蛋白质抗原的表位分析
牛羊乳α-酪蛋白的B细胞抗原表位预测及免疫反应性分析
牛羊乳α-酪蛋白的B细胞抗原表位预测及免疫反应性分析薛海燕;韩波;李珊;操歌【摘要】牛羊乳的α-酪蛋白营养功能相似,但蛋白质亚类结构和含量不同,可能是造成其过敏性差异的原因.本文旨在利用生物信息学DNAStar Protean软件、SOPMA以及the Bepi Pred 1.0服务器对牛羊乳主要过敏蛋白αs1-酪蛋白（Casein,CN）的二级结构、亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性进行预测,分析鉴定主要B细胞抗原表位.合成相应表位肽段序列,制备酪蛋白抗体,采用间接ELISA法分析验证合成多肽的免疫反应性.结果表明：牛羊乳αs1-CN的氨基酸序列同源性89%,但抗原表位存在差异,与牛乳αs1-CN相比,羊乳抗原表位数目相差不大,但两者抗原表位区域存在一定的包含重叠关系.且羊乳αs1-CN合成肽段P-1037（26-31,LSPEVP）、P-1040（140-142,EGN）和牛乳αs1-CN合成肽段P-1038（189-208,TDAPSFSDIPNPIGSENSEK）、P-1039（99-102,EDVP）都具有免疫反应性,该结果为过敏原表位的选择提供基础,为牛羊乳过敏原性比较及改性加工提供理论依据.【期刊名称】《陕西科技大学学报》【年(卷),期】2017(035)005【总页数】6页(P133-138)【关键词】牛羊乳;αs1-酪蛋白;二级结构;抗原表位【作者】薛海燕;韩波;李珊;操歌【作者单位】陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安710021【正文语种】中文【中图分类】Q518.1Abstract:Bovine and goat milk α-casein were very similar in the aspect of nutrition and function,but they induced different allergen reaction in consumers because of the differences in protein subclass structure and content.The purpose of this paper was to analyze and identify the B cell epitopes by predicting the secondary structure,hydrophilicity,antigenicity index,surface accessibility and flexibility of major allergic protein αs1-casein from cow and goat milk using DNAStar Protean software,SOPMA and the BepiPred 1.0 server.Prepared the casein antibody by synthesizing the corresponding epitope peptide sequence and then used an indirect ELISA method to identify the immunoreactivity of the synthetic polypeptide.The results showed that the amino acid sequence homology of cow and goat milk αs1-CN was 89%,but the epitopes were different.The number of epitopes of goat milk was similar compared with cow milk αs1-CN,but there was a certain overlap between the two epitope regions.The peptide fragment P-1037 (26～31,LSPEVP),P-1040 (140～142,EGN) synthesized by the goat milk αs1-CN and the peptide P-1038 (189～208,TDAPSFSDIPNPIGSENSEK),P-1039(99～102,EDVP) synthesized by the cow milk αs1-CN had the immunoreactivity,which provided the basis for the selection of the allergen epitope,and provided the theoretical basis for the comparison of sensitization and modification of cow and goat milk. Key words:cow and goat milk; αs1-CN; the secondary structure; epitopes牛乳中富含多种蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质，是人体优质的营养来源，但同时也是联合国粮食及农业组织FAO (1995)报告的八大类过敏食物之一[1].