反向PCR技术原理和应用
反向pcr原理
反向pcr原理反向PCR（Reverse PCR）是一种常用的PCR技术，用于在DNA序列未知的情况下，扩增目标DNA片段的两端序列。
它通过反向延伸的方式，从目标序列的内部区域扩增出未知序列的两端，以便进一步的克隆和分析。
本文将介绍反向PCR的原理、方法和应用。
一、原理反向PCR的原理基于PCR技术，但与常规PCR有所不同。
常规PCR是通过设计引物扩增已知序列的DNA片段，而反向PCR则是通过设计引物扩增未知序列的两端。
其基本步骤包括DNA片段的限制性内切酶切割、反向连接、PCR扩增和测序分析。
目标DNA片段被限制性内切酶切割生成两个互补的末端。
然后，这些末端通过反向连接，形成一个环状的DNA分子。
接下来，使用引物对环状DNA进行PCR扩增，以得到目标DNA片段的两端序列。
最后，通过测序分析，可以确定目标DNA片段的未知序列。
二、方法反向PCR的方法包括样品处理、引物设计、PCR扩增和测序分析。
样品处理：从待扩增的DNA样品中提取DNA，并进行限制性内切酶切割。
酶切割产生的DNA片段应具有一定的长度，以便进行反向连接。
引物设计：设计两对引物，分别位于目标DNA片段的内部和外部。
内部引物用于反向连接后的PCR扩增，外部引物用于验证扩增产物的特异性。
PCR扩增：将反向连接后的DNA作为模板，使用内部引物进行PCR 扩增。
PCR条件根据具体实验需求进行优化。
测序分析：对PCR扩增产物进行测序分析，以确定目标DNA片段的未知序列。
三、应用反向PCR在生物学研究中有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1.基因组测序：反向PCR可用于扩增未知序列的两端，以便进行全基因组测序或特定基因的测序。
2.基因克隆：通过反向PCR扩增未知序列的两端，可以获得目标基因的完整序列，从而进行基因克隆和功能研究。
3.基因突变分析：反向PCR可以用于检测基因的突变位点，并进一步研究突变对基因功能的影响。
4.基因组重排检测：反向PCR可用于检测基因组的重排事件，如基因重排、染色体倒位等。
pcr反向点杂交检测地中海分型报告
pcr反向点杂交检测地中海分型报告PCR反向点杂交检测地中海分型报告一、引言地中海贫血是一种常见的遗传性血液病，主要分为地中海贫血（β-地中海贫血）和地中海贫血症（α-地中海贫血）。
PCR反向点杂交（PCR-RFLP）是一种常用的分子生物学方法，可用于检测地中海分型。
本报告旨在详细介绍PCR-RFLP技术在地中海分型检测中的应用。
二、PCR反向点杂交原理1. PCR原理PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的缩写，是一种通过体外扩增DNA片段的方法。
它利用DNA聚合酶酶活性，在特定条件下，使DNA模板得到高效扩增。
2. 反向点杂交原理反向点杂交是一种基于DNA序列特异性识别的方法。
它通过将目标DNA序列与特异性引物结合，并经过适当处理后，通过电泳或其他方法进行检测。
三、PCR-RFLP技术在地中海分型检测中的应用1. 样本采集和DNA提取需要从受检者身上采集样本，如静脉血或口腔黏膜细胞。
通过常规方法提取DNA，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
2. PCR扩增使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增。
对于β-地中海贫血，通常选择扩增β-地中海贫血突变的片段；对于α-地中海贫血，通常选择扩增α-地中海贫血突变的片段。
3. 酶切反应将PCR产物与适当的限制性内切酶一起进行酶切反应。
限制性内切酶是一种能够识别特定DNA序列并在该序列上切割的酶。
4. 胶电泳分析将酶切产物经过胶电泳分离，并使用合适的染料染色。
在紫外光下观察和记录胶图。
根据不同基因型的特点，可以确定受检者的地中海分型。
四、结果解读根据PCR-RFLP结果，可以得出以下结论：1. 如果在PCR-RFLP分析中观察到明显的限制性内切酶位点差异，即PCR产物经过酶切后出现不同长度的片段，可以判断受检者为地中海贫血（β-地中海贫血）或地中海贫血症（α-地中海贫血）。
2. 通过比对PCR-RFLP结果与已知标准样本的电泳图，可以进一步确定受检者的具体地中海分型。
逆转录pcr原理
逆转录pcr原理逆转录PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种基因检测技术，它可以将RNA转录成DNA，在分子生物学研究和临床诊断中有着广泛的应用。
逆转录PCR原理是基于PCR技术和逆转录酶的作用，通过反向转录过程将RNA转录成cDNA，再利用PCR技术扩增目标DNA片段。
本文将详细介绍逆转录PCR的原理及其在科研和临床中的应用。
逆转录PCR的原理首先涉及到逆转录酶的作用。
逆转录酶是一种能够将RNA 模板转录成cDNA的酶，它能够逆转传统的DNA转录成RNA的过程。
在逆转录PCR中，逆转录酶首先与RNA模板结合，然后利用RNA为模板合成cDNA链。
这一步骤是逆转录PCR的关键，它使得我们能够利用PCR技术对RNA进行扩增和检测。
