大肠杆菌分子克隆载体
基因在大肠杆菌中表达的实验流程
为了让一个基因在Escherichia大肠杆菌中做它的事情，我们首先要做的就是创造一个超冷的表达矢量。
这个矢量需要有一个涡轮充电的促
进器来恢复基因的表达，同时需要有一个ribosome绑定的站点（RBS）来确保基因像老板一样被翻译出来。
嘿，我们不能忘记一个
选择标记，像抗生素抗体基因，所以我们可以挑出细菌已经提取了
载体。
塞恩斯是真正有趣的部分——我们利用一些精致的分子克隆技术，把感兴趣的基因弹入载体中，比如用限制酶切开，然后像一个基
因谜题一样将其重新粘合起来。
对于一些细菌生物学刺激来说如何？
将表达矢量组合起来后，要通过变换等过程，将其粘入E。
coli细胞。
你用正确的抗生素将转化出来的细菌生长在藻类板上。
这使得只有
具有表达载体的细菌才能存活。
一旦你选择了细菌，你就抓住一个单
一的聚落，用它开始一个液体培养。
你让培养物生长到有很多细胞，
然后你可以打开你感兴趣的基因。
E。
coli基因表达的诱导是推进基因研究和生物技术创新的关键步骤。
必须根据表达矢量中使用的具体促进器，仔细选择适当的诱导器，因
为各种促导器对不同的诱导器表现出不同的反应。
在加入诱导物后，
培养物会受到指定孵化期的制约，以方便被利益基因编码的蛋白质的
合成。
在诱导过程之后，细菌被收获，通过SDS—PAGE，西部布局，酶活性测定等方法，彻底检查基因表达水平。
这些精心规划和执行的
实验使研究人员能够全面评估E。
大肠杆菌蛋白质产量的定量和定性方
面，从而为遗传工程和工业生物技术领域今后的研究和政策决定提供信息。
基因工程第三章分子克隆载体
2、可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复
制。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型
质粒拷贝数较多，可达几百。
严谨控制型 拷贝数少，一般<10个，分子量大；
松弛控制型 拷贝数多，10-200个，分子量小；
复制受限，受细菌宿主DNA复制系 统的控制；
复制不受细菌DNA复制系统限制， 当宿主蛋白质合成受抑制时（如培 养中加入抗生素时），其拷贝数可 猛增至1000-3000之多，该性质对 基因工程技术十分有利。
7、载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段。
第一节 质粒载体
一、质粒的基本特性
质粒(plasmid)：是 独立于许多细菌及某些 真核细胞染色体外共价 闭合环状的DNA分子， 能独立复制的最小遗传 单位，大小在1—200kb 之间。和病毒不同，它们 没有衣壳蛋白（裸DNA）。
绝大多数质粒DNA是双链环形，它具有3种不同的构型:
来自pSCl01的 四环素抗性基因 Tetr
来自RSF2124的 氨苄青霉素抗性基 因Ampr。
特点
1. 具有多个单一的限制性内切酶位点。
2. Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点 （G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。
3. 利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯 霉素使质粒拷贝数进一步扩增。
基因工程
第三章 分子克隆载体
商丘师范学院 马原松
பைடு நூலகம்
第三章 分子克隆载体
教学目的和要求:本章主要阐明用于核酸操作的各种载体: 质粒载体、噬菌体载体和单链丝状噬菌体载体等。通过 本章的学习要求学生了解质粒的基本特性，λ噬菌体的 分子生物学，穿梭载体、整合载体、解离载体等其它载 体；理解大肠杆菌表达载体；掌握质粒载体的工作原理， 噬菌体载体种类及工作原理，粘粒载体、噬菌粒载体的 工作原理。 重点、难点：质粒载体、噬菌体载体的种类和工作原理。 教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等
载体的构建
基因工程所用的克隆载体常称之为分子克隆载体（molecular cloning vector），它是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。
如果打一个十分浅显的比喻，分子克隆载体犹如航天技术中的运载火箭，外源DNA分子就如火箭上搭载的卫星，宿主细胞则如外部深邃的空间。
分子克隆载体的主要功能就是将外源基因携带入宿主细胞，并在宿主细胞中进行DNA扩增和使外源基因得以高效表达。
在这一点上又与火箭不一样，因为火箭在运载卫星的过程中分级脱落和烧毁。
尽管克隆载体是由DNA分子所构成，但与宿主细胞的染色体DNA分子相比，它们一般都比较小。