牛乳过敏是指机体对牛乳蛋白的高反应性(hypersensitivity)，是婴幼儿最常见的食物过敏之一，在欧美发达国家，婴儿牛乳过敏症状发生率达0.3%～7.5%[2].目前普遍认为，牛乳蛋白中的酪蛋白(Casein，CN)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-LG)和α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-LA)是最主要的过敏原，其中酪蛋白主要由αs1、αS2、β和κ酪蛋白组成，约80%是由αs1-酪蛋白(αs1-CN)组成，对酪蛋白过敏的患者一般都对αs1-CN过敏[3,4].羊乳总热量、干物质、蛋白质、脂肪以及矿物质含量均高于牛乳，具有较高的营养价值，且易被人体消化吸收利用，在国际营养学界被誉为“乳中之王”[5].以羊乳替代牛乳作为婴幼儿主要的营养来源被广泛认可.羊乳和牛乳中酪蛋白所占比例相似，但羊乳中以β和κ-酪蛋白为主，αs1-CN含量(18.9%)远低于牛乳中的含量 (30.8%)[6].羊乳中αs1-CN含量较低，理论上具有较低的致敏性，Hodgkinson等[7]也证实了低αs1-CN含量的山羊乳可以减少抗原摄入量，降低致敏性.然而Muraro等[8]认为山羊乳与牛乳具有相同的致敏性.所以，就目前山羊乳的低致敏性及其在预防婴幼儿牛乳过敏中的应用仍存在争议.食物蛋白质引起机体致敏的主要原因是消化道内未水解的蛋白质抗原表位被免疫系统识别.抗原表位预测中，B细胞线性表位预测是目前研究的重点，它是研究抗原表位与已知氨基酸序列在蛋白质上的某些结构特征之间的关系，从氨基酸序列的二级结构，亲水性，表面可及性，柔韧性等方面，进行序列的分析预测[6,9].常用的分析软件有ABCpred[10]，BepiPred[11]，SOPMA[12]，DNAStar[13]，其中BepiPred，SOPMA，DNAStar这三种软件较为常用，其基本原理是结合抗原蛋白的结构特点，统计显著性度量，理化性质等指标进行简单预测，操作简单，只需输入蛋白质氨基酸序列，即可得出结果.该研究采用BepiPred，SOPMA和DNAStar这三种预测软件对牛羊乳过敏原αs1-CN B细胞线性抗原表位进行预测分析，并通过实验验证合成的抗原表位是否具有免疫反应性，为进一步对比验证牛乳和羊乳之间的抗原关系提供一定的理论基础.1.1 材料与仪器(1)主要材料：兔抗牛α-CN多克隆抗体(α-CN-IgG，效价1∶204800)，本室制备；HRP-羊抗兔Ig G抗体，北京博奥森生物技术有限公司；碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、明胶等常规试剂均为进口或国产分析纯.(2)主要仪器：MULTISKANmk3型酶标仪，赛默飞世尔上海仪器有限公司；隔水式电热恒温培养箱，上海岛析实业有限公司.1.2 试验方法1.2.1 牛羊乳αs1-CN氨基酸序列通过NCBI数据库检索牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，该序列在NCBI的基因登录号分别为NP_851372、P18626.1.2.2 牛羊乳αs1-CN二级结构预测利用DNAStar Protean软件(Gamier-Robson方法)和SOPMA网络服务器输入检索到的牛羊乳αs1-CN氨基酸序列分析预测两者的二级结构.1.2.3 牛羊乳αs1-CN亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测应用DNAStar Protean软件，采用Kyte-Doolittle法、Jameson-Wolf法、Emini法和Karplus-Schulz法分别对检索到的牛羊乳αs1-CN氨基酸序列进行亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测.1.2.4 B细胞线性抗原表位确定利用the BepiPred 1.0服务器，直接输入牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，抗原指数高于1即为可能表位区域[14].并与牛羊乳αs1-CN二级结构预测结果和亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测结果相结合，综合分析得到B细胞线性抗原表位.1.2.5 牛羊乳αs1-CN多肽合成及鉴定选择牛羊乳差异较大的抗原表位肽段，由杭州丹港生物科技有限公司，应用全自动多肽合成仪，采用固相合成法从肽链C端向N端依次合成.经反高效液相色谱(RP-HPLC)以及质谱对其进行纯度鉴定，纯度大于98%，符合实验室要求.1.2.6 多肽免疫反应性鉴定采用间接ELISA检测合成多肽的免疫反应性.将上述合成的多肽用包被缓冲液稀释至10 μg/mL，每孔加入100 μL，以α-CN、β-LG蛋白分别作为阳性、阴性对照，4 ℃包被过夜[15].弃去蛋白包被液，每孔加入300 μL PBST洗涤液洗涤3次，每次4 min，拍干，除去残留气泡和液体.每孔加入200 μL明胶封闭液，37 ℃温箱封闭1.5 h，洗涤，拍干.每孔加入浓度为5μg/mL的α-CN-Ig G 100 μL(实验室制备，抗牛乳α-CN多克隆抗体兔血清)，同时设置阴性血清对照，37 ℃温箱温育1.5 h，使抗原抗体充分反应，洗涤拍干.