C 血液D 无机物二、填空题（每题 3 分，共 30 分）1、蛋白质组学是指研究一个细胞、组织或生物体在特定条件下所表达的＿_________________ 及其＿________________ 的学科。
2、双向凝胶电泳的第一向是＿________________ ，第二向是＿________________ 。
3、质谱分析中，离子源的作用是将样品分子＿________________ 成离子。
4、蛋白质组学研究中的定量方法主要包括基于＿________________ 的定量和基于＿________________ 的定量。
【国家自然科学基金】_非共价相互作用_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140801
2013年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
科研热词 分子动力学模拟 非离子型水溶性卟啉 非共价键相互作用 非共价改性 非共价作用力 金属模拟酶 超支化聚乙烯 超分子化合物 蛋白质设计 荧光光谱 脱氧土大黄苷 胶原 聚甲基丙烯酸甲酯 纳孔分子材料 紫外光谱 第二配位环境 相互作用 疏水作用 环糊精葡萄糖基转移酶 热稳定 气体吸附与分离 巨正则蒙特卡洛模拟 嵌段共聚物 多壁碳纳米管 单壁碳纳米管 协同作用 π -π 相互作用 β -环糊精 zeta电位 laponite
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
科研热词 推荐指数 非共价相互作用 4 酞菁 2 应用 2 富勒烯 2 光诱导电子转移 2 n-磷酰化多巴胺 2 金纳米粒子 1 蛋白质 1 药物设计 1 胰岛素 1 结合反应机制 1 紫杉醇 1 类黄酮化合物 1 相互作用能 1 相互作用 1 疾病治疗 1 电喷雾质谱 1 电喷雾离子肼-质谱 1 牛血清白蛋白 1 溶菌酶 1 氢键相互作用 1 槲皮素 1 检测 1 抑制剂 1 寡肽 1 多态性 1 增溶 1 堆积作用 1 堆叠 1 地平 1 四氮唑 1 单电子作用势 1 分子设计 1 分子形貌 1 分子对接 1 内禀特征轮廓 1 修饰电极 1 作用势的鞍点 1 二聚体 1 三肽 1 therapy 1 protein 1 phthalocyanine, fullerene, photoinduced 1 electron interaction 1 gold nanoparticles 1 g-四链体dna 1 esi-ms 1 detection 1 cu2 1 20s蛋白酶体 1
利用HPLC-ESI-MS技术测量硒代氨基酸
电喷雾质谱法（ESI-MS）的基本原理是在液相色谱(LC) 的毛细管出口处施加高电压，从而产生的电场使液体雾化成 带电小液滴；随着溶剂蒸发，液滴的表面积减少和电荷密度 增加，使得液滴分裂，最终导致分析物以单或多电荷离子的 形式进入气相；根据离子的荷质比，得到相应的质谱图。电 感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）一般与各种分离技术结合
近几年，通过HPLC-ESI-MS定量分析硒代氨基酸已经有 所发展，主要是用乙醚通过LC/ESI/MS衍生乙氧基的方法来识 别和确定Se-Met和硒甲基硒代半胱氨酸（SeMeSeCys）。校准 曲线的线性范围在0.32pmol－49pmol的是蛋氨酸，0.34pmol－ 40pmol的是Se-MeSeCys。这种方法可用于测定Se-MeSeCys和 洋葱中的SeMet。除了低检测限，还可以确认分析物的身份并 识别未知化合物。衍生作用是提高LC/ ESI/MS检测的灵敏度 和选择性，提高色谱保留或峰形，消除交叉污染，促进样品净 化，对于不稳定的分析物形成一个稳定的衍生物。
使用，而ESI-MS具有低检测灵敏度，容易受到基体的干扰， 所以在ESI-MS分析中样品的浓度和纯化是必要的。如果在样 品中发现未知硒化合物，ESI-MS则与分离技术结合识别未知 的化合物。酵母中的硒腺苷高半胱氨酸、芥菜根中的甲基硒 代蛋氨酸、大葱中的γ谷氨酰硒-甲基硒代半胱氨酸、蘑菇 中的硒代蛋氨酸、大鼠肝细胞代谢物中的硒-甲基硒代半胱氨 酸，都是用HPLC-ICP-MS和ESI-MS来鉴别。
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ESI-MS及其原理ppt课件
12
不同表面张力 的溶剂的起始电位Von（表1）
溶剂
CH3OH CH3CN （CH3）2SO H2O
(N/m) 0.0226 0.030
0.043
0.073
Von（kV） 2.2
2.5
3.0
4.0
13
水的表面张力最高，最难于形成Taylor锥及喷雾， 故起始电位Von最高。为了稳定喷雾，必须加以较Von高 数百伏的电位。用水作溶剂，易于导致毛细管尖端放电， 尤其是当毛细管为负电位时（负离子方式）。虽然ESI起 始电位对正或负离子方式是相同，但毛细管尖端的放电 起始电位当毛细管处于负电位时较低。放电使毛细管电 流I增加，电流在10-5A以上，通常是由于有放电现象。 在正离子方式， 检测到质子化的溶剂簇，H3O+(H2O)n （水）或CH3OH2+(CH3OH)n（甲醇）说明发生了放电。 放电使ESI/MS性能降低，待测离子强度大为下降，放电 产生的离子具高强度，这可能是放电使毛细管尖端电位
K=∑λ0,mCi
19