比如常用的质粒载体多数都在10 kb以下，而常用的噬菌体载体，一般都在20 kb 左右。
我们知道，大肠杆菌的染色体DNA是4200kb。
正是由于克隆载体的分子量比较小，在操作过程中不会造成载体DNA分子的断裂，而大分子的DNA容易在操作中发生断裂。
克隆载体的基本结构和功能在短短的20年间，用于不同生物和不同目的的分子克隆载体至少也有好几千种，那么它们应该有些什么样的基本结构呢？经过仔细分析发现，所有的分子克隆载体都具备了以下3个最基本的结构：1）至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制；2）至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入；3）至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA 分子是否进入宿主细胞。
既然说每一个载体至少应有一个复制起点，一个克隆位点和一个标记基因，那么一个载体可否有多个复制起点，多个克隆位点和多个标记基因呢？答案是肯定的。
不过，我们还是先看看载体中的三个基本结构克隆载体的复制起点由于DNA的复制是始于复制起点的，因此只要一个DNA分子有了复制起点，那么这个DNA分子就可以自主复制。
如果一个分子克隆载体有了复制起点，那么该载体就可以在某种生物的细胞中自主复制，因此这个载体就可以多拷贝地存在于某种细胞内。
多拷贝DNA有两个好处：一是可以用于大量制备克隆载体DNA分子，以利于外源基因的克隆，这样可大大减少工作量；二是如果载体中插入了外源基因，那么外源基因的拷贝数也就大量增加了，这就有利于大量地表达外源基因，从而获得大量的基因表达产物，这也正是基因工程的目的之一。
分子克隆技术的使用方法
分子克隆技术的使用方法分子克隆技术是在分子生物学领域中最常用的一种实验方法，它可以帮助研究人员复制并分离出特定的DNA序列，用于进一步研究和应用。
分子克隆技术的使用方法主要包括DNA提取、限制性内切酶切割、连接反应、转化和筛选等步骤。
下面将对这些步骤逐一进行介绍。
首先，DNA提取是分子克隆技术的第一步，它的目的是从样品（例如细菌、植物或动物组织）中提取出目标DNA。
提取方法主要有酚/氯仿法、盐法和商用DNA提取试剂盒等。
在提取过程中，我们需要将样品细胞破裂，并通过使用蛋白酶分解蛋白质，最后通过乙酸盐、异丙醇等溶剂沉淀目标DNA。
其次，限制性内切酶是分子克隆技术中的关键工具，它能够识别并切割DNA 的特定序列。
在实验中，我们选择与目标DNA序列相匹配的限制性内切酶，将其与目标DNA一起反应，酶可以精确切割DNA链，产生特定的末端序列。
这样的切割可以生成需要的DNA片段用于后续的连接反应。
连接反应是分子克隆技术的核心步骤，通过该步骤可以将目标DNA片段与载体DNA连接起来。
通常情况下，载体DNA是一种循环的DNA分子，如质粒或噬菌体。
在连接反应中，我们需要将目标DNA片段与已经经过限制性内切酶切割处理的载体DNA进行连接。
连接反应可以使用DNA连接酶和缓冲液，在适当的温度下进行反应。
连接反应的最终产物是重组载体，内含目标DNA的插入片段。
然后，转化是将重组载体导入到宿主细胞中的过程。
对于大多数分子克隆实验来说，大肠杆菌是最常见的宿主细胞。
在转化过程中，我们需要将重组载体与宿主细胞共同处理，使其能够进入细胞内。
转化方法主要有热激、电击和化学法等。
通过转化，重组载体可以复制并表达其携带的目标DNA片段。
最后，筛选是分子克隆技术中的关键步骤，它可以确定是否成功克隆了目标DNA片段。
筛选依赖于所克隆目标的特性和选择的标记方法。
常用的筛选方法包括酶切鉴定、PCR扩增、限制性酶切图谱分析以及DNA序列分析等。
这些方法可以帮助我们鉴定和验证克隆的目标DNA片段是否符合预期。
分子克隆实验
分子克隆技术实验报告姓名：班级：学号：指导老师：pUC19外源1.5kbDNA片段亚克隆于pUC1301摘要：分别从大肠杆菌菌液中提取质粒pUC19和pUC1301，两种质粒都使用Bam HI+Kpn I两种限制性内切酶进行切割。
回收pUC1301质粒中1.5kb片段，使用连接酶将它与切开的pUC19连接，转化感受态大肠杆菌，利用标记基因amp r、kan r和α—互补筛选阳性克隆。
实验获得了很好的酶切效果，但最后没有筛选出阳性克隆。
关键词：pUC19、pUC1301、亚克隆、限制性内切酶、感受态1前言初始克隆中的外源DNA片段往往较大，含有许多目的基因以外的片段，在诸如表达、序列标签和突变等操作中不变进行，因此必须将目的基因所对应的小片段DNA找出来，这个过程叫做亚克隆。
本实验是将pU1301中一段来自水稻1.5kb的片段亚克隆到pUC19上。
首先需要提取所需的质粒。
在大肠杆菌中质粒又大又小、拷贝数又多又要少，因此分离的方法也多种多样。
