3分子克隆载体
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介1.分子克隆技术的定义2.分子克隆技术的发展历程二、分子克隆技术的原理1.基本原理2.克隆过程详解三、分子克隆技术的应用1.基因工程2.生物制药3.基因诊断4.转基因技术四、分子克隆技术的操作步骤1.设计引物2.PCR扩增3.酶切鉴定4.连接转化5.筛选重组子6.鉴定克隆子五、分子克隆技术的注意事项1.实验操作规范2.试剂选择与储存3.防止污染4.优化实验条件六、分子克隆技术的发展趋势1.高效自动化设备2.单细胞克隆技术3.基因编辑技术4.个性化医疗正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，主要用于复制特定DNA序列。
该技术在我国科研领域得到了广泛的应用，为基因研究、生物制药、转基因技术等领域提供了重要的技术支持。
自20世纪70年代以来，分子克隆技术不断发展，为生命科学研究带来了革命性的变革。
二、分子克隆技术的原理分子克隆技术的基本原理是将目标DNA片段通过PCR扩增，然后利用限制性内切酶切割得到特定片段，将这些片段连接到载体DNA上，最后将连接产物转化到受体细胞中。
在转化过程中，载体DNA与受体细胞的染色体DNA 结合，实现目标基因的复制和表达。
克隆过程详解：首先，设计一对特异性引物，使目标DNA片段在PCR扩增过程中产生特定的扩增子。
接下来，通过PCR扩增得到目的基因。
然后，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到具有粘性末端的目的基因片段。
将目的基因片段与载体DNA连接，形成重组载体。
最后，将重组载体转化到受体细胞中，实现基因的克隆。
三、分子克隆技术的应用1.基因工程：分子克隆技术为基因工程提供了重要的技术支持，使得科学家可以对基因进行改造、编辑，进而创造新的生物品种和药物。
2.生物制药：分子克隆技术在生物制药领域具有广泛应用，如制备抗体、细胞因子、酶等生物制品。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以快速、准确地检测特定基因序列，为遗传病诊断提供依据。
分子克隆名词解释
分子克隆名词解释分子克隆是指利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质（DNA）复制并传递给另一个生物体的过程。
在分子克隆中，一个主要的步骤是将要克隆的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA，然后将其传递给宿主细胞进行复制和表达。
分子克隆有许多不同的应用领域，其中最著名的是基因工程和医学研究。
在基因工程中，分子克隆可以用于生产重组蛋白、生产转基因生物和制造药物。
在医学研究中，分子克隆可以用于研究疾病的发病机制、开发新型疗法和筛选药物靶点。
在分子克隆的过程中，有几个重要的术语需要理解。
首先是重组DNA。
重组DNA是将要克隆的DNA片段与载体DNA连接而形成的复合物。
载体DNA通常是质粒，可以在宿主细胞中自主复制和表达。
其次是限制性内切酶。
限制性内切酶是一类酶，可以识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA。
这些酶在分子克隆中起到“剪刀”的作用，将DNA切割成特定的片段，用于进行重组。
另外一个重要概念是DNA合成。
DNA合成是通过化学合成方法制备DNA片段的过程。
这些合成的DNA片段可以与其他DNA片段连接，形成重组DNA。
在分子克隆的过程中，有几个关键的步骤。
首先是选择合适的限制性内切酶。
限制性内切酶的选择根据克隆的目的和需要选择不同的酶切位点。
然后是DNA切割和连接。
通过酶切和连接反应，将要克隆的DNA片段与载体DNA连接，并形成重组DNA。
接下来是转化过程。
将重组DNA导入宿主细胞，并使其进行自主复制和表达。
最后是筛选或鉴定过程。
通过筛选或鉴定宿主细胞中的重组DNA，筛选出目标克隆。
总之，分子克隆是一种利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质复制并传递给另一个生物体的过程。
通过克隆可以研究基因功能、生产重组蛋白和制造药物。
分子克隆的关键步骤包括选择限制性内切酶、DNA切割和连接、转化和筛选或鉴定。
分子克隆在生物科学和医学研究中具有广泛的应用前景。
分子克隆的步骤及原理
分子克隆的步骤及原理分子克隆是利用重组DNA技术复制特定的DNA片段并将其插入到另一个DNA分子中的过程。
它是许多生物学和医学研究中常用的技术，例如用于研究基因结构和功能、制备重组蛋白以及研发基因治疗等。
第一步是选择并提取目标DNA片段。
一般情况下，需要从生物体中提取DNA，例如通过PCR扩增或酶切来获取所需片段。
