第六章：以大肠杆菌为宿主的克隆载体
大肠杆菌克隆载体
Cos质粒载体的优点：
◇容量大（可达45 kb），用于基因簇的克隆 ◇具有λ噬菌体的特性，形成的重组DNA分子
可进行体外包装，并能感染E.coli细胞（在
细胞内不能形成子代噬菌体颗粒，因而不能 形成噬菌斑） ◇具有质粒的特性，操作简便 ◇对重组DNA分子长度具有选择性包装 （30～45kb）
cos位点
2. λDNA作载体的优缺点和解决办法
优点：
◇λDNA进入细菌细胞容易 ◇由于λ能裂解宿主细胞，因此提取
DNA或基因表达产物都比较容易 ◇用λ噬菌体颗粒包装的DNA易于长期
保存
缺点及解决措施 ：
◇λ头部只能容纳自身DNA的78-105%，即 38～51 Kb，天然λ仅可插入2.5Kb外源DNA 片段——除去所有与λ裂解无关的基因和空白 区
是在pBR322基础上衍生出来的一 系列质粒载体
pUC质粒载体的优点:
◇具有更小的分子量和更高的拷贝数 （2.7kb, 500~700 copies/cell）
◇适用于组织化学法检测重组体，一步 实现对阳性克隆的鉴定
◇具有多克隆位点区（MCS）
Common plasmid vectors can carry up to 15kb foreign DNA
3）整合质粒： 含有整合酶编码基因和特异性整合位点序列，
克隆在整合质粒上的外源基因进入受体细胞 后，准确重组整合在染色体的特定位置上。
4）穿梭质粒 a) 分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构
及相应选择标记基因，因此能在两种不同种属 的受体中复制并检测。
大肠杆菌---链酶素穿梭质粒，大肠杆菌---酵 母菌穿梭质粒。
b) 克隆在穿梭质粒上的外源基因不用更换载 体直接从一个受体菌转移至另一个受体菌中复 制并遗传。
大肠杆菌克隆表达人类基因的注意事项
大肠杆菌克隆表达人类基因的注意事项大肠杆菌是常用的真核表达系统之一，具有优点如易于培养、遗传稳定和高表达水平等。
在进行大肠杆菌克隆表达人类基因的过程中，需要注意以下几个方面：1.选择合适的质粒载体：质粒载体是将目标基因插入宿主细胞中的工具。
选择具有致密复制位点和特定启动子的质粒，可以提高基因的稳定性和表达水平。
一般建议选择常用的表达载体，如pET系列、pGEX系列等。
2.制备合适的基因片段：将人类基因转入大肠杆菌前，需要利用PCR或其他方法从人类细胞中扩增得到基因片段。
合理设计引物，包含适当的启动子和终止子序列，避免产生GC丰富的片段，以免影响大肠杆菌的转化和表达效率。
3.优化启动子和终止子：为了提高目标基因的表达水平，可以选择合适的启动子和终止子来调控基因的转录和翻译。
常用的启动子包括T7、lac、trp等，终止子一般选择T7终止子。
4.确定正确的大肠杆菌菌株：大肠杆菌有多个常用的表达菌株，如BL21(DE3)、XL1-Blue、TOP10等。
根据实验要求选择合适的菌株，包括产蛋白质的溶解度、转化和表达效率、内毒素含量等因素。
5.优化诱导条件：为了获得最佳的基因表达效果，需要优化诱导条件。
常用的诱导剂有IPTG、Lactose等。
优化诱导时间、温度和诱导剂浓度等条件，可根据目标蛋白的特性进行调整。
6.加入相关辅助单元：在大肠杆菌中表达人类基因时，可能需要加入辅助单元，如信号肽序列、标签序列、分泌酶等。
信号肽序列可以帮助蛋白质定位和转运，标签序列如His-tag、GST-tag可以辅助蛋白质纯化和检测。
7.注意避免内毒素产生：大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，其细胞壁含有内毒素。
内毒素可引起细胞毒性和炎症反应，影响目标蛋白的纯化和性质。
因此，在表达人类基因时，需要注意控制内毒素的产生，如选择低内毒素菌株、减少诱导剂的使用量等。
8.合理的蛋白质纯化策略：在成功表达目标蛋白后，需要进行蛋白质的纯化。
根据蛋白质的性质，选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
大肠杆菌克隆载体
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
pBR322质粒载体的优点:
◇具有较小的分子量
(经验表明,为避免在DNA纯化过程中发生链的断裂,克 隆载体的分子大小最好不要超过10kb)
◇具有两种抗生素的遗传标记基因, 易于选择 重组DNA分子 ◇具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后， 每个细胞中可累积1000～3000个拷贝
3）整合质粒： 含有整合酶编码基因和特异性整合位点序列，
克隆在整合质粒上的外源基因进入受体细胞 后，准确重组整合在染色体的特定位置上。
4）穿梭质粒 a) 分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构
及相应选择标记基因，因此能在两种不同种属 的受体中复制并检测。
大肠杆菌---链酶素穿梭质粒，大肠杆菌---酵 母菌穿梭质粒。
质 粒 载 体 克 隆 的 一 般 步 骤
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3．质粒的分类及用途