在实践中最常见的是通过将裂解法提取高拷贝的小质粒以及基于此方法的纯化技术，其他方法还有试剂盒分离纯化等，本实验通过试剂盒分离纯化E.coil质粒DNA。
将质粒提取出来后需要检测所获质粒的质量，方法有吸光值检测、凝胶电泳检测等。
要获得目的片段然后亚克隆与其他载体上，需使用两种工具酶：限制性内切酶、连接酶。
限制性酶切酶主要有三类，目前使用最多的是Ⅱ型。
限制性内切酶的使用需要在合适的条件下，当条件不合适时往往会出现星星活性。
限制性内切酶产生的黏性末端将导致载体自连，为了防止其自连，可以使用双酶切、去磷酸化、末端补平等方法。
连接酶是将两段核酸连接起来的酶，常用的有T4DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、TaqDNA连接酶、T4RNA连接酶。
目的片段和载体在连接酶作用下连接成一个整体，需借助一定方法导入受体细胞，首先需要制备感受态细胞，这类细胞处在易吸收外源DNA 条件下，然后通过电转化、CaCl2转化法将外源DNA导入受体细胞。
escherichia coli k12过表达 -回复
escherichia coli k12过表达-回复如何在大肠杆菌K12中过表达目标蛋白。
引言：大肠杆菌(K12)是常见的实验室模型菌株之一，广泛应用于分子生物学和生物工程研究领域。
过表达外源蛋白是研究蛋白功能和生物过程的重要手段之一。
本文将介绍如何在大肠杆菌K12中进行过表达，并提供详细的步骤和相关技术。
第一部分：构建过表达载体1. 选择合适的表达载体：选择适合大肠杆菌K12的表达载体，常见的包括pET系列和pBAD系列。
根据需求选择合适的启动子、选择抗生素耐药基因等。
2. 克隆目标基因：使用标准的分子克隆技术，将目标基因插入表达载体的多克隆位点(MCS)上，确保正确的定向和插入。
3. 验证重组载体：通过限制性内切酶酶切和测序等方法，验证克隆成功的重组载体，确保目标基因的正确插入。
第二部分：转化大肠杆菌1. 准备化学竞争性转化试剂(如CaCl2)：将大肠杆菌K12 试管预培养在含有适当抗生素的LB培养基中，30C静置过夜，或在37C上摇培养2-4小时。
2. 收获菌液：从预培养的菌液中取适量菌液，通过离心将细胞沉淀，并用LB培养基中的胞质液重悬滞液沉淀。
3. 转化：将化学转化试剂添加到胞质液中，进行热突变，使得大肠杆菌细胞获得质粒的能力。
然后将转化液在37C孵育60-90分钟，再在冰上孵育10分钟。
4. 表达抗生素抗性：将转化后的菌液均匀涂布在含有抗生素的培养基上，并在37C下培养过夜，以筛选抗生素抗性阳性菌落。
第三部分：过表达蛋白1. 前处理：将含有抗生素阳性菌落的菌液接种到含有适量抗生素的LB培养基中，培养至适当的菌液浓度(通常为OD600约为0.5-0.8)。
2. 诱导表达：加入适当浓度的诱导剂，如IPTG，诱导目标基因的表达。
培养条件如温度、培养时间、诱导剂浓度等根据实验需求进行调整。
3. 培养和收获蛋白：在适当的温度和时间下继续培养大肠杆菌，通常在30C或37C下进行培养。
通过离心将细胞沉淀并收取，然后通过超新星破碎细胞壁，释放目标蛋白。
三四章分子克隆载体---答案_完_
三四章分⼦克隆载体---答案_完_第三章分⼦克隆载体（Molecular cloning vectors）⼀、名词解析1.质粒：质粒是染⾊体外的遗传因⼦，能进⾏⾃我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋⽩质）；⼤多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分⼦（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；⼤⼩⼀般为1～200Kb，有的更⼤。
2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单⼀质粒的份数同染⾊体数之⽐值,常⽤质粒数/每染⾊体来表⽰。
不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。
3.质粒的不相容性：两个质粒在同⼀宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第⼆个质粒导⼊后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒⼀般都利⽤同⼀复制系统，从⽽导致不能共存于同⼀宿主中。
4.质粒的转移性：质粒具转移性。
它是指在⾃然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作⽤转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因⼦ bom 及其内部的转移缺⼝位点 nic。