PCR是一种酶链反应技术，通过引物引导DNA的聚合酶在一系列温度循环中合成DNA。
酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列来获得目标DNA片段。
第二步是将目标DNA片段插入载体DNA中。
载体DNA是一段能够自主在细胞中复制的DNA分子。
常用的载体包括质粒和噬菌体。
目标DNA片段需要与载体DNA进行连接，形成重组DNA。
连接主要通过DNA连接酶的作用，与连接酶反应的连接体包括连接酶本身、大肠杆菌DNA连接酶I（T4 DNA连接酶由细菌染色体T4噬菌体中提取的）、T4 ligation buffer （限制性内切酶的缓冲液通用成分+乙醇和内切酶）。
连接后的重组DNA 可以通过转化作用导入到宿主细胞中。
第三步是将重组DNA导入宿主细胞。
转化是将外源的DNA片段导入到细胞中的过程。
常用的转化方法包括化学转化和电转化。
化学转化是通过改变细胞的物理状态和细菌细胞表面的荷电状态，使其能够非特异性地吸附DNA质粒。
电转化则是通过电场作用使DNA穿透细胞膜，进入细胞。
最后一步是筛选和分离重组的细胞。
由于重组细胞中带有插入的目标DNA片段，因此可以通过筛选技术来判断哪些细胞中含有目标DNA。
常用的筛选方法包括抗生素耐药筛选和荧光蛋白筛选。
在抗生素耐药筛选中，重组细胞会在含有特定抗生素的培养基中生长，而未转化的细胞则会被抑制。
在荧光蛋白筛选中，以荧光蛋白为报告基因，使转化的细胞能够呈现出荧光信号。
分子克隆的原理主要依赖于DNA的重组和复制。
DNA连接酶通过其黏末端连接酶活性，可以将目标DNA片段连接到载体DNA中形成重组DNA。
分子克隆
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第一节 基因工程技术路线
载体和目的基因的分离； 载体和目的基因的切断； 载体和目的基因的重组； 重组DNA的转化和扩增； 重组DNA的筛选和鉴定。
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第一节 基因工程技术路线
基因重组技术的两个基本目的：
1.直接利用基因 主导生长的基因、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等。
2）可移动质粒（mobiliableplasmid）可以被传递，但不能使细菌接合。 3)自传递质粒（selftran missible plasmid）兼具1）2）两种功能因而可以自
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第三节 分子克隆常用的载体
质粒发现和研究意义
1）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看 是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一块体重要 基石。
2）实践意义 是基因工程的重要载体（vector），能把外源基因（目的基 因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。
医学分子生物学基础
分 子 克 隆
南京农业大学 动物医学院基础兽医系动物生化教研室
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第五章 分子克隆
重组DNA技术（recombinant DNA technology）
是按照人的意愿、在体外对DNA分进行重组，再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖， 以获得该DNA分子的大量拷贝。
克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲
切平由核酸内切酶产的的3`粘性末端 DNA片段的同位素末端标记
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第二节 分子克隆常用的工具酶
反转录酶 reverse transcriptase
1. 以RNA为模板，聚合形成cDNA链。 2. 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
分子克隆技术
分子克隆技术分子克隆技术是一种以DNA技术开展生物学研究的新方法。
它可以非常有效地复制出大量基因序列，从而为更深入地解析基因组给出生物特性提供可能。
作为一种生物信息学技术，分子克隆技术基本上利用质粒或载体把被学习的DNA片段提取出来，通过该质粒或载体可携带DNA片段，并用作接种细菌的载体，解析基因组的形态结构及功能。
分子克隆技术的发展历史自20世纪70年代的DNA克隆的研究开始，经过几十年的发展，它在许多领域都取得了巨大的成就，如医学、生物工程、食品处理等。