1）克隆质粒： 用于克隆和扩增外源基因。 2） 测序质粒： a) 高拷贝复制，便于DNA片段克隆和扩增。 b) 含多酶切口的接头片段，在接头片段两端邻近
区域，设有两个不同的引物序列，重组质粒变性 后即可测序。
报告基因才能表达。 e) 表达量的大小直接反应被克隆基因的表达调控元件
的强弱。
6）表达质粒 a) 在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转
录效率较高的启动子，合适的核糖体结合位点 （SD 序列），终止子结构。使得克隆在合适位 点上的任何外源基因都可在受体细胞中,高效表 达。
b) 大肠杆菌常用启动子：Lac, Tac, Trp 和来自 噬菌体强启动子 PL, PR 。它们由大肠杆菌 RNA 聚合酶识结构及特征的两种不同质粒不
能稳定地存在于同一受体细胞内，这种现象称质 粒的不相容性。 a) 两种不同质粒同时进入受体细胞，两者复制的 起始频率随机. b) 分裂前夕的拷贝数不均等，经过若干次细胞分 裂后必然导致，两种不同质粒的独占性。
第六章 重组DNA导入受体细胞
根据基因转移方法的特性，重组DNA导入受体细胞的 方法有以下几种： •转化：将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体细菌遗传 性状发生改变的方法； •转染：将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法（磷 酸钙沉淀法与体外包装法）； •微注射技术：将外源基因直接注射到真核细胞内的方法； •电转化法 •基因枪技术：又称微弹技术或高速离子轰击法； •脂质体介导法 •其他方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法。
CaCl2使细菌发生休克后，立即进行转化（E.coli X1776
可长期冷藏，并保持其摄取DNA的能力）。 也可以采用Rb+、Mn2+、K+、二甲基亚砜、二流苏糖
醇（DTT）等制备感受态细胞。
CaCl2制备感受态细胞的一般过程：
•E.coli 接种于LB agar培养基，37℃培养一晚；
•挑选3-5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37 ℃振摇培 养一晚后，在A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为对 数生长期）；
以病毒（噬菌体）为载体，转染宿主细胞的方法主 要有磷酸钙沉淀法和体外包装转染法。 一、磷酸钙沉淀法
磷酸钙沉淀法（磷酸钙-DNA共沉淀法），它能把外 源基因与λ噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物 细胞，但转染效率仍不如体外包装法。
细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA（吞噬DNA-磷酸 钙复合颗粒）的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这 种方法导入细胞。
第六章重组dna导入受体细胞????????????外源基因与载体在体外连接成重组体dna分子后需要将其导入受体细胞进行扩增和筛选得到大量单一的重组体分子这就是外源基因的无性繁殖即
第六章 重组DNA导入受体细胞
内容提要
•克隆与导入方法 •转化 •转染 •共转化 •电转化 •基因枪法 •微注射技术 •脂质体导入法 •转化酵母菌 •植物细胞的基因转移方法 •哺乳动物细胞基因导入法 •反转录病毒载体的转染
大肠杆菌R基因克隆载体的构建与鉴定
大肠杆菌R基因克隆载体的构建与鉴定[摘要]DNA的重组与转化是分子生物学的基本实验操作。
本实验可分为质粒DNA提取与鉴定，目的片段扩增与鉴定，DNA重组与转化三部分。
本次实验可以全面提高学生的实验技能与逻辑思维，对于分子实验技能的培养具有重要意义。
[关键词]DNA重组；转化；分子实验基本操作大肠埃希氏菌是常用的实验菌种，其质粒R-pGEX-4T-1为人工设计，已加入R目的基因片段。
现需要将R基因转到pMD18-T Simple Vector载体质粒上，并将目标质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，并检验转化效率。
1材料与方法1.1 材料1.1.1菌株及质粒 E. coli DH5α；R-pGEX-4T-1质粒；pMD 18-T载体。
1.1.2 主要试剂和仪器溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，TE缓冲液，0.5M EDTA，5*TBE，氯仿:异戊醇（V:V，24:1），70%乙醇，50mg/mL Carb，10*loading-buffer，2.5mmol/L dNTP混合物，Taq酶，DNA模板，引物对，10*PCR buffer，50*TAE，0.1M CaCl2溶液，LB固体/液体培养基，5 mg/ml Tet，34 mg/ml Cam，3 M NaAC，10 mg/mL X - gal，200 mg/mL IPTG（以上常规试剂全部按照《分子生物学实验指导》要求配制）；恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅，凝胶成像仪，琼脂糖凝胶电泳系统，PCR热循环仪，低温离心机，超净工作台。