25℃，某些电解质在甲醇中的分子电导率（表2）
溶质
λ0,m
离子
l0,m
HCl
190
H+
146
;
40
HNO3
203
Na+
45
LiCl
91
K+
52
NaCl
97
Cl-
52
KCl
104
Br-
56
组成离子的分子电导率为：λ0,m(MX)=l0,m(M+) + l0,m(X-)。 λ0,m和l0,m以Ω为单位。
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ESI-MS分析蛋白质非共价键复合物
质谱作为一种分析方法，长期以来一直用于小分子化合物的结构分析。
直到80年代末电喷雾电离质谱（Electrospray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS）和基体辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-MS）两种“软电离（Soft Ionization）”质谱的出现，才将质谱的分析范围扩大到生物大分子的结构分析。
这两种技术具有高灵敏和高质量检测范围，能在飞摩尔(10-15)乃至阿摩尔(10-18)水平检测相对分子量高达几十万的生物大分子。
随着近年来“软电离”技术的进一步发展，质谱技术在蛋白质非共价键复合物研究方面显示了良好的应用前景。
虽然有多种方法可用于检测非共价键复合物，但它们各有优缺点。
凝胶色谱、超速离心、红外光谱、差示紫外光谱、荧光光谱、圆二色光谱等可反映形成非共价键复合物后蛋白质结构发生的变化，但只能提供很少或不能提供关于分子量及复合物化学计量结合数的信息；X-晶体衍射和核磁共振法可用于测定蛋白质的三维结构，能提供详细的结构信息，但都费时且复杂。
X-晶体衍射只有在得到合适晶体的情况下才能应用，而单晶的培养却非易事。
核磁共振分析所用样品量很大且不能分析分子量很大的复合物。
电喷雾电离质谱能够在非常接近天然溶液状态的情况下将非常弱的蛋白质非共价键复合物从液相转变为气相而进行测定，能够更加真实地反映生物大分子的生理状态。
电喷雾离子化技术(ESI)的工作原理：利用位于一根毛细管和质谱进口间的电势差生成离子，在电场的作用下产生喷雾形式存在的带电液滴。
在真空条件下下，液滴表面溶剂蒸发，液滴变小，液滴的电荷密度骤增。
当静电排斥力大于液滴的表面张力时，液滴便发生崩解，形成更小的液滴。
如此形成的小液滴以类似的方式继续崩解，于是液滴中的溶剂迅速蒸干，产生多电荷离子（离子可带正电或负电、依赖于实验条件），在质谱仪内被分析纪录。
电喷雾电离的特征之一是可生成高度带电的离子而不发生破裂，这样可将质荷比降低到各种不同类型的质量分析仪都能检测的程度。
电喷雾质谱研究蛋白质非共价键复合物成功的关键是仪器参数的设定和样
品制备。
一般情况下用电喷雾质谱研究蛋白质或多肽的最灵敏和最稳定条件并不适用于蛋白质非共价键复合物的研究。
通常，用电喷雾质谱研究蛋白质时，样品溶于含少量甲酸（或乙酸）以及乙腈（或甲醇）的水溶液中。
但是，此条件下蛋白质已失去折叠变性，难以形成非共价键复合物。
只有在接近生理pH时，蛋白质保持天然的活性构象，才能形成非共价键复合物。
因此，研究蛋白质非共价键复合物时，样品常溶于2-50mmol CH3COONH4或NH4HCO3中，pH在5-8比较合适。
低的pH值或有机溶剂的存在会导致蛋白质变性，阻碍复合物的形成，即使溶液中只含有10%的甲醇，也会导致复合物的消失。
电喷雾源温度或进样毛细管温度的高低对蛋白质非共价键复合物也有影响。
在样品能电离的条件下，温度越低越好。
电喷雾源中毛细管和反电极之间的电压或cone 电压对复合物的形成也有很大的影响，电压过高时会导致复合物的解离。
总之，所有能够导致蛋白质变性的因素都不利于蛋白质非共价键复合物的形成，pH值、有机溶剂、温度和电压是在研究蛋白质非共价键复合物时要考虑的几个重要因素。
用电喷雾质谱研究蛋白质非共价键复合物的稳定性也常常是通过改变这几个条件来实现的。
用ESI-MS观察到的非共价键复合物包括蛋白质-蛋白质，蛋白质-配体，蛋白质-寡核苷酸和蛋白质-双链DNA及蛋白质-金属离子等。
1991年Ganem等最早应用电喷雾质谱(ESI-MS)研究细胞浆中受体蛋白质FKBP12及其配体FK506和rapamycin的非共价键复合物。
美国一实验室已致力于发展质谱方法研究生物大分子非共价键复合物，以便寻找一种抗癌剂。
他们的策略是从合成的或天然的资源中筛选能够与致病蛋白非共价键结合的抑制剂，以干预致病通道。
与传统的方法相比，ESI-MS在研究蛋白质非共价键复合物时，具有特异（specifity）、灵敏（sensitivity）和快速（speed）的优点。
ESI-MS可以区分结构差别很小的化合物之间的特异性结合，ESI-MS在探讨生物分子间构象专一性结合中是一个灵敏的技术。
从日益增多的文献可以看出，用电喷雾质谱研究蛋白质非共价键复合物已备受重视。
对于大多数研究对象，从电喷雾质谱得到的结论与溶液中用其他方法研究的结果一致，说明通过电喷雾质谱研究可以了解细胞中蛋白质与其他生物分子是怎样相互作用的，但大多数非共价键复合物在气相中是非常脆弱的，因此必须很仔细地控制实验条件才能获得好的实验结果。
用ESI-MS研究蛋白质非共价键
复合物，能够筛选与致病蛋白质相互作用的化合物或寻找酶的抑制剂，为寻找新药提供依据。
与组合化学合成方法相结合，可以加速新药的发现。
可以说，ESI-MS 是在分子水平上筛选新药候选化合物的新工具。