电转染实验过程中注意事项(Entranster)
【VIP专享】电转化注意事项
电转化注意事项作者: global.wun(站内联系TA)发布: 2009-10-20一、制备感受态的菌液收集时间：1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。
1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。
每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！2）OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min ）约0.95g/10ml。
高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。
正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。
可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。
3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好二、制备感受态的菌液量如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。
用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。
整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。
山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。
三、感受态的保存感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。
如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP 管分装，-70 或-80 摄氏度保存。
另附：酵母GS115点种分离纯化接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30℃培养48 小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。
电转染实验注意事项
电转染实验注意事项
1. 选择合适的电场强度
合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。
不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。
2. 细胞的选择
用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。
因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA.
3. 质粒的质量
应选择纯度高的质粒，首先DNA／RNA应该超纯(A260／A280>1．8)，其次应不含内毒素，同时质粒应溶于双蒸水而不是TE 缓冲溶液。
另外，DNA浓度不宜过高。
4. 选择合适的电转染试剂
电击会对细胞造成一定程度的伤害，在转染试剂的选择上要注意，应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂，如engreen的Entranster-E，可将电击对细胞的损伤降到最低。
并且，Entranster-E可适用于lonza、Bio-rad、BTX等多种电转仪。
电转化注意事项
电转化注意事项作者: global.wun(站内联系TA)发布: 2009-10-20一、制备感受态的菌液收集时间：1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。
1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。
每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！2）OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min ）约0.95g/10ml。
高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。
正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。
可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。
3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好二、制备感受态的菌液量如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。
用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。
整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。
山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。
三、感受态的保存感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。
如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP 管分装，-70 或-80 摄氏度保存。