该技术使得研究人员可以获取精确的DNA信息，并为复制基因序列提供迅速、低成本、高效率的方法，为科学家研究基因组和解析生命过程提供了强大的工具。
分子克隆技术的应用在世界范围内非常广泛，有很多诸如基因定位、基因突变、DNA测序、转基因有机体、基因工程植物、分子诊断等应用。
例如，经过分子克隆技术，科学家可以定位出特定生物中的特定基因，并直接拷贝该基因，使它聚集成为一个基因组，用于基因突变和异位表达，以解析基因组的结构和功能。
研究人员还可以利用这种技术研究基因的进化史，研究基因的转移路径以及特定物种在进化过程中的变化，更多地了解物种的进化。
此外，分子克隆技术在药物研究以及重大疾病的预防和治疗过程中也发挥着至关重要的作用。
例如，非洲猪瘟是一种严重危害猪类及其产品安全的传染病，经过分子克隆技术，研究人员获得了病原体所对应的基因，为预防和治疗猪瘟提供了重要的基础。
此外，分子克隆技术还可用于生产重要的生物制品，包括激素、抗体、细胞因子、抗生素及病原体的疫苗等。
它使得科学家可以迅速地制造出各种重要的生物制品，对人类健康有着重要意义。
值得一提的是，最近几年，随着基因组学技术的飞速发展，分子克隆技术也取得了长足的进步，使科学家能够非常准确地表达基因，并开展全基因组测序及基因功能分析。
许多生物学实验，如基因表达、RNA干扰、体细胞基因修饰等都依赖于分子克隆技术或相关技术的支持。
分子克隆实验技术的使用中常见问题
分子克隆实验技术的使用中常见问题分子克隆技术是一种常用的实验技术，被广泛应用于分子生物学研究、基因工程以及生物医学等领域。
然而，在使用分子克隆技术进行研究或实验的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将就分子克隆实验技术的使用中常见问题进行探讨，希望能帮助读者更好地应对这些挑战。
问题一：选择合适的克隆载体在进行分子克隆实验之前，选择合适的克隆载体是非常重要的一步。
克隆载体通常是一种容易携带外源DNA片段的可重复扩增的质粒或噬菌体。
然而，在选择合适的克隆载体时，需要考虑多个因素：1. 大小：载体的大小要适中，不宜过大或过小。
过大的载体可能导致操作不便、扩增困难，而过小的载体则可能限制载入的外源DNA片段的大小。
2. 复制起源：克隆载体应该具有一个可靠的复制起源，这样才能确保在细胞中稳定复制。
3. 选择标记：载体通常会带有一些标记基因，例如抗生素抗性基因。
在使用克隆载体进行实验时，选择合适的标记基因很重要。
问题二：限制性内切酶消化反应优化限制性内切酶消化是分子克隆实验中的重要步骤，用于切割DNA，生成所需的片段，并为之后的操作提供合适的DNA末端。
在进行限制性内切酶消化反应时，常见问题包括：1. 酶切位点不兼容：选择合适的限制性内切酶对于成功完成限制酶切非常重要。
如果酶切位点与目标DNA不兼容，将无法成功进行酶切。
2. 消化条件优化：酶切反应的条件包括酶切酶的浓度、反应温度、反应时间等。
为了获得理想的酶切效果，有时需要进行反应条件的优化。
3. 反切和星切现象：反切是指限制性内切酶在不应该切割的位点上产生切割作用，而星切是指一个酶切酶在DNA样品中的多个不同位点发生非特异性切割。
这些现象可能影响目标DNA片段的纯化和选择。
问题三：插入片段的PCR扩增在分子克隆实验中，为了获得目标DNA片段，常常需要进行PCR扩增。
然而，PCR扩增过程中可能会遇到以下问题：1. 扩增特异性：选择合适的引物是 PCR 扩增的基础。
分子克隆的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。
本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。
2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。
四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。
（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。
2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。
（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。
3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。
（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。
4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。
（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。
