第十二章实验动物胚胎工程技术

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三、胚胎性别控制 是畜牧业生物技术中一项重要的高新技术。这 项技术的应用可以使畜牧上大动物的繁殖按照人们 的意愿只生产同一性别动物，例如奶牛、奶羊等的 生产按照人们的意愿只生产母畜，可以显著提高奶 牛的繁殖效率，获得可观的经济效益。
供体母牛
受体母牛
超数排卵
同期发情处理
配种 发情
胚胎移植
受体公牛
收集受的新进展：
同一种属内的不同 品种品系可互相进行胚 胎移植。如近交系 C57BL/6J小鼠的胚胎可 移植到雌性封闭群ICR 的生殖管道内；日本大 耳白兔的胚胎可移植到 雌性新西兰兔的生殖管 道内。这一特点在畜牧 业很有价值，如为了加 快良种奶牛的繁殖，可 将良种奶牛的胚胎移植 到普通黄牛的生殖管道 内，借腹怀胎。
胚胎移植实现了优良性状个体的 繁育，如果我们能确定某个胚胎将发 育为非常理想的个体，那么有没有办 法让这样的一个胚胎一次性地繁育更 多的个体？
第三节 动物体细胞克隆技术
一、克隆的定义
克隆（Clone）是指一个细胞或个体通过无性 繁殖（不经过两性生殖细胞的结合）方式产生遗传 物质完全相同的一群细胞或一群个体。 无性繁殖在植物中很常见，如孢子生殖、出芽 生殖和分裂生殖；植物的根、茎、叶等经过压条、 扦插或嫁接等方式产生新个体。
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六、胚胎冷冻保存
指在低温（-196℃）条件下利用低温保护剂保 存生殖细胞及胚胎的一门技术。目前应用的低温保 护剂有二甲基亚砜（DMSO）、聚乙烯砒咯烷酮 (PVP)、甲醇、乙二醇、羟甲基淀粉（HES）等。
可以避免或减少结冰的程度与速度，降低细胞 周围未冻结溶液中的电解质浓度，从而避免或减少 胚胎冷冻过程中所发生的物理和化学损伤。 自1972年以来，世界各地已有小鼠、大鼠、田 鼠、兔、山羊、绵羊、牛、马、狒狒等20多种动物 的胚胎被成功地冷冻保存。
胚胎分割的最佳时期是受精卵发育到囊胚期， 用分割针将胚胎切开，吸出其中的半个胚胎，直接 移植给受体。
问 题
对囊胚期的胚胎进行分割时，为
什么要均等分割？
囊胚期的内细胞团将来要发育成胎儿的各种
组织，是胚胎本身的基础细胞。如果分割时不能
将内细胞团均等分割，会出现含内细胞团多的部
分正常发育的能力强，少的部分发育受阻或发育
关于动物无性繁殖的设想，吴承恩在《西游记》 中已有精彩的描述——孙悟空经常在紧要关头拔一 把猴毛变出一大群猴子，用今天的科学名词来说就 是孙悟空能迅速将自己身体的一部分克隆成自己， 用现在的理论来解释，就是通过对猴毛中含有的蛋 白质基因逆转录来进行克隆。
动物的克隆技术，经历了由胚胎细胞克隆动物 到由体细胞克隆动物的发展过程。
1.分离X精子与Y精子：流式细胞光度法
2.对胚胎进行鉴定以控制性别：在胚胎移植前对胚胎 的部分组织用染色体检查、间接免疫荧光法和PCR法 进行性别鉴定。其中PCR法具有高效、快速的特点。 3. 改变酸碱度：
酸性环境下X型精子活力强，碱性环境下Y型精 子活力强，如雌性动物喂食酸性饲料，子代雌性动物 可能性大，喂食偏碱性饲料，子代雄性动物可能性大 。同样原理，交配前用酸性溶液冲洗阴道，子代雌性 动物机会多；用碱性溶液冲洗阴道，子代雄性动物机 会多。
液 氮 罐
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胚胎冷冻保存技术的应用