1.2 方法1.2.1 质粒DNA提取向含Carb（100μg/mL）的LB液体培养基中接入含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
质粒DNA用碱裂解法制备，具体步骤参照《分子生物学实验指南》。
用1％琼脂糖凝胶电泳验证质粒提取结果。
1.2.2 质粒DNA双酶切及鉴定运用XhoⅠ酶与EcoRⅠ酶对上述步骤中提取的质粒R-pGEX-4T-1进行双酶切，酶切反应体系参见表1（如下），37℃反应1.5小时。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。
4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。
②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。
③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。
5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。
如何构建一个大肠杆菌高效表达的分子克隆
如何构建一个大肠杆菌高效表达的分子克隆？影响基因在大肠杆菌中表达的因素是多方面的，以下我就从载体选择、启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数、表达产物的稳定性、受体细胞代谢等方面说明构建大肠杆菌高效表达的方法。
一、表达载体表达载体应具有以下条件：1、能够独立复制。
根据载体复制的特点，可分为严谨型和松弛型。
严谨型载体伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主中拷贝数很少（1~3个）；松弛型的复制而不依赖于宿主染色体，在宿主细胞中的拷贝数可多达3000个。
2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。
而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。
3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。
4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。
阻遏子的阻遏作用可由物理（如温度）、化学（如IPTG、IAA等）因素进行调节，这样可人为地选择启动子启动转录mRNA的时机。
因外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖。
而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。
例如可使宿主细胞快速生长增殖到相当量，再通过瞬时消除阻遏，使所表达的蛋白质在短时间内大量积累，同时可减少表达产物的降解。
5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。
同时强终止子所产生的mRNA较为稳定。
诱导表达时，由于强终止子所致的高水平转录反过来会影响质粒DNA自身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象。
因此在外源基因的下游安置强终止子可以克服由质粒转录引起的质粒不稳定。
6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。
二、启动子启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。
启动子是在转录水平上影响基因表达。
转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。
基因工程原理练习题及答案
基因工程原理练习题及其答案一、填空题1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。
2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。
3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。
4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。
5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。
6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。
7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。
8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。