5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖⼜能在原核细胞中繁殖的载体。
这类载体必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，⼜含有真核⽣物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。
它⽤来转化细菌，⼜可以⽤于转化真核细胞。
6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。
α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补⽽建⽴的7.温和噬菌体：既能进⼊溶菌⽣命周期⼜能进⼊溶源⽣命周期的噬菌体。
8.溶源性细菌：具有⼀套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。
9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染⾊体DNA中，便叫做已整合的噬菌体DNA。
如何构建一个大肠杆菌高效表达的分子克隆
如何构建一个大肠杆菌高效表达的分子克隆？影响基因在大肠杆菌中表达的因素是多方面的，以下我就从载体选择、启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数、表达产物的稳定性、受体细胞代谢等方面说明构建大肠杆菌高效表达的方法。
一、表达载体表达载体应具有以下条件：1、能够独立复制。
根据载体复制的特点，可分为严谨型和松弛型。
严谨型载体伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主中拷贝数很少（1~3个）；松弛型的复制而不依赖于宿主染色体，在宿主细胞中的拷贝数可多达3000个。
2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。
而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。
3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。
4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。
阻遏子的阻遏作用可由物理（如温度）、化学（如IPTG、IAA等）因素进行调节，这样可人为地选择启动子启动转录mRNA的时机。
因外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖。
而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。
例如可使宿主细胞快速生长增殖到相当量，再通过瞬时消除阻遏，使所表达的蛋白质在短时间内大量积累，同时可减少表达产物的降解。
5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。
同时强终止子所产生的mRNA较为稳定。
诱导表达时，由于强终止子所致的高水平转录反过来会影响质粒DNA自身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象。
因此在外源基因的下游安置强终止子可以克服由质粒转录引起的质粒不稳定。
6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。
二、启动子启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。
启动子是在转录水平上影响基因表达。
转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。
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3) λDNA的复制
细胞外 细胞内
4) λDNA的包装过程
l 头—尾连接器由12分子gpB构成中空结构，groE1和groES 负责装配 l pX由10个杂合的gpC和gpE构成，使连接器定位 l gpW和gpFⅡ结合在连接器上，防止DNA外泄，提供尾部 粘着点末端酶由两基因产物组成（Nul和A），gpNul2-gpA1 (20,444 x 2 + 72,280 = 113,168) 该酶具有以下多种酶活性：1）特异DNA位点结合；2）特异 位点切口形成；3）头前体结合；4）gpFI结合；5）cos位点 变性；6）DNA转位；7）DNA序列扫描；8）ATP结合；9） ATP水解。 因此，头部蛋白gpE和gpD以及包装蛋白gpA是λ DNA形成 噬菌体颗粒必不可少的组分，体外包装物的制备就是依据这 一结论