用PBS稀释液将羊抗兔HRP-Ig G以1∶4000的比例稀释作为二抗，每孔加入100 μL，37 ℃温箱温育1 h，洗涤，拍干.每孔加入50 μL TMB显色液，37 ℃温箱避光显色15 min，显色后每孔加入50 μL终止液2 mol/L H2SO4终止反应，450 nm测定吸光值.检测时以P/N值>2.1(即多克隆抗体上清的吸光值大于阴性血清值的2.1倍)判定检测结果为阳性，P/N值<2.1(即多克隆抗体上清的吸光值小于阴性血清值的2.1倍)判定检测结果为阴性[15].2.1 牛羊乳αs1-CN所对应的氨基酸序列MKLLILTCLVAVALARPKHPIKHQGLPQEV LNENLLRFFVAPFPEVFGKEKVNELSKDIGS ESTEDQAMEDIKQMEAESISSSEEIVPNSVEQ KHIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYKVPQLEIVPNSAEERLHSMKEGIHAQQKEPMIGV NQELAYFYPELFRQFYQLDAYPSGAWYYVP LGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEKTTMPLW MKLLILTCLVAVALARPKHPINHRGLSPEV PNENLLRFVVAPFPEVFRKENINELSKDIGS ESTEDQAMEDAKQMKAGSSSSSEEIVPNSA EQKYIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYNV PQLEIVPKSAEEQLHSMKEGNPAHQKQPMI AVNQELAYFYPQLFRQFYQLDAYPSGAWY YLPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSGKTTMPLW对比分析牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，将不同差异位点标出，其同源性达到89%，且牛乳αs1-CN氨基酸序列相比羊乳氨基酸差异位点大多为一些极性亲水性氨基酸.2.2 牛羊乳αs1-CN的二级结构利用SOPMA网络服务器对牛羊乳αs1-CN二级结构预测，结果如图1所示.利用DNAStar Protean软件对牛羊乳αs1-CN二级结构预测，结果如图2所示.蛋白质的二级结构是抗原表位预测的重要参数之一.β-转角和无规则卷曲由于其松散的结构，易发生扭曲、盘旋，并展示在蛋白质的表面，因此该区域常含有优势抗原表位而α-螺旋和β-折叠化学键能比较高，结构规则不易变形，较难结合抗体，一般不作为抗原表位[16-18].综合上述两者的预测结果可推出牛乳αs1-CN可能抗原表位区域为19～27，41～43，60～62，99～102，118～120，127～129，148～150，185～186，189～210；羊乳αs1-CN可能抗原表位区域为18～31，41～42，59～62，78～83，99～103，119～121，128，140～142，172～178，183～186，189～210.对比分析预测出的牛羊乳αs1-CN抗原表位区域，从二级结构预测结果显示羊乳可能抗原区域数目高于牛乳，且它们具有相同抗原区域189～210.2.3 牛羊乳αs1-CN亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测结果利用DNAStar Protean软件对αs1-CN(bovine、capra hircus)亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性进行预测，结果如图3所示.蛋白质的亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性在抗原形成方面起着主要作用，当亲水性>0、抗原指数>0和表面可及性>1时，形成表位的可能性较大[19-21].综合预测结果推出牛乳αs1-CN可能抗原表位区域为17～19，22～26，50～52，63～67，70～74，77～83，85～105，117～122，129～134，145～149，185～210；羊乳αs1-CN可能抗原表位区域为17～19，27，30～31，35，48～52，55，62～67，70～76，81～84，90～105，117～119，129～134，139～149，205～219.对比分析两者抗原表位差异得出羊乳αs1-CN抗原表位区域与牛乳相比，其大多分布在αs1-CN氨基酸序列的C端，且羊乳αs1-CN表位区域于牛乳表位区域存在一定的包含重叠关系.2.4 B细胞线性抗原表位综合预测蛋白质的二级结构和氨基酸残基的亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性都是影响B细胞线性抗原表位的重要因素[22].利用the BepiPred 1.0服务器对牛乳αs1-CN氨基酸序列的抗原指数进行预测得到的可能性抗原表位是21，60～68，80～81,85～86，99～102，142～152，173～179，187～208，羊乳αs1-CN可能性抗原表位是26～31，60～70，74～91，100～102， 140～146，187～208.