（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。
（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。
分子克隆实验指南
分子克隆实验指南分子克隆技术是一种常用的实验手段，常用于生物学和医学领域的研究中。
这种方法可以通过将DNA分子插入到载体DNA中来制备重组DNA分子，从而达到扩增特定的DNA序列或者表达生物活性分子的目的。
分子克隆技术的原理基于DNA的重组，重组的过程通常需要以下几个步骤：1、DNA的裂解和切割：要将DNA进行克隆，首先需要将待操作的DNA裂解并用酶切成适量的小片段。
2、载体的制备：载体是与待操作的DNA进行克隆的中介物，这种载体通常采用环状DNA分子质粒，也可以采用噬菌体等其它病毒。
3、DNA的连接：将切割后的DNA与载体对应的DNA片段通过酶的帮助连接起来，形成重组的DNA分子。
4、转化：将重组的DNA分子转化到细胞中。
5、筛选：对表达成功的细胞进行筛选，得到所需要的DNA片段。
下面是一份分子克隆实验指南，供研究人员参考：1、准备实验室条件：保持实验室的清洁和安全，坚持使用一次性的实验用品，保证环境的无菌。
2、准备所需材料：重组酶、DNA、载体、培养基、试剂、菌种等。
3、DNA的制备：使用DNA分离试剂盒将所需的DNA样本从细胞中提取出来，并通过酶的作用将其切割成适当的长度。
4、制备载体：将载体放入匀质的培养基中，通过质粒扩增技术制备大量的载体。
5、连接重组：使用重组酶将切割后的DNA与载体片段连接起来。
6、转化实验：将重组的DNA分子转化到感受态细胞中，如大肠杆菌，青霉素或氨苄青霉素选择性筛选能力。
7、筛选：将所需的表达目标转移到含有感光荧光素物质的培养基中，观察感光荧光，达到筛选的目的。
8、挑选合适的细胞：将所得的高荧光表达细胞进行挑选，进行康复培养。
9、提取所需重组蛋白：采取适当的提取方法对获得的细胞进行处理，得到所需的重组蛋白。
总之，分子克隆技术是一种非常重要的实验手段，该技术的应用范围很广，能够扩大DNA等分子，开启了生物医学研究的大门，为生命科学研究做出了重要的贡献。
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顺式作用元件指的是在同一条核苷酸链上起调控基因作用的核酸序 列，常不编码蛋白质合成。 反式作用因子则指的是对不同核酸链上的基因表达起到调控作用的 蛋白，编码该蛋白的基因与其识别结合作用的核酸链不是同一链。 顺式作用元件在分子遗传学领域，相对同一染色体或DNA分子而言 为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式” （trans）。
（3）连接产物的电转化 ①大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备：( 见分子克隆指南第 三版 )
②电转化:取100mL菌悬液于一个0.2cm的电击杯(Bio-Rad产 品)中，加入一定浓度的供体质粒DNA（一般3～5mL），混匀 后在冰浴上放置10－20min，用Genepulser TM型电脉冲仪(BioRad产品) 进行电脉冲。电脉冲参数选定为：脉冲场强V =9.0 kV/cm，电容C =25 m F，阻抗 R =200Ω，脉冲时间G =4.0～ 4.8ms。电脉冲完毕后，加入0.8mLSOC培养液于电转化杯中， 并在37℃以150r/min恢复培养2h后，涂布氯霉素抗性平板，置 37℃d Ⅲ与Not Ⅰ酶切
（3）电洗脱（透析） 首先将脉冲电泳后50kb左右的条带切胶，把此条胶装入煮过 的灌满1×TAE（50×TAE母液：2mol/L Tr is×HCl，pH8.0 ， 1mol/L乙酸，100 mM/LEDTA）缓冲液的透析袋中，将缓冲液 尽量倒净，进行透析电泳，电泳参数为120v电压，电泳2－2.5h 后反向电泳30－40s。将透析袋轻轻揉搓下，吸出透析后的50kb 左右的外源 DNA 。
(1)氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin, ampr） 使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌 中克隆的质粒载体带有该基因。 青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的 酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。 氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌 进入细菌的周质区，催化 β-内酰胺环水解，从 而解除了氨苄青霉素的毒性。