9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。
10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。
11．EDTA是____________离子螯合剂。
12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。
13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。
14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。
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个EcoRI切点，但它既不在ampR,也不在tetR基因里） 2）第三个用作选择标记的抗生素抗性基因。
pAT153和pBR327
• pAT153和pBR327都是多拷贝质粒 • 这两种质粒均来自pBR322，在构建时，并非关系
pGEM3Z载体也含有ampR 和lacZ基因,并且在lacZ基因内 部有一个限制性内切酶位点，此外pGEM3Z载体中限制性 内切酶位点两边还多了两个短片段，每一个片段都可充当 启动子，可附着RNA聚合酶进行转录。外源DNA在限制 性内切酶位点被导入pGEM3Z载体后，重组后的pGEM3Z 质粒和提纯的RNA聚合酶在试管中可实现RNA的转录。 pGEM3Z质粒携带的启动子并不是被大肠杆菌RNA聚合酶 识别的标准启动子，而是被T7噬菌体编码的RNA聚合酶 及SP6噬菌体编码的RNA聚合酶专一识别，因此体外RNA 合成系统选择的是病毒RNA聚合酶。
（3）酵母人工染色体载体（YAC） （4）细菌人工染色体载体（BAC） （5）其他载体
在细菌质粒、细菌噬菌体载体、细菌人工染色体载体（BAC） 中，有许多是以大肠杆菌为宿主（寄主或受体）的载体。 如：细菌质粒中的：1、pBR322、 2、pBR325、pBR327
3、pUC质粒、4、pGEM3Z、5、pCAMBIA1391、 pCAMBIA1300 细菌噬菌体载体中的：
第六章 大肠杆菌的克隆载体
---以 E.coli 作为宿主（受体）的克隆载体
第二章中我们已经介绍了 克隆载体的种类及特性：
（1）质粒（plasmid）载体（又可分为：克隆载体、 中间载体、穿梭载体和表达载体）
（2）噬菌体（phage）载体 A、λ —噬菌体 B、考斯质粒（粘性质粒）（cosmid) C、M13—DNA（单链丝状噬菌体）
6.1.1 质粒克隆载体的命名
• pBR322这个名字符合载体命名法的标准规则。 • —“p” plasmid的首字母，说明是一个质粒。 • —“BR”指组建这个质粒的实验室（ BR代表了两
个构建人的名字：Bolivar和Rodriguez）。 • —“322”是将该质粒与同一个实验室中发展的其
它质粒区分开的编号（比如还有pBR325， pBR327，pBR328等）。
3)、 pBR322的拷贝数很多
一般，在一个转化的E.coli细胞中有大约15个质 粒DNA分子，这个数目可以通过使用一种蛋白质 合成抑制物，如氯霉素（chloramphenicol）而 增加到1000-3000个。因此，一次E.coli培养就 可提供大量的重组pBR322分子。
6.1.3
6.1.3 pBR322的家谱：
8类似，pUC18和pUC19也来自于pBR322，优点： • ColE1复制起点，松弛性，高拷贝，Rop基因（控制拷贝数
的基因）突变，松弛性更强。 • Amp(R) • 在MCS（多克隆位点）处，pUC18和pUC19具有更多种类
的常用内切酶位点。 • －互补（在MCS中插入外源片段后，可通过—互补作用
pBR322由3个在自然界存在的天然质粒拼接而成。
• R1（ampR）：抗生素耐药性质粒R1， • R6-5（TetR）：抗生素耐药性质粒R6-5， • pMB1（复制起点）：ColE1菌株中生产大肠杆
菌素的质粒。 • pBR322的详细建造过程见图6-2a。
6.1.4
6.1.4 其他典型的大肠杆菌 质粒克隆载体
质粒载体的基因和物理图分析
（以pBR322为例）
6.1.2
6.1.2 pBR322的优点：
• 1、具有较小的相对分子质量：只有4363bp（一个克 隆载体的大小应该小于10kb）。
• 2、两个抗生素抗性选择标记基因（ampR和TetR）， 而且每个抗性基因内都有限制性单酶切位点，可导致 抗性基因插入失活。
2)、两个抗生素抗性基因
pBR322的第二个特征是它携带氨苄青霉素和四环素两个抗生素抗 性基因。我们可以利用氨苄青霉素或四环素作为含有这种质粒的 细胞标记。在这两个基因里，只要有一个限制性酶切位点，就可 以被克隆实验所用。实际上在pBR322质粒载体中的两个抗生素 抗性基因编码区存在许多限制性内切酶位点: PstI、PvuI和ScaI 位于氨苄青霉素编码区，Sal I、 Eag I 、BamHI和HindIII等则 位于四环素编码区，将pBR322用限制性内切酶PstI、PvuI或 ScaI切开后，加入一个新的DNA-片段，ampR基因就失去活性。 如果我们用位于TetR抗性基因编码区中存在的任一种限制性内切 酶（特别是BamHI或HindIII）处理，对四环素的抗性也就消失。 这样，许多不同的限制性位点可用作DNA-片段插入位置，根据 抗性基因失活进行筛选；并且，还可以在pBR322中克隆具有各 种不同粘性末端（8种酶中的任一种）的DNA-片段。