将the BepiPred 1.0、SOPMA、和DNAStar这三种预测软件得到的抗原表位综合分析得出牛乳αs1-CN可能抗原表位为22～26，86～87，99～102，118～120，148～149，185～186，189～210，羊乳αs1-CN可能抗原表位为18～19，27，30～31，83～84，99～103，117～119，140～142，205～210.对比分析预测得到的牛羊乳αs1-CN抗原表位，较牛乳αs1-CN相比，羊乳αs1-CN同样具有较多区域的抗原表位，且二者存在一定的包含关系.2.5 牛羊乳αs1-CN合成肽的设计综合上述可能抗原表位，选择其长度不同的四条预测表位肽段采用固相合成法合成.分别来自于羊乳αs1-CN命名为：P-1037(26～31，LSPEVP)和P-1040(140～142，EGN)；来自于牛乳αs1-CN命名为：P-1038(189～208，TDAPSFSDIPNPIGSENSEK)和P-1039(99～102，EDVP).2.6 合成肽免疫反应性鉴定利用实验室制备的兔抗牛α-CN多克隆抗体作为一抗，间接ELISA法检测合成肽的免疫反应性，以P/N>2.1为判断标准，结果如图4示.由图4可知，合成的四种多肽和α-CN均与α-CN-Ig G呈阳性反应，且α-CN测出的吸光值高于合成的四种多肽；而β-LG与α-CN-IgG呈阴性反应，由此初步说明，合成多肽具有免疫反应性.其免疫原性还需进一步验证.关于牛乳主要过敏原抗原表位的预测研究报道较多.B Ruite等[23]利用重叠肽的方法发现牛乳αs1-CN的T细胞表位识别位点即43-66，73-96，91-114和127-180.Picariello G等[24]利用体外模拟胃肠消化后的牛乳蛋白水解液通过在Caco-2细胞的转运吸收研究发现β-Lg 40～60和125～135具有一定的致敏性.但目前从抗原位点出发研究羊乳过敏性的报道并不多见，Sanz C L等[25]利用豚鼠进行研究，发现豚鼠经口给予羊奶、牛奶和抗乳血清时，山羊奶的变应原性低于牛奶，其变应原性可能是由酪蛋白和抗乳血清不同蛋白质之间的特异性抗原决定簇引起.本研究对牛羊乳主要过敏原αs1-CN B细胞线性抗原表位进行预测，可为对目前山羊乳的低致敏性及其在预防婴幼儿牛乳过敏中的应用提供一定的理论和技术参考. 蛋白引起致敏的前提是它具有抗原性，而抗原表位是蛋白质具有抗原性的关键因素，是抗原与抗体特异性识别的基本单位.B细胞线性抗原表位是指抗原表面可被B细胞抗体识别的线性片段.所以，准确预测B细胞线性抗原表位，可为单克隆抗体的制备、羊乳抗原性的研究等奠定一定的基础.该研究首先采用SOPMA网络服务器，DNAStar软件对牛羊乳αs1-CN氨基酸序列进行对比分析，得出二者氨基酸序列同源性虽较高，但预测出二级结构仍存在差异，其中羊乳αs1-CN β-转角和无规则卷曲的数量较多，如上述利用SOPMA网络服务器对牛乳αs1-CN二级结构预测得到β-转角和无规则卷曲的数目为3.74%和38.32%，羊乳预测得到的数目为4.21%和44.39%，明显大于牛乳.这些差异同牛羊乳αs1-CN氨基酸序列上个别氨基酸的不同存在一定的关系.其次采用DNAStar软件对牛羊乳αs1-CN的亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性预测，由于在肽段1～200位个别氨基酸的不同，预测出的抗原表位在该位存在部分差异且有一定的包含关系，而在200～214肽位间的氨基酸几乎无明显差异，使得此区段预测出的牛乳αs1-CN抗原表位羊乳αs1-CN也同样具有该表位.本研究仅采用了生物学软件对牛羊乳αs1-CN的二级结构，亲水性，抗原指数，表面可及性和柔韧性等预测并通过实验验证了所预测氨基酸序列的免疫反应性，为深入研究羊乳过敏原提供一定的理论依据.在乳过敏性差异方面，该结果还不能全面的说明羊乳是否可作为低致敏产品代替牛乳作为牛乳过敏患者的直接乳源，还有待对主要过敏原αs2-CN和β-LG等对比分析.但该结果可初步判定羊乳αs1-CN抗原表位合成多肽具有免疫反应性，后续进一步通过动物实验验证其多肽是否具有免疫原性产生抗体.该研究综合三种软件预测参数得到牛乳αs1-CN可能抗原表位为22～26，86～87，99～102，118～120，148～149，185～186，189～210，羊乳αs1-CN可能抗原表位为18～19，27，30～31，83～84，99～103，117～119，140～142，205～210.分析比较牛羊乳αs1-CN B细胞线性抗原表位差异，与牛乳αs1-CN抗原表位相比，羊乳αs1-CN同样具有相当的抗原表位区域.因此，可以初步确定羊乳中虽含有少量的αs1-CN但其仍具有一定的抗原性.通过间接ELISA检测合成多肽的免疫性，实验表明合成多肽呈阳性反应，与抗体发生反应，具有免疫反应性，其免疫原性及过敏原性有待验证.【相关文献】[1] Kattan J D,Cocco R R,Järvinen K k and soy allergy[J].Pediatric Clinics of North America,2011,58(2):407-426.[2] Yibin Wang,Sha Xu,Yanmei Hou,et al. Recent advances in digestion,absorption and allergenicity of goat′s mil k[J].Hans Journal of Food and Nutrition Science,2012,1(4):29-33.