2. pBeloBAC11 载体的制备
（1）载体DNA的提取 碱裂解法大量制备(见分子克隆指南第三版) （2）载体DNA的酶切 采用TakaRa公司的限制性内切酶Hin d Ⅲ对所抽提的载体 DNA进行酶切消化。酶的用量控制在100μL 体系30个单位的酶。 酶切体系：100μL，5μL 载体DNA，10μL10× buffer，2μL Hin d Ⅲ，88μL水，37 ℃，酶切2－3h。酶切结束后，65℃水浴处 理15min 完全灭活内切酶活性。 （3）酶切后载体DNA的去磷酸化 采用TakaRa公司的去磷酸化酶（CIAP）对酶切后的载体 DNA进行去磷酸化。37 ℃，作用1－1.5h 。
（2）脉冲电泳 采用Bio-Rad公司的CHEFⅢ型号的脉冲电泳仪和Middle Range Marker。电泳参数：起始脉冲转换时间1，终止脉冲转换 时间25，电泳时间18h，电压6.0v/cm，转角 120°，电泳缓冲 液为 0.5 × TBE（5×TBE母液：445 mM/L Tr i s × HCl，pH 8.0，445 mM/L硼酸，10 mM/L EDTA。电泳凝胶为1％。电泳 温度：14 ℃
3. 外源与载体的连接与转化
（1）外源与载体的连接 将制备好的50kb左右的外源与载体进行连接，Promega公司的 T4-DNA连接酶，连接体系：载体与外源的比例分别为1:8 ，连 接过夜。 （2）终止连接并对连接产物进行脱盐 65℃水浴处理15min终止连接反应；脱盐：首先制备终浓度为 0.1M的葡萄糖和1％琼脂糖的凝胶，取800μL热的凝胶于 1.5mL 的Appendorf管中，并于胶上放一PCR管，待胶凝之后拔掉PCR 管，则凝胶上出现的凹陷可以进行脱盐。将终止连接的反应物 置于凹陷处脱盐1h。
（4）自连后载体DNA的回收 将去磷酸化后的载体1：1加入苯酚：氯仿：异戊醇（25 ： 24 ：1 ，v/v/v ）抽提，取上层液体加两倍体积的无水乙醇沉 淀，离心 12000r/min，3min 。再用 70 ％的乙醇洗离心得到的 DNA ，干燥后加入TE溶解。将溶解的载体DNA用 Promega 公 司的 T4-DNA 连接酶进行自连，16 ℃，过夜。电泳回收7.6 kb 左右的条带，用V-gene公司的凝胶回收试剂盒凝胶回收。 （5）载体DNA浓度估测及分装保存 与单酶切的λ-Hin d Ⅲ的marker进行浓度对比，估测其浓度， 一般10ng/uL的载体与100ng/uL的外源相连接的效果较好。
1. 外源DNA的制备
(1) 制备 YBT-1520 菌株总 DNA 的包埋块 挑取单菌落于5mL LB液体培养基的摇瓶中，置30 ℃摇床过夜活化。1/100量的 转接于100mL LB液体培养基中。放置于30 ℃摇床培养至对数期。离心收集菌体， 8000r/m i n ，3min。弃上清，STE（ 0.1M NaCl ， 10mM Tr i s × HCl ，pH 8.0 ， 1mM EDTA）洗涤菌体。1.5mL TE25S(0.3M 蔗糖，25mM EDTA，25mM Tr i s × HCl ，pH 8.0) 重悬离心后的菌体。 50 ℃水浴中预热 TE25S 重悬的菌体，使其与 2 ％的凝胶1 ： 1混合。将上述混合液点于事先封好的制包埋块的模具中，待胶 凝固后将包埋块铲出。加5mLTE25S于离心管中，同时加入终浓度 2mg/mL的溶 菌酶，4 ℃冰箱过夜。用NDS （ 45mM EDTA ， 10mM Tris，1 ％十二烷基肌氨 酸钠）洗包埋块，加入 5mL NDS ，再加入终浓度 2mg/mL 的蛋白酶K，置于50 ℃水浴锅中水浴 24h。用T 10 E 10（10mM EDTA ，10mM Tr i s × HCl，pH 8.0） 润洗一遍包埋块，加入终浓度 0.1mmol/L的 PMSF( 蛋白酶抑制剂)，室温放置1h。 T 10 E 10 润洗包埋块 2 次，每隔 1h 一次。TE（10mM Tr i s × HCl，pH 8.0， 1mM EDTA ）润洗包埋块2次，每隔1h 一次。对包埋块进行预酶切，预酶切体系 为500μL ，加入450μL去离子水和 50 μL十倍的M buffer ，置冰上30min 。对包埋 块进行酶切，酶切体系为 500μL ，加入 445μL 去离子水，50 μL M buffer，5μL Hin d Ⅲ，在冰上放置20－30min ，置于 37 ℃水浴锅酶切2－4h。将酶切液体吸 净，将每个离心管中加入200μL载体和外源 DNA 片段经过酶切以后，外源 DNA 片段 插入到载体的适当位置，或置换载体的填充片段； 2、通过提取 Lambda 噬菌体的蛋白质外壳，可在体外将重 组噬菌体 DNA 进行包装，形成噬菌体颗粒； 3、这样的噬菌体颗粒保留对大肠杆菌的感染能力，可将被 包装的重组噬菌体 DNA 注射到宿主菌中； 4、通过裂解生长，可增殖重组噬菌体 。