6) λ载体的种类
i. 插入型—即将外源DNA直接插入已构建载体中，如 λgt11，可以插入长达7 Kb的DNA。这类载体被限制酶 切成左右臂。 ⅱ.取代型—即利用一段外源DNA去取代载体中的一段 DNA，而这段DNA常含有一定的标记基因。这类载体 常被限制酶切为三段：左臂、隔离段和右臂。 * 有的取代型λ载体亦可用作插入型载体,如Charon 4A
pUC18和pUC19载体
pUC18
HindIII SphI PstI SalI XbaI BamHI SmaI KpnI SacI EcoRI
EcoRI SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
pUC19
LacZ
Apr
(2.68kb)
Ori
E.coli
px
5）λDNA作载体的缺点和解决办法
i.λ头部只能容纳自身DNA的78-105%，即39-52.5 Kb， 天然λ仅可插入3 Kb外源DNA片段—除去所有与λ裂解 无关的基因和空白区，最大可插入22 Kb。 ii.同一种限制酶具有多个识别位点，不利于外源DNA插 入—体内突变和建立新的克隆位点。 ⅲ.重组的λDNA分子难于直接导入宿主细胞—利用体外 包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNA。
大肠杆菌λ噬菌体的基因和表达调控
头
A w B C D E ZU V G T
尾
H M L K I J N O P Q SR
整合 切除、重组 att PI O P tL 免疫和调控 OL tM PM OR PR tR1 Ori TR2 DNA合成 宿主裂解 PR
PL
int
exo
kil cIII rel
如插入片段的5’段定向缺失: XbaI→SphI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase; 插入片段的3’-端亦可采用类似的方法进行缺 失（SmaI→SstI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase） 不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又 例如: pBS+多克隆位点区的排列顺序是(见图)： 假设有一EcoRI→HindⅢ DNA片段，并要求在其3’-末 端或5’-端接上另外的DNA片段（如终止子、启动子）， 显然，pUC系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用 pBS+中的多克隆位点区就能满足要求。
质粒自主转移
导入
+
自主转移
+
无DNA转移
donor
H H
H
+
辅助转移
H
+
质粒的辅助转移
H
H
+
Notransfer
质粒的重组转移
R-重组DNA分子
重组
R
+
DNA 转移
R
+ R
4.质粒DNA的复制和调节控制
1) 复制机制—复制方向、终止和方式 2) 质粒拷贝数的控制—抑制剂模型：高拷贝质粒需 高浓度抑制剂，低拷贝质粒需低浓度抑制剂，同 一不相容群质粒产生的抑制剂可交叉相互作用。 3) 质粒的复制调控机制 例子: ColE1质粒的复制及复制起点结构 Boros etal.(1984)分离到一个pBR322突变体， 其拷贝数可达1000/ cell或65%总DNA，原因是在 RNAI基因的3'端附近发生一次G→T颠换。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
N
cI Cro
Q
S
R
激活 tL PL tR2 N 后期 P'R tM Pi 溶源性建立 和保持 PM OL OR tR1 后早期
PE CI阻遏物
2) λ噬菌体基因的表达
i. 最早期转录：转录起始于CI基因两侧的PL和PR启动子， 止于N和Cro末端的tL和tR1，有的右向转录物可継续通 过O和P止于tR2。 ii. 后早期转录：N蛋白可使宿主细胞转录终止因子ρ失活， 导致转录通过tR1、tR2和tL进入其余早期基因区域。 iii. 后期转录：cro蛋白可与OL和OR结合，阻止RNA聚合 酶与PL和PR结合，转录终止，此时已合成了足够多的 控制蛋白Q，它对P'R起激活作用，导致后期基因转录。 iv. DNA复制：因早期转录获DNA复制蛋白O和P，双向 复制开始。 v. 包装：Nul和A蛋白与λDNA的cos位点的识别与切割， FI蛋白促进DNA进入头部蛋白，DNA充满后，gpw和 gpFⅡ将头部封住，然后与尾部相连，形成噬菌体颗粒。
3.质粒DNA的转移
1）质粒DNA的转移过程
质粒的自主转移过程