[3] Monaci L,Brohée M,Tregoat V,et al.Influence of baking time and matrix effects on the detection of milk allergens in cookie model food system by ELISA[J].FoodChemistry,2011,127(2):669-675.[4] Monaci L,Tregoat V,Hengel A J V,et k allergens,their characteristics and their detection in food:A review[J].European Food Research and Technology,2006,223(2):149-179.[5] 焦凌梅,袁唯.改善山羊乳风味的方法研究[J].中国乳业,2006,26(6):56-58.[6] Ceballos L S,Morales E R,Adarve G D L T,et position of goat and cow milk produced under similar conditions and analyzed by identical methodology[J].Journal of Food Composition and Analysis,2009,22(4):322-329.[7] Hodgkinson A J,Mcdonald N A,Kivits L J,et al.Allergic responses induced by goat milk αs1-casein in a murine model of gastrointestinal atopy[J].Journal of DairyScience,2012,95(1):83-90.[8] Muraro M A,Giampietro P G,Galli E.Soy formulas and nonbovine milk[J].Ann Allergy Asthma Immunol,2002,89(1):97-101.[9] Soria Guerra R E,Nieto Gomez R,Govea Alonso D O,et al.An overview of bioinformatics tools for epitope prediction: Implications on vaccine development[J].Journal of Biomedical Informatics,2015,53:405-414.[10] El Manzalawy Y,Dobbs D,Honavar V.Predicting linear B-cell epitopes using string kernels[J].Journal of Molecular Recognition,2008,21(4):243-255.[11] Gao J,Kurgan putational prediction of B cell epitopes from antigen sequences[J].Methods in Molecular Biology,2014,1184(5):197-215.[12] Yang X,Yu X.An introduction to epitope prediction methods and software[J].Reviews in Medical Virology,2009,19(2):77-96.[13] Burland T G.Dnastar′s lasergene sequence analysis software[J].Methods in Molecular Biology,2000,132(3):71-91.[14] 单晓红.大豆和牛奶致敏原表位预测及加工对其抗原性和结构的影响[D].无锡: 江南大学,2013.[15] 吴序栎.牛乳β-乳球蛋白的检测及茶多酚对其免疫反应性影响的研究[D].广州: 华南理工大学,2012.[16] Maeda K,Mizukoshi F,Hamano M,et al.Development of an equine herpesvirus type 4-specific enzyme-linked immunosorbent assay ssing a B-cell epitope as anantigen[J].Journal of Clinical Microbiology,2004,42(3):1 095-1 098.[17] 刘银萍,王全立,张俊仙,等.结核分枝杆菌Rv1419蛋白抗原表位的预测[J].中国防痨杂志,2015,37(1):52-55.[18] 严小玲,何颖,陶爱林,等.猫主要过敏原Fel d1的二级结构及B细胞抗原表位预测[J].国际医药卫生导报,2011,17(9):1 025-1 028.[19] 朱倩倩,吴序栎,肖杰,等.腰果过敏原Ana o 2结构及抗原表位预测[J].食品与生物技术学报,2012,31(2):35-39.[20] 何颖,刘雪婷,王珊,等.乳胶过敏原Hev b 1二级结构及抗原表位的预测[J].国际医药卫生导报,2013,19(11):1 553-1 555.[21] 胡纯秋,高金燕,罗春萍,等.花生过敏原Ara h2.02二级结构和B细胞抗原表位预测[J].食品科学,2009,30(21):13-15.