接下来是PCR技术的应用。
在逆转录酶完成cDNA合成后，我们需要利用PCR技术对cDNA进行扩增。
PCR是一种体外扩增DNA的技术，它利用DNA聚合酶和引物对目标DNA进行多轮扩增。
在逆转录PCR中，我们利用PCR技术对cDNA进行扩增，从而获得足够多的目标DNA片段用于后续的分析和检测。
逆转录PCR的原理使得我们能够在研究和临床中对RNA进行检测和分析。
在科研领域，逆转录PCR常用于研究基因表达和调控机制，通过检测特定基因的表达水平来揭示其在生物学过程中的作用。
在临床诊断中，逆转录PCR也被广泛应用于病原体检测和疾病诊断，例如通过检测病毒或细菌的RNA来进行感染性疾病的诊断。
总的来说，逆转录PCR原理是基于逆转录酶和PCR技术的结合，它能够将RNA转录成cDNA并进行扩增，为我们提供了一种重要的基因检测技术。
在科研和临床中，逆转录PCR都有着重要的应用价值，它为我们揭示基因表达和疾病诊断提供了重要的工具和方法。
希望本文能够帮助读者更好地理解逆转录PCR的原理及其应用，为相关研究和临床工作提供参考。
PCR 技术及应用
PCR条件的选择
• DNA聚合酶
• 在其它参数最佳时，每100ul反应液中含12.5U(比活性为20U/pmol)Taq DNA聚合酶为佳。 然而，酶的需要量可根据不同的模板分子或引物 而变化。当优化PCR时，最好在每100ul反应体积 中加入0.5-5U酶的范围内试验最佳酶浓度。如果 浓度太高，则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异扩 增带；过低时，则靶序列产量很低。
引物及dNTP的优化
酶及溴酚蓝的优化
PCR反应的最佳模式（CT为例）
• • • • • • • • • CT DNA PCR最佳反应体系： 反应混合物 终浓度 20×反应缓冲液 1× dNTP混合物 200M 引物Ⅰ 15pmol 引物Ⅱ 15pmol MgCl2溶液 2.0mM 无菌去离子水至 26l/反应管 取26l反应混合物，加入已经分装的Taq DNA聚合酶1u （固定化的酶）的离心管中， 加入2l待测DNA模板，混匀，铺上石蜡，37℃保温10分钟，然后进行PCR循环： 94℃ 300秒 – 94℃ 45秒 – 55℃ 45秒 35次循环 – 72℃ 45秒 – 72℃ 300秒
PCR反应基本原理
Mullis在建立PCR发明的初期，仅采用非常简单的三种温 度水浴进行实验，应用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的 Klenow片段来催化复性引物的延伸效应。由于该酶会在进 行DNA变性的温度下失活，所以每一轮反应中都要添加一 次酶，扩增片段的长度受到限制，操作繁琐。1988年， Saiki把一种耐热的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）引入PCR 后，PCR技术的应用进入了实用阶段，随后PE-Cetus公司 推出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。 PCR技术在微生物学，遗传病学，肿瘤学和法医学领域中 的应用越来越广，据文献报道PCR技术用于检测病原体的 种类已超过100多种。
PCR技术的原理与应用ppt课件
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
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锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
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Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
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2.PCR技术的主要类型及其应用
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锚定PCR原理示意图
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标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤普通PCR1概述聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。
可看作生物体外的特殊DNA复制。
DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。
现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。
它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。
PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。
他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。
而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。
Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。
此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。
随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。
Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
2 PCR原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
质粒的反向 pcr
质粒的反向 pcr质粒的反向PCR是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测和确定质粒中目的基因的序列。
下面将详细介绍反向PCR的原理及步骤。
反向PCR是一种特殊的PCR方法，它与常规PCR的不同之处在于引物的设计。
在常规PCR中，引物是根据目的基因的已知序列设计的，用于扩增目的基因的片段。
而在反向PCR 中，引物则是根据已知的质粒序列设计的，用于扩增质粒中未知区域的片段。
反向PCR的原理基于以下几个假设：1) 质粒的已知序列和未知区域是相邻的；2) 扩增产物在PCR反应中会扩增未知区域的两侧序列。
反向PCR的步骤如下：1. DNA提取与限制性内切酶切割：首先，从含有目标质粒的菌株中提取质粒DNA。
接下来，用限制性内切酶切割质粒DNA，使未知区域与已知序列分开。
2. 偏移引物的设计：根据已知的质粒序列，设计一对偏移引物。
这对引物分别位于未知区域的两侧，并有适当的长度和碱基组成。
3. 反向PCR扩增：将切割后的质粒DNA作为模板，使用偏移引物进行反向PCR扩增。
PCR反应的条件包括合适的温度和时间参数，以确保目标序列的高效扩增。
4. 凝胶电泳和提取扩增产物：将反向PCR扩增后的产物进行凝胶电泳分离，通过电泳结果可以确定未知区域的大小和存在与否。
然后，从凝胶中提取目标产物，以便进一步分析和测序。
5. 序列分析：用测序方法对扩增产物进行测序，以确定未知区域的序列。
通过反向PCR技术，研究人员可以获取目标质粒中未知区域的序列信息。
这对于研究质粒功能以及质粒在基因克隆和表达中的应用具有重要意义。
总结起来，反向PCR是一种重要的质粒分析技术，通过设计合适的引物和PCR反应条件，可以扩增和测序未知区域的序列。
这种技术在基因克隆、质粒分析和分子生物学研究中具有广泛的应用前景。
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤普通PCR1概述聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。
可看作生物体外的特殊DNA复制。
DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。
现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。
它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。
PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。
他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。
而现今所发展出来的PCR 则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。
Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。
此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。
随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。
Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
2 PCR原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在T aqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
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反向PCR技术原理和应用摘要：PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。
反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。