（1）应用于实验动物的保种和珍稀或濒危动物种 质保存。 （2）应用于实验动物的长途运输。
（3）应用于实验动物的生物净化。 被病原体感染的实验动物的生物净化，一般采 用子宫切开术，取出胎仔由无菌动物或SPF动物代 乳。但是这种方法成功率并不高，而且较为麻烦。 通过胚胎冷冻、胚胎移植等技术，可以使生物净化 变得更简便和安全。
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以小鼠的超数排卵为例，成熟雌性小 鼠，中午12～13时用孕马妊娠血清（PMSG ）腹腔注射5单位/只。48小时后用人绒毛 膜促性腺激素（hCG）腹腔注射5单位/只， 进行超数排卵。
二、体外受精
体外受精是指成熟的精子与卵母细胞在体外环 境下完成受精的过程。 以小鼠为例： 1）进行超数排卵：PMSG和hCG注射 2）处死，取出输卵管壶腹部采集卵母细胞。将新 鲜采集的精子在培养液中培养1小时后，以适当的浓 度移入有卵母细胞的培养液滴中。如受精，4～5小 时后受精卵中可见明显的雄性原核，第二天受精卵 发育成二细胞胚胎。
在医学上对人类性别控制的研究也具有积极的 意义。有的遗传性疾病属于性连锁遗传，例如进行 性肌营养不良，为X连锁隐性遗传，男性发病，女 性携带异常基因但不发病。携带此致病基因的女性 怀孕后如做胚胎性别鉴定，可避免男性患儿出生。 正常情况下，法律禁止对胎儿性别进行控制！
性别控制技术主要有3种不同的途径：
四、胚胎培养:
胚胎培养是指将获得的未成熟的卵母细胞、受 精卵、冷冻保存胚胎在体外人工创造的环境中培养 成熟，并通过体外受精发育成各阶段的早期胚胎。 研究胚胎发育的环境和条件，揭示胚胎细胞的 生长发育和分化的奥秘。 但体外胚胎培养只能发育到受精卵的囊胚期， 然后必须移植到动物的子宫内。
五、胚胎移植 胚胎移植技术是胚胎工程技术的最后一步，体 外受精、胚胎分割、转基因动物、克隆动物等任何 一项生物技术所生产的胚胎，最终都必须移植到受 体动物的生殖管道一定部位，继续生长、发育、分 娩出生仔代动物。 显然，在同一物种动物之间进行胚胎移植更易 于成功。
小鼠解剖取输卵管
从输卵管壶腹部取卵母细胞/受精卵的方法 10
3.超数排卵： 在正常情况下，哺乳动物一次排卵数极其有限， 单胎动物一次排卵一枚，多胎动物如小鼠一次平均排 卵8～10枚，家兔一次平均排卵9枚。为了获得大量的 胚胎，可通过注射激素刺激卵巢大量排卵，常用激素 有促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和 孕马血清促性腺激素（PMSG）、孕酮和前列腺素（PG） 等，最常用的是前三种。 经超数排卵处理，动物卵巢大量的卵泡同时成熟 并排出，排卵数可增加几倍至十几倍，一次可获得大 量的卵细胞、受精卵或早期胚胎。
第二节 胚胎操作基本技术
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胚胎操作基本技术： 一、精子、卵母细胞、早期胚胎的采集和超数排卵
二、体外受精
三、胚胎性别控制
四、胚胎培养
五、胚胎移植 六、胚胎冷冻保存
一、精子、卵母细胞、早期胚胎的采集和超数排卵 是胚胎工程最基本的技术。胚胎工程的其他技术 均需从卵母细胞和受精卵的采集技术开始。 1.精子的采集 啮齿类小动物，如大、小鼠，可将动物处死后， 分离附睾尾部，用眼科剪子在顶端剪一小口，用手指 轻柔挤出浓稠的液滴，置培养液中培养。