[22] 马凡舒,张蕾,王洋,等.B细胞抗原表位预测方法的研究进展[J].中国畜牧兽医,2016,43(1):63-67.[23] B Ruiter,V Trégoat,M Rabet L,et al.Characterization of T cell epitopes in αs1-casein in cow′s milk allergic,atopic and non-atopic children[J].Clinical & ExperimentalAllergy,2006,36(3):303-310.[24] Picariello G,Iacomino G,Mamone G,et al.Transport across Caco-2 monolayers of peptides arising from in vitro,digestion of bovine milk proteins[J].FoodChemistry,2013,139(4):203-212.[25] Sanz C L,Sanz Sampelayo M R,Gil E F,et al.Evaluation of the allergenicity of goat milk,cow milk,and their lactosera in a guinea pig model[J].Journal of DairyScience,2009,92(3):837-846.。
ie、db抗原表位
ie、db抗原表位在科学研究领域中，抗原表位是指能够与免疫系统中的抗体或T细胞受体结合的特定区域。
在这个主题下，我们将讨论IE和DB两种抗原表位的重要性和研究进展。
下面将从抗原表位的定义、IE抗原表位的研究和DB抗原表位的研究三个方面来展开论述。
抗原表位是指能够被抗体或T细胞受体识别并结合的特定区域，也称为免疫表位。
抗原表位通常负责诱导免疫系统产生针对特定抗原的免疫应答。
抗原表位可以是蛋白质、多肽、糖类、核酸等生物分子的一部分，其结构决定了是否能够与免疫系统中的免疫分子结合。
研究抗原表位有助于我们更好地理解免疫系统的功能和机制，并为疫苗研发以及免疫诊断和治疗提供理论依据。
一、IE抗原表位的研究IE抗原表位指的是能够与IE抗体结合的特定区域。
IE抗原表位在病毒感染和免疫应答中起着重要作用。
研究人员通过使用不同的方法，如免疫沉淀、质谱分析和生物信息学等，成功地鉴定出多个IE抗原表位。
这些研究成果为了解病毒感染的机制以及开发相关疫苗提供了重要依据。
二、DB抗原表位的研究DB抗原表位指的是与DB抗体结合的特定区域。
DB抗体在自身免疫性疾病的发生和免疫调节中扮演着重要角色。
随着人们对自身免疫性疾病的研究深入，DB抗原表位的研究也越来越受到关注。
通过使用免疫学实验和分子生物学技术，研究人员已经鉴定出多个与DB抗体结合的抗原表位。
这些研究有助于我们更好地理解自身免疫性疾病的免疫机制，并为疾病的早期诊断和治疗提供理论基础。
三、IE和DB抗原表位的重要性和研究进展IE和DB抗原表位的研究对于免疫系统的功能和疾病的防治具有重要意义。
通过深入研究IE和DB抗原表位，可以揭示不同病原体和免疫相关疾病的抗原表位特征，为相关疫苗的设计和开发提供指导。
同时，IE和DB抗原表位的研究也为免疫诊断和治疗提供了新的思路和方法。
近年来，随着生物技术和研究方法的不断发展，IE和DB抗原表位的研究也取得了许多重要进展。
通过结合分子生物学、免疫学和生物信息学等技术手段，研究人员可以更精确、快速地鉴定出抗原表位。
蛋白质抗原表位研究进展
收稿日期:2006204225;修回日期:20062092083通讯作者:毛旭虎,湖北人,教授,硕士生导师。
作者简介:李海侠(19802),女,硕士研究生,主要从事单克隆抗体,基因工程抗体和蛋白质抗原表位筛选及鉴定的实验研究。
E 2mail:yingchun1220@yahoo 蛋白质抗原表位研究进展李海侠综述;毛旭虎3审校(第三军医大学临床微生物及免疫学教研室重庆市生物制药工程技术研究中心,重庆400038)摘 要:本文综述了蛋白质抗原表位的种类及特性,回顾了近几年来实验确定和理论预测B 细胞蛋白质抗原表位的常用方法,介绍了表位作图和表位疫苗的研究现状。
关键词:抗原表位;噬菌体随机肽库;表位预测;表位作图;表位疫苗中图分类号:R 392.11文献标识码:A文章编号:100525673(2007)0120054205 免疫细胞通常难以借助其表面受体识别整个蛋白质抗原分子,而仅识别抗原肽分子上的一个特定部分即表位(Ep it ope ),又称为抗原决定簇(Antigen 2ic deter m inant )。
因而表位代表了抗原分子上的一个免疫活性区,负责与抗体分子或免疫细胞表面的抗原受体结合,严格说来,抗体的特异性是针对表位而不是针对完整的抗原分子的〔1〕。
一个蛋白质抗原,它不但含有B 细胞、Th 细胞、CT L 细胞、NK 细胞等与免疫识别密切相关的表位结构,同时还含有一些对于保护性免疫不利的结构。
如:毒性或抑制性表位、优势非中和性表位、病理及自身抗原交叉反应性表位等。
人们还认识到同一分子的众多表位中,各表位对抗原性的贡献不同,有优势表位和非优势表位之分。
此外,表位间的相对位置、构象特征、表位侧翼顺序等也与表位功能的表达密切相关。
而表位的功能表达还取决于MHC 限制位(Agret ope )、组织位(H ist ot ope )等相关结构。
许多研究发现,天然蛋白质在引发免疫反应时,不能满足清除病原体的需要。