6.2
6.2 基于M13 噬菌体的克隆载体
噬菌体的DNA分子携带较多的复制必须的 基因，包括噬菌体蛋白质衣壳组成部分和噬菌 体专性复制酶的基因。如果这些基因中的任何 一个改变或缺失，就防碍或破坏噬菌体DNA分 子的复制能力。因此，噬菌体的DNA分子可被 改变的余地就很小（噬菌体克隆载体一般与原 始的噬菌体分子的区别就很小）。
6.1 以大肠杆菌质粒为基础的质粒克隆载体
• DNA克隆中使用最多的、最简单的克隆载体是由小 的细菌质粒演化来的。
• 利用E.coli作为宿主的质粒载体种类很多。 • 它们具有许多有用的特性：容易提取、转化效率高、
携带筛选标记（转化体和重组体） ，还可用它来克 隆很大的DNA-片段（达8kb）。这样的载体在大多 数常规克隆实验中都会使用。 • pBR322是最早被构建至今仍被广泛使用的载体。
在总的拷贝数上前两者为30-45个分子。这个特性对质粒产量没 有多大意义，因为对所有这三种质粒来说，通过扩增其拷贝数可 提高到1000个。在正常细胞中的较高的拷贝数利于在实验室中研 究克隆基因的功能。这种情况下，基因量（gendosis）很重要， 因为拷贝数越高，实验中克隆基因对宿主细胞的影响作用越容易 观察到。对此类研究，pAT153和pBR327就比pBR322更合适。 • 在pAT153和pBR327中pBR322的连接特性被破坏了。
λ噬菌体载体（lambda phage vector) 丝状噬菌体：M13等 本章将列举几个具有代表性的以大肠杆菌为宿主的载体，详细介 绍大肠杆菌的克隆载体（pBR-和pUC-系列，M13和λ—噬菌体 载体）的结构、特征、来源、命名以及这些载体的特殊用途。
6.1 以大肠杆菌质粒为基础的质粒克隆载体
6.1.1 质粒克隆载体的命名 6.1.2 pBR322的优点 6.1.3 pBR322的家谱 6.1.4 其他典型的大肠杆菌质粒克隆载体
6.2 基于M13 噬菌体的克隆载体
6.2.1 M13mp2克隆载体的构建 6.2.2 M13mp7 ---另一种具有对称的克隆位点的简单的克隆载体 6.2.3 其它M13系列载体 6.2.4 质粒和M13的杂交载体
pAT153和pBR327成为非接合性质粒，不能转移到其它的 E.coli细胞中。这对生物的安全有意义，这一特性可避免重组的 pAT153和pBR327分子从试管中泄漏，而侵入到工作马虎的分子 生物学工作者的肠道菌群里去。与此相反，pBR322理论上可以 通过连接转移到E.coli的自然种群里，实际上，这种质粒也具有 保护功能，使这种转移过程成为不可能。因此如果某个克隆基因 在发生事故时会有危险，还是最好使用pAT153和pBR327。
6.3 λ-细菌噬菌体克隆载体
6.3.1 λ细菌噬菌体基因组结构分析 6.3.2 通过自然选择可以分离出缺少一定的限制性位点的λ-噬菌体 6.3.3 插入载体（insertion）和置换载体（substitution vector） 6.3.4 使用λ-插入载体或者置换载体进行的克隆实验 6.3.5 柯斯质粒载体(cosmid vect位点。组建这两个 质粒时，pBR322的一大段被切去，在pAT153里 切掉了705bp，而在pBR327则切掉了1089 bp。 ampR和tetR则完整保留着。但质粒的复制特征和 连接特征发生了变化。
pAT153、pBR327与pBR322的区别：
pAT153和pBR327与pBR322有两方面的区别： • pAT153和pBR327的拷贝数都多于pBR322
pUC8具有两个优点：
• 首先，可以将含有重组pUC8分子的E.coli细胞在含氨 苄青霉素和X-Gal的琼脂糖板上只需一步就可识别出来。 如果用介绍过的其它载体则需要两个步骤：例如，如 果用pBR322，就必须将复制板从一个含抗生素的基质 转到含另一种抗生素的基质上。找出在新的基质上不
生长的对应的菌落即是含有重组质粒的菌落。
pBR325
pBR325 具有三个可选择的标记
• pBR325很明显地是一个具有附加DNA-片段的 pBR322质粒，这个片段含有一个氯霉素-乙酰转移酶 （CAT），它可以使氯霉素失活，使质粒具有抗氯霉 素抗性。在这个质粒中CAT-基因中有唯一的一个 EcoRI切点。如果用这个切点进行克隆，就可根据对 氯霉素抗性的丧失来识别重组体。
• 3、相当高的拷贝数：通常在被转化的E.coli中有大约 15个pBR322质粒分子，而且在氯霉素存在下，经过 扩增每个细胞中拷贝数可达1000-3000个。
1)、 pBR322的大小
pBR322长4363bp，一般情况下，一个克隆载 体的长度应小于10kb，才能在纯化过程中不会 断裂。长度为4363bp的pBR322有利于我们很 容易地分离它，而且用它组建的重组DNA-分 子也容易分离。即使要插入的DNA 有6kb长， 这个重组的pBR322分子也在允许的范围之内。
在pBR322基础上切掉了705bp
(3273bp)
在pBR322基础上切掉了1089 bp