另附：酵母GS115点种分离纯化接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30℃培养48 小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。
英格恩entranster转染试剂说明书
英格恩entranster转染试剂说明书一、产品概述英格恩 Entanster 转染试剂是一种用于转染外源 DNA/RNA 到细胞内的试剂。
它是经过优化的化学试剂组合，可以将外源 DNA/RNA 高效地传递到各种细胞中，并促进其定向表达。
本试剂适用于体外转染实验和基因工程研究，具有高转染效率、低细胞毒性、简单易用等优点。
二、试剂成分英格恩 Entanster 转染试剂主要成分包括转染缓冲液和转染增强剂。
转染缓冲液中包含有机溶剂、非离子表面活性剂等，用于稳定 DNA/RNA与转染剂的结合。
转染增强剂含有具有阴离子表面活性剂、脂质、蛋白质等物质，可以提高细胞膜通透性和转染效率。
三、使用说明1.储存和稀释：试剂应储存于-20℃的冰箱中，保持干燥和避光。
使用前需要将试剂溶解在适当体积的转染缓冲液中，最佳稀释比例为1：9、溶液需充分混匀，离心并去除任何沉淀物。
2.样品准备：在转染前，将目标DNA/RNA溶解在适当的缓冲液中，浓度通常在0.1-1μg/μL最佳。
确保样品充分溶解并无明显沉淀。
3.转染操作：对于已经培养至适当倍数的细胞，将细胞用预先暖和的转染缓冲液洗涤一次，并去除缓冲液。
将转染缓冲液和溶解好的目标DNA/RNA混合，稍微搅拌均匀。
与此同时，将适量的转染增强剂加入到混合物中，充分混合。
然后将混合物直接滴加到细胞上，并轻轻摇晃培养板以确保混合物均匀分布。
4.培养和检测：将含有转染混合物的培养板放回恒温培养箱中，保持恒定的温度和CO2浓度。
培养时间和温度根据需要进行调整，通常在24-48小时后可以进行下一步实验或观察。
四、注意事项1.试剂需保存在干燥、阴凉、避光的环境中，避免结冰或暴露在高温环境中。
2.操作中需佩戴手套并遵循生物安全实验操作规范。
3.使用前需充分摇匀试剂瓶，确保所有试剂成分充分混合均匀。
4.转染缓冲液中的有机溶剂可能对一些细胞有毒性，因此在选择试剂时应参考相关文献或尝试不同的浓度和时间，以确定最佳条件。
微生物电转染系统安全操作及保养规程
微生物电转染系统安全操作及保养规程前言微生物电转染系统是生物实验室中的一种基础设施，广泛应用于分子生物学、细胞生物学、遗传学等学科领域。
安全操作和保养微生物电转染系统非常重要，可避免不必要的事故、延长设备寿命、提高实验效率。
本文将详细介绍微生物电转染系统的安全操作和保养规程。
安全操作规程1. 确认设备完好在使用微生物电转染系统前，应确认设备完好无损。
若发现设备损坏或有异样，应及时联系设备维护人员进行维修。
2. 使用合适的电源微生物电转染系统应接入稳定、可靠的电源。
为保证设备安全运行，不要与其他高功率设备共用同一个电源插座。
另外，不得在通电状态下更换电源插头或电源线。
3. 操作前必须了解设备及试剂性质在操作微生物电转染系统前，应仔细了解设备及试剂性质。
操作人员应具有相关实验室操作技能，并熟知微生物电转染系统的使用方法。
4. 操作前应脱酒精或佩戴手套在进行微生物电转染系统操作前，应先进行手部消毒。
可使用70%的酒精在待消毒部位反复擦拭，或佩戴手套。
佩戴手套时应避免使用过期手套，以免产生渗透性或易破裂现象。
5. 禁止穿着不符合场所规定的衣物或饰品在使用微生物电转染系统时不得穿着开放式的衣物、高跟鞋，也不得佩戴任何类似项链、手镯、耳环、戒指等饰品。
如有长发，应把头发妥善束起，以免夹到设备中。
6. 操作过程中应专心、耐心在进行微生物电转染系统操作过程中，应专心、耐心，避免分心或走神。
如有特殊事项需要处理，应先停止操作并告知值班人员，等待处理完成后再继续操作。
7. 操作过程中注意安全在微生物电转染系统操作过程中，应随时注意周围环境，避免过于繁忙的操作、操作时翻倒试剂数、因手部滑动使设备脱离插座等情况发生。
8. 操作完成后及时关机和清洗在微生物电转染系统操作完成后，应及时关机、拆下电源、清洗台面。
如有特殊情况，需要将试剂和设备留存，应进行必要的标识，并告知后续使用操作人员。
保养规程1. 定期维护微生物电转染系统的各种零部件内部连接处松动、腐蚀等问题，可能会导致设备性能下降，使用寿命缩短，因此需要定期进行维护断路等工作。
细胞转染为什么不能加抗生素
细胞转染为什么不能加抗生素传统的转染试剂有一定的细胞毒性，在转染过程由于提高细胞的通透性因而不能在培养基中添加抗生素。
如，阳离子脂质体。
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。
血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体对核酸的吸附，影响转染效率。
另外，使用脂质体等转染试剂时，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞，引发细胞毒性，导致转染效率降低，故不能有血清转染。
这些转染试剂要求在转染前换无血清培养基，转染后4-6h在更换成有血清培养基，这其实是为了减轻转染造成的细胞毒性。
不同的细胞及转染试剂要求转染的条件是不同的。
最好是在第一次实验前做一个预实验，比如：HeLa，293，CHO，COS7，MCF－7，HepG2等细胞，是否加血清，对不同的细胞是有不同的影响的，有些细胞是可以有血清的，有些加血清就会受影响。
所以，普通的转染试剂一定要进行预实验，和条件优化。
转染后在6小时左右最好换液且换为有血清的培养基，其一因为普通转染试剂对细胞的毒性作用大，其二可降低因血清的缺乏引起的细胞的死亡。
转染时不加血清是防止血清的干扰作用，转染后可适时加入。