随着现代医学和分子生物学的飞速发展，该技术在各个领域都发挥着重要的作用。
关键词：反向PCR;原理;不足之处;应用反向PCR是一种多聚合酶链式反应（PCR）应用的方法，可使已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增。
用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于P CR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。
PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。
这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。
用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。
反向PCR所扩增的片段的大小由PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3-4 kb。
在许多情况下，首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。
能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板（依赖于引物）的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类型决定的接点（例如，互补突头连接与钝头连接）。
对于扩增左翼或右翼序列，初试时最好靠近识别多个碱基位点的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。
如果用反向PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入合适的酶切位点。
用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。
在一些实验中，为产生对反向PC R大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环化前需用Klenow或噬菌体T4 DNA聚合酶修理（钝化）。
连接前，需用酚或热变性使内切酶失活。
聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94℃-30秒变性，58℃-30秒引物退火，T aq聚合酶70℃延伸3分钟，进行30个循环。
可改变PCR条件以生产特异产物。
将反向P CR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。
1 反向PCR技术原理反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。
这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。
扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。
2 反向PCR技术不足之处该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。
这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。
②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。
3 应用3.1克隆慢病毒介导的转基因小鼠整合位点序列卵周隙显微注射慢病毒载体是制备转基因动物，尤其是转基因小鼠的一种新的方法。
它相对于传统的方法，如原核显微注射质粒载体等，具有外源基因整合率高、适用广等优点。
整合位点是外源基因表达的决定性因素之一。
当慢病毒介导的转基因动物拷贝数较少时，由于整合位点的不同将导致外源基因的表达呈多样化或高低不等。
因此，整合位点的分析对于深入探讨外源基因在转基因动物中的表达规律具有重要的意义。
转基因整合位点的研究通常应用染色体步移技术，而在众多染色体步移方法中，反向PCR是应用最早，也是最常用的方法之一。
反向PCR的过程是：选择在已知序列中没有酶切位点的限制性内切酶将基因组DNA完全酶解后，DNA片段在低浓度的体系中自连接形成环状分子，然后利用已知序列中反向的PCR引物扩增已知序列的旁侧序列。
张俊等获得了经测序的慢病毒介导的转基因小鼠整合位点序列信息，可结合外源基因拷贝数及外源基因的表达情况分析整合位点与外源基因表达之间的关系，为建立高表达的慢病毒介导的转基因小鼠的新品系提供科学数据和参考。
3.2 建立有效分离酵母人工染色体（YAC)末端的方法构建含有目的基因区域的精细物理图是基因克隆的前提。
建立物理图的主要途径是通过筛选酵母人工染色体(YAC)文库，建立互相重叠的YAC重叠群。
在建立YAC重叠群的过程中，一个很重要的工作就是分离YAC末端。
龚瑶琴等在构建11q13 YAC重叠群过程中，发现反向PCR用于YAC末端的分离较其它方法（Alu一载体PCR和锚定PCR等）有明显的优势。