抗原表位的分类和特征
抗原表位的分类和特征
抗原表位是指能够与抗原结合并引发免疫反应的特定区域，它可以分为以下几类：
1. 连续性表位（Continuous epitopes）：连续性表位是指抗原蛋白上具有一定连续氨基酸序列的区域，也称为线性表位。
这种表位通常出现在蛋白的螺旋、折叠或延伸区域。
连续性表位多数由线性的氨基酸序列组成，相对容易识别和结合。
2. 不连续性表位（Discontinuous epitopes）：不连续性表位是指抗原蛋白上的表位不是由连续的氨基酸序列组成，而是由分散的氨基酸残基组成。
这种表位通常由蛋白质在三维结构中相对靠近的氨基酸组成。
不连续性表位通常构成抗原蛋白的特定结构域，如折叠或结构域的交界处。
3. 表面表位（Surface epitopes）：表面表位是指位于抗原蛋白的表面上的表位，易于抗体发现并与其结合。
表面表位通常通过与抗体的可变区域相互作用引发免疫反应。
特征方面，抗原表位具有以下特点：
1. 特异性：抗原表位具有特异性，即只与特定的抗体结合。
它们能够唯一识别并结合与其相互作用的抗体分子。
2. 变异性：抗原表位的变异性表示它们在不同的抗原中可能会发生变化。
这意味着同一个表位可能在不同的抗原中具有不同的氨基酸序列。
3. 免疫原性：抗原表位能够引发免疫反应，激发机体产生特异性抗体，以及效应性T细胞等免疫细胞的免疫应答。
4. 重复性：某些抗原表位可能在同一个抗原中重复出现，从而增加免疫系统检测和识别的机会。
总的来说，抗原表位的分类和特征对于了解免疫反应的机制、抗原-抗体相互作用的基础和免疫诊断等方面具有重要意义。
蛋白质聚集对免疫原性的影响与评估方法
蛋白质聚集对免疫原性的影响与评估方法蛋白质是生命活动的基础，它们在细胞内发挥着重要的功能。
然而，蛋白质聚集的现象可能对其免疫原性产生影响。
本文将探讨蛋白质聚集对免疫原性的影响以及常见的评估方法。
一、蛋白质聚集对免疫原性的影响蛋白质的免疫原性指的是其作为抗原激发机体免疫反应的能力。
蛋白质聚集可能改变其空间结构、生物活性和抗原表位的可用性，从而影响其免疫原性。
1. 影响空间结构：蛋白质聚集过程中，蛋白质分子可能形成聚集态或聚集体。
这些聚集体的形成可能导致原本规则的空间结构发生改变，从而影响其免疫原性。
2. 改变生物活性：蛋白质聚集可能导致其生物活性的改变。
一些蛋白质在聚集过程中可能失去原有的功能，或者形成新的功能，这些变化可能影响其在免疫系统中的抗原特性。
3. 影响抗原表位可用性：蛋白质的抗原性通常与其特定的抗原表位有关。
蛋白质的聚集可能导致抗原表位的埋藏或者部分掩盖，从而减弱或改变其抗原性能。
以上这些影响因素可能导致蛋白质聚集后的免疫原性发生变化，这对于相关领域的研究和应用具有重要的意义。
二、评估蛋白质聚集的方法为了准确评估蛋白质聚集对免疫原性的影响，科研人员们提出了多种方法，下面介绍几种常见的评估方法。
1. 光学显微镜观察光学显微镜是一种最常用的观察蛋白质聚集的方法，它可以通过放大蛋白质样品的图像，直观地观察到聚集体的形成和分布情况。
这种方法可以初步判断蛋白质的聚集状态，并提供有关聚集程度和形貌的信息。
2. 动态光散射动态光散射（DLS）是一种可以测量蛋白质颗粒大小和浓度的方法。
通过测量悬浮液中散射光的强度和时间相关性，可以获得蛋白质聚集态的信息。
DLS可以对样品进行快速分析，是评估蛋白质聚集程度和稳定性的常用手段。
3. 微流控电泳微流控电泳是一种利用电场对微小颗粒进行操控和分离的方法。
将蛋白质样品置于微流控芯片中，在电场的作用下，蛋白质会按照大小和电荷进行迁移。
通过观察蛋白质的迁移速率和分离情况，可以评估样品中蛋白质聚集的程度。
抗原表位的意义及分类
抗原表位的意义及分类摘要：一、抗原表位的概念与作用二、抗原表位的分类1.连续抗原表位2.离散抗原表位3.共同抗原表位4.独特抗原表位三、抗原表位在免疫反应中的应用四、抗原表位的研究意义与展望正文：抗原表位是抗原分子上具有免疫活性的特定化学基团，能够与免疫细胞表面的抗体结合，诱导免疫应答反应。
抗原表位在生物学和医学领域具有重要的研究价值，对抗原表位的深入了解有助于疫苗设计、免疫诊断和治疗肿瘤等领域的发展。
抗原表位可以根据其性质和功能进行分类：1.连续抗原表位：存在于蛋白质抗原中，具有连续的氨基酸序列。
连续抗原表位通常具有较高的可变性，使得抗原分子能够逃避宿主免疫系统的识别和清除。
2.离散抗原表位：分布于抗原分子上的不连续区域，通常具有较高的保守性。
离散抗原表位在诱导免疫应答反应中起到重要作用，是疫苗设计和免疫诊断的研究重点。
3.共同抗原表位：存在于多个不同抗原分子上，具有相似的氨基酸序列。
共同抗原表位可诱导交叉免疫反应，有助于筛选具有广泛保护作用的疫苗抗原。
4.独特抗原表位：具有高度特异性的抗原表位，通常与病原体的种属特异性相关。
独特抗原表位在病原体诊断和疫苗研究中有重要意义。
抗原表位在免疫反应中起到关键作用，它们与抗体结合后，可诱导B细胞产生免疫球蛋白，激活T细胞，并促使效应细胞发挥抗病原体作用。
此外，抗原表位的研究对于疫苗设计和免疫诊断试剂的开发具有重要意义。
随着生物技术的不断发展，对抗原表位的研究将更加深入，为疫苗研发、免疫诊断和治疗肿瘤等领域带来新的突破。
总之，抗原表位作为抗原分子上具有免疫活性的特定化学基团，对抗原表位的深入了解有助于疫苗设计、免疫诊断和治疗肿瘤等领域的发展。
抗原表位
研究方法
2.2 基因工程法（噬菌体随机肽筛选法）