donor cell Recipient cell
+
nick-ligation at oriT
+
繖毛结合 性繖毛-细胞壁接触 donor cell
3)分离 2)tro基因表达 1)重新环化
性繖毛收缩
细胞壁接触 不稳定接合对 DNA转移 traT 供体接合 DNA合成 稳定化
质粒DNA的转移和复制
5' 3' 3'5'
2）质粒转移的必备条件 ⅰ.转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时的复制起点—顺 式 作用（cis-action） ii. 细胞附属物—性纤毛，由蛋白质构成—反式作用 ⅲ.转移过程所需的全部酶类—反式作用 3）质粒转移类型 ⅰ.自我转移（Self-transmissible） ⅱ.辅助转移（Donation）—可转移质粒仅具备oriT，若 无辅助质粒，前者不会发生接合转移。若辅助质粒可 提供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。 ⅲ.重组转移（conduction）—若质粒无oriT，该质粒只 有整合到辅助质粒DNA中，重组质粒便可转移。 因此，用于克隆外源DNA的分子克隆载体，只要具 备oriT即可，另外两类功能基因可置于辅助质粒上， 该质粒一般没有oriT，因而可以减少后者进入另一种 细胞的频率。
拷贝数
15-20 500-700 10-12 25 15-20
2) 质粒载体常用的遗传标记基因
Apr Cmr Kanr Neor Tcr Hygr LacZ LacZα
3) 多克隆位点区
大多数从pUC系列中的多克隆位点衍生出来的
6.实例—pUC18和pUC19
pUC系列质粒载体由Messing et al.构建，具有三个 显著特点： 1）分子量小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大 2）易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα 3）多克隆位点区
ⅲ. 多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的
绘制。 除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表达外源 基因 （LacZα启动子）。
pBS载体的结构
pBS-SK(-)
T7
Plac
T3
pBS-KS(-)
Plac
LacZα ori
F1(-)
pBS
(3.0 kb) Ampr
ori
三. 噬菌体载体
λ DNA的包装
左端 Nu1 A W B C Nu3 D E FI FII 头-尾 gpB 连接器 gpc.E gp Nu3 gp gro EL gpNu3 gp gro ES gpc gpA gpNu1 复合物I λ DNA E.coli INF Or THF gpD gpFII gpw 末端酶 复合物II (F1可促进 该复合物形成） 扩张 gpE
左臂
隔离段 E lac5 XbE bio256 E KH54
右臂
50kb
nin5 QSR80
大肠杆菌λ载体 Charon 4A
限制酶 克隆方式： EcoRI 取代法
E 20.1kb
E 7.1kb
Xb Xb XbI 插入法 5.64 0
red gam P2 λ +
red gam 导入
λ
无噬菌斑
Spi 重组子的筛选
第三节
大肠杆菌分子克隆载体
一、E.coli克隆载体的种类
1. 质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制 起点来自噬菌体。 3. COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段， 以利于体外包装 4.噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd 的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。
外源DNA 取代 导入 λ
-
P2
滚环复制
7) λ载体的遗传标记基因和重组子筛选
由于λ载体或重组DNA是通过感染途径进入宿主细胞的， 因而形成的噬菌斑就是一个明显的标记。用于重组子检测的 遗传标记基因主要有lacZ 基因。不管是用插入或取代法，该 标记基因均会失活。 利用spi-选择重组子：野生型λ不能在P2溶源化菌种中成活， 称之为spi+(sensitive to P2 interference)，这与red和gam基因 有关。若用外源DNA将这些基因取代，形成的重组DNA分子 可在P2菌中株中存活，并形成噬菌斑。λ载体λ1059、λL47.1 均属此类，这种选择方式亦称之为显性选择。