经过反复试验和改进，建立了简便易行的用反向PCR分离YAC末端的方法。
3.3 扩增抗人宫颈癌单克隆抗体重链可变区基因单克隆抗体(mAb) V区cDNA序列的克降是构建单链抗体(ScFv)的关键一步。
通常是在抗体V区序列两头5’和3’端设计带简并碱基的引物，用普通PCR法进行扩增。
该法虽看似简单，但局限性很大，若遇到同源性差且复杂的序列，则难以获得。
同时，因带有简并碱基，可使PCR产物不纯，而影响蛋白的表达及其功能。
王莹等在构建抗人宫颈癌ScFv过程中，用常规PCR法扩增出V H cDNA序列．经多种方法尝试，均未获得V H cDNA序列。
随后，采用反向PCR技术扩增并测序，与GenBank的已知序列相比较，证明PCR扩增产物的测序结果确为V H cDNA序列，为重组制备ScFv奠定了基础。
3.4 扩增细菌热激蛋白HSP60基因HSP60属于热激蛋白家族。
热激蛋白广泛存在于真核生物细胞器及细菌中，其功能是帮助蛋白质肽链折叠成正确的构象。
当有机体受到理化刺激时．热激蛋白的表达会进一步增强。
由于热激蛋白的结构和功能保守，近年来，其分子序列常被用来研究生物的系统进化。
HSP60家族的所有成员，不论属于真核生物还是原核生物，其分子中均有两段、各八个氨基酸十分保守，分别是GDGTIATV和AVKAPGFGD。
如何从已知序列的核心区向上游和下游步移，是HSP60全基因克隆的中心问题。
经典的方法是利用鸟枪法构建基因组DNA文库．再用核心区作为探针筛选该基因文库，便可得到含有核心区及其上下游序列的克隆。
但该方法工作量大，效率也较低。
为了研究双歧杆菌及加德纳氏菌等有关细菌的系统进化，蹇文婴等在已获得HSP60基因核心区序列的基础上，采用反向PCR对3株双歧杆菌和1株加德纳氏菌的HSP60基因全序列进行了扩增、克隆和序列测定，结果证明，该方法可有效地扩增细菌的HSP60全基因序列。
3.5 扩增沙门菌第一类整合子旁翼基因序列整合子对细菌耐药性的介导作用，已经引起研究人员的广泛注意，尤其第一类整合子在耐药菌中分布最广泛，占有重要地位。
在以往研究中，对沙门菌第一类整合酶基因阳性菌株的指纹图谱及其检测方法都已有探讨，但是对第一类整合酶基因及耐药基因盒的调控序列研究报道却极少。
现已知，一个基因的表达在很大程度上是由它的旁侧序列调控的，克隆基因的旁侧序列已经成为分子生物学研究中的常规工作之一。
如何对细菌耐药基因盒的表达和整合酶基因进行调控，是控制细菌耐药性产生和传播的关键。
研究整合子的旁翼序列，使第一类整合子的结构可以更加清晰及明确，有助于进一步分析整合子的调控因子，控制细菌耐药基因的捕获和表达。
在测定已知基因片段的旁测基因序列方法上，常用的有染色体DNA步移、锚定引物PCR、加人衔接头等方法，其中应用染色体DNA步移的方法以其准确性高而常用。
反向PCR 技术可以对一个已知序列DNA的两侧未知序列进行扩增和研究，也称染色体步移。
该方法常用于检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，建立基因组步移文库及研究基因的上游调控元件，在分子生物学研究中有广泛应用。
3.6 HLA—AB分型HLA位于人类第6号染色体短臂6p21.3区域。
具有高度的多态性。
它在抗原识别和递呈、免疫应答与调控等方面，起着非常重要的作用，是影响造血干细胞移植成败和器官移植物长期存活的关键因素之一，其中HLA—A，B，DR的影响较大。
目前，常规采用血清学分型方法用于HLA-AB分型。
但是由于抗血清之间存在交叉反应性及高质量的抗血清较难得到，从而导致血清学分型结果不尽如人意，造成分型错误及空白较多。
冯明亮等研究采用反PCR-SSOP方法作HLA—A，B，DR分型，并用于移植前配型。
反向PCR—SSOP方法即通过5’端标记有生物素的特异引物扩增HLA—A，B第二，第三外显子高变区域。
再与根据这些高变区序列设计的交联于尼龙膜上的寡核苷酸探针杂交，可检测截至于1998年11月WHO序列文库中的A座位107个等位基因，B座位238个等位基因。
结果发现利用反向PCR - SSOP技术对所有样本分型均获成功,无假阳性和假阴性结果出现,可准确分辨A座位107 个等位基因,B座位238个等位基因和DR 座位251 个等位基因,UCLA室间质控细胞DNA分型结果与UCLA公布的测序结果一致,移植配型标本血清学结果HLA - A 错检率6. 4 % ,HLA - B错检率为7. 4 %。
2例白血病病人分别有一个HLA抗原血清学方法不能检出。
反向PCR—SSOP用于HLA基因分型是可靠的，充分体现反向PCR—SSOP方法快速、敏感、准确的特点。
该方法的建立，为HLA基因分型提供了一个极有价值的实验工具，值得在广大配型工作者中推广使用，尤其是在造血干细胞库的建立中。
有利于HI A分型结果的标准化。
4. 前景反向PCR有着自己独特的特点，虽然有不足之处，但它在各学科和各领域都有着重要的作用。
随着PCR技术和分子生物学的发展，它在各学科和各领域的作用将会越来越重要，应用也将会更加普遍。
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