该法先利用基因克隆技术将合成的 一组寡核苷酸混合物（小肽基因混 合物）克隆至线性噬菌体基因组中 ，使之以融合蛋白的形式在噬菌体 的外壳蛋白的氨基端表达。再利用 生物素或酶标记的抗体筛出特异的 噬菌体，并进行扩增，再筛选，从 结合特异抗体的噬菌体DNA序列推 断出氨基酸序列，并合成相应的短 肽，验证筛选结果。
从软件预测出的抗原表位须用实验来进一步验证。
以往合成的序列肽仅模拟蛋白质的线性表位，这无疑会遗漏众 多的构象性表位信息。近些年来,随着生物信息学和分子生物 学技术的飞速发展，采用计算机预测和试验相结合的方法进行 构象性表位分析和定位得到了迅速发展，一些可用的基于Web 的预测软件已经公布，如 CEP软件、DiscTope 软件和 MEPS软 件。
缺点是其所用的数据库有限，并且连续位点内的残基被认为 是同等重要的。显然那些不重要的残基归入计算会明显降低 相关性。
(4)可塑性方案(Flexibility)
指蛋白抗原构象不是刚性不变的，其多肽链骨架有一定程度 的活动性，活动性强的氨基酸残基即可塑性大的位点，易形 成抗原表位。Karplas 和Schulz基于已知结构的31个蛋白 质，发展了一种预测蛋白质片段活动性的方法。
可预测蛋白质β转角的有Chou-Fasman，Garnier，Cohen 等方法。其中各种方法预测的成功率均不超过65%。一般认 为Cohen方法对转角的预测正确率很高，对于已知折叠类型 的蛋白质(αα类，ββ类，α/β类)正确率高达95%，对于未知 结构类型的蛋白质，可用3种类型分别预测，3类预测一致 的转角对预测表位有帮助。
抗原表位的名词解释(一)
抗原表位的名词解释(一)抗原表位什么是抗原表位？抗原表位是指存在于抗原分子表面的特定结构区域，能够被免疫系统中特异性抗体或T细胞受体识别并结合的部分。
抗原表位在识别和激活免疫反应中起着关键作用。
常见的抗原表位类型包括：1.线性抗原表位：线性抗原表位是由抗原分子上的连续氨基酸序列组成的，通常由五到六个或更多氨基酸残基组成。
例如，许多病毒蛋白质表面会暴露出一些线性抗原表位，如流感病毒的血凝素蛋白上的HA1域。
2.构象抗原表位：构象抗原表位是指抗原分子的三维结构特定区域，由一些非相邻的氨基酸残基组成。
这种表位往往是由抗原分子的折叠方式决定的，因此对抗原的二级、三级结构具有较高的依赖性。
例如，肿瘤抗原HER2/neu上的一些融合肽，其构象抗原表位对于抗体识别和结合起着重要作用。
3.外源抗原表位：外源抗原表位是由外源生物体产生的，如病毒、细菌、真菌等。
外源抗原表位通常与病原体的毒素、蛋白质或结构组分相关联，并被免疫系统识别为异物。
例如，HIV病毒表面糖蛋白gp120上的一些抗原表位。
4.自身抗原表位：自身抗原表位是由宿主自身产生的，代表了机体自身组织的一部分。
自身抗原表位在某些疾病中可能引发自身免疫反应，导致免疫系统攻击健康组织。
例如，系统性红斑狼疮中的核糖体抗原表位。
抗原表位的重要性：抗原表位是免疫系统识别和攻击入侵病原体的关键因素。
通过与抗原表位结合，免疫系统可以产生特异性的抗体或激活特异性的T细胞反应，进而清除和抵御病原体。
因此，研究抗原表位对于疫苗设计、疾病诊断和治疗等方面都具有重要意义。
•抗原表位的确定可以帮助科学家设计疫苗。
通过研究病原体上的抗原表位，科学家可以了解到哪些区域是免疫系统所识别和攻击的靶点，从而设计出能够产生特异性免疫应答的疫苗，提供针对性的免疫防护。
•抗原表位的检测可以用于疾病的诊断。
许多疾病都会导致抗原表位的改变或产生新的抗原表位，通过检测特定的抗原表位，可以帮助医生确定疾病的存在以及疾病的类型和进展情况，为疾病的治疗和监测提供重要参考。
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有鉴定表位的相关技术和文献。
也有一些表位预测软件。
一般来说，目前研究主要集中在线性表位上，而构象表位的预测和鉴定方法目前不是很成熟。
找到一个帖子，楼主可以参考：1、B细胞表位预测对于多种免疫学研究是必不可少的。
针对不同的蛋白，应选择不同的方法。
一般来说，蛋白质的C端具有较好的亲水性、表面可及性和柔性，所以是很好的抗原决定簇区域。
本课题选用的蛋白质C-末端序列标签都是唯一的、或是其家族中的几个成员所共有的。
在人蛋白质中，约81%的蛋白质其C末端的5个氨基酸残基的小肽是该蛋白质所特有的，制备针对蛋白质C末端小肽的抗体，常常能得到特异性识别该全蛋白的抗体。
另外，蛋白的二级结构是B细胞表位计算机预测的重要参数之一，β转角为凸出结构，多出现在蛋白质抗原表面，有利于与抗体结合，较可能成为抗原表位。
而α螺旋和β折叠结构规则不易变形，较难结合抗体，一般不作为抗原表位。
含有5个以上的氨基酸残基的转角又常称为环(loop)。
以往的研究表明，蛋白表面的loop区可能为功能性抗体的识别位点，特异性好，可及性强。
本课题选用的HPO、G-CSF、HSA空间结构已明确，所以直接选择loop区或无规卷曲作为B细胞表位。
举例：人Pif1基因编码至少两种蛋白亚型，分子量分别为74kDa和80kDa，与酵母具有高度的同源性，α型和β型Pif1只有C末端不同[20>，其余部分完全相同，并且二者的C末端在蛋白数据库中都是唯一的，选择α型和β型的C末端作为B细胞表位，既满足特异性的需要，也能区分亚型。
GPAA1是一种跨膜蛋白，原核表达非常困难，形成包涵体，且包涵体难以溶解和复性。
对这一类型的蛋白，非常适合选择其特有的B细胞表位免疫动物，来最终制备识别全蛋白质的抗体。
ABCpred是基于人工