加入过早会引起未转染细胞的优势生长，过晚会引起较多细胞死亡。
可实时观察1/5细胞变圆的时候加入血清。
现在市面上也有一些改进了的转染试剂，可以在转染时含有血清；也有一些公司完全改变了产品性质，使转染过程更加简便，效率更高。
如，英格恩公司的Entranster TM只浓缩包裹核酸不会将血清带入细胞。
Entranster TM采用有血清转染，不用在有血清和无血清之间更换，增加工作量，同时有血清转染不仅不造成细胞毒性，而且由于血清的存在，有利于细胞的状态维护，提高转染效率。
由于Entranster TM的内毒素和细胞毒性都非常之低，加上转染复合物能够高效的在完全培养基中形成，因而整个转染过程可以在含血清而且是含有抗生素的培养基中操作，无需更换培养基，这极大的方便转染操作！适用于包括干细胞，神经细胞，原代细胞和其他方法难转染细胞的转染在内的多种真核细胞。
动物体内转染(Entranster)答疑
动物体内转染答疑----用RNA或DNA直接注射动物完成干扰和表达动物体内转染，简单地说，就是用RNA和DNA直接打动物完成干扰和表达。
再通俗地说，用合成的(RNA)或者提取的核酸(DNA)，就可以完成以前的动物转基因或者基因敲除的实验，无需再用病毒或者基因敲除动物。
实验周期可以缩短为几天，花费几千元即可进行实验。
动物体内转染技术的出现，让广大生物医学研究者，轻松进行动物的基因干扰、导入等操作。
尤其是临床医学工作者，可以在很少工作量较少经费的情况下，直接针对研究的疾病进行动物实验，发表高水平文章。
比如在英格恩客户已发表的文章中，有尾静脉注射DNA研究治疗病毒性心肌炎，有皮下肿瘤注射miRNA 研究治疗结肠癌，有脑室注射siRNA研究脑缺血机理，有皮肤涂抹siRNA治疗皮肤瘢痕等。
这些研究都非常有临床和现实意义。
由于动物体内转染技术应用的时间不长，对这种崭新的技术人们还不太了解。
此次受丁香园邀请，特开此动物体内转染相关实验技术答疑专帖。
对站友们提出的问题给予解答，希望能够和大家相互学习，共同进步。
任何与动物体内转染有关的问题（包括实验设计、产品、实验过程、结果分析、文献等问题），大家尽管提出，我们会尽力解答，也欢迎站友们参加讨论。
技术资料目录：1.体内转染试剂的原理和方法1).动物体内转染技术可以做什么？2).体内转染的原理3).体内转染的过程4).体内转染需要的实验条件5).体内转染适合进行怎样的实验6).体内转染可以在哪些组织器官进行7).应用体内转染试剂发表的部分文献8).动物体内转染和病毒感染的比较9).动物体内转染和基因敲除的比较2.体内转染实验的设计1).需要的材料2).需要的时间3).需要的费用4).常见的结果检测方法3.体内转染过程相关问题及解答1).体内转染试剂对动物有什么影响？2).注射后，试剂是如何在体内分布的，有靶向性吗？3).转染试剂和核酸需要使用多少提问与解答：1、如何技术上解决（排除）RNAi的非特异性是否需要复原实验（Rescue Experiment）。
质粒DNA细胞转染(Entranster)应注意的事项
1，质粒的构建：启动子的选择
启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。
对于转染过程本身虽然无甚影响，但是对转染结果却有着微妙的影响。
2，质粒的大小和质量
线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。
而线性化DNA转染的整合几率高。
质粒太大了转染会困难一些。
毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。
如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。
有的转染试剂还会提供一些促进DNA凝聚的成分，使得DNA形成转染复合物时更致密一些，更容易转染一些。
纯化质粒的质量也会影响转染效率，一定要选择高质量的质粒。
3，质粒DNA的浓度和量
既然质粒纯化已经不成问题，初学者通常都不会在乎甚至愿意多加点DNA，但是要注意的是，DNA量过少固然转染效率不高，DNA量过多同样会降低转染效率。
所以预实验需要按照说明书的要求，按一定比例混合适量的质粒DNA和转染试剂。
有的转染试剂要求DNA的量多些，有的转染试剂效率高只要很少DNA。
4，转染试剂的选择
在确定了质粒的质量之后，就要考虑转染试剂的选择了。
目前大多数用的是脂质体类的转染试剂，但这类试剂的毒性较大，转染效率低，最好选择非脂质体的转染试剂，如Entranster试剂。
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1.选择合适的电场强度
合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。
不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。
2.细胞的选择
用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。
因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA.
3.质粒的质量
应选择纯度高的质粒，首先DNA／RNA应该超纯(A260／A280>1．8)，其次应不含内毒素，同时质粒应溶于双蒸水而不是TE缓冲溶液。
另外，DNA浓度不宜过高。
4.选择合适的电转染试剂
电击会对细胞造成一定程度的伤害，在转染试剂的选择上要注意，应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂，如engreen的Entranster-E，可将电击对细胞的损伤降到最低。
并且，Entranster-E可适用于lonza、
Bio-rad、BTX等多种电转仪。