第十二章 实验动物胚胎工程技术
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第一节 概
述
胚胎工程又称胚胎技术，是指利用生物工程学 的原理对动物的 胚胎 进行某种技术操作或改造，使 之获得人们所需要动物的一系列生物技术的总称。 胚胎工程主要分为四大体系： 第一类：胚胎操作基本技术， 包括超数排卵、精子 和卵母细胞的采集、体外受精、胚胎培养、胚胎的 冷冻保存、胚胎性别鉴定和胚胎移植技术； 第二类：动物克隆技术， 包括胚胎分割、细胞核移 植技术； 第三类：胚胎干细胞技术； 第四类：转基因技术。
不良，甚至不能发育等问题。所以要将内细胞团
均等分割。
分割的份数越多，操作的难度会越大，移植的 成功率也越低。目前多采用2分割与4分割技术。
胚胎移植——胚胎分割——？
（后代少） （后代多，但不能无 （更多） 限分割）
动物体细胞的形成不会像胚胎细胞那样受到时 间和数量的限制；而且同一个个体所有体细胞都具 有同样的遗传信息，因此，利用动物体细胞进行克 隆，可以复制出比胚胎分割数量更多的优良个体。 1.畜牧业育种； 2.克隆能够生产特殊医药蛋白的转基因动物。
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问题2：
怎样才能使供体母牛和受体母牛具备相同或相 似的子宫内生理环境？ 同期发情处理，使胚胎移植中的供体和受体几 乎同步性的出现卵泡期、排卵期和黄体生成期，这 样才能使两者体内的子宫内膜的状态、各种激素水 平都具有一致性，保证移植后的胚胎具有最合适的 发育环境，是胚胎移植成功的基本条件。
注射孕激素等，延长黄体期，抑制卵泡发育; 前列腺素，溶解黄体，促使卵巢进入卵泡期。
体外受精不仅是研究受精及早期胚胎发生的重 要手段，而且广泛应用于人类生殖障碍、家畜品种 改良等方面。 试管婴儿：若夫妇两人，生殖细胞能正常产生，但 就是生不出孩子——怎么办？ 把卵子和精子都拿到体外来，让它们在体外人 工控制的环境中完成受精过程，然后把受精卵移植 到女性的子宫中，在子宫中孕育成为胚胎。
大动物，如犬的精液采集可采用生物电刺激方法 促进雄性射精，收集精液。
解剖取附睾尾部
精子的获取和培养
2.卵母细胞的采集
从哺乳动物获得成熟的卵母细胞，主要途径有两条： 获取体内成熟并排到输卵管中的卵母细胞，需处死动物或 通过外科手术；如果已交配，获取的是受精卵或早期胚胎。 从刚死亡的雌性动物卵巢中分离卵母细胞，体外培养。
3.利用个体克隆技术可以研究细胞发育过程中不同 基因的表达规律和调节控制机理, 4.利用动物克隆技术可以获得足够量的动物器官， 用于人类器官移植。
5.延缓珍稀野生濒危动物的灭绝。
相对于通过胚胎分割克隆动物，通过细胞核移植 来克隆动物，意义更大，因为生物的遗传信息DNA， 主要存在于细胞核内，可以通过技术手段（显微操作 技术）将一个动物的细胞核移植到另一个去核的动物 细胞中，再通过胚胎移植，使之发育成个体。整个过 程没有经过精子和卵子的受精，核移植动物的全部遗 传信息来自供体核细胞，等于是复制了提供细胞核的 动物。
（4）应用于实验动物育种和野生动物实验动物化。
胚胎克隆技术、体细胞克隆技术结合胚胎冷冻 技术，已经应用于实验动物和其他动物的育种，可 以缩短育种时间，可以克服野生动物进入实验室后 因环境改变而交配困难，可以利用极少量的原种繁 殖出大量的后代，可以克服杂交障碍而实现基因的 种间转移(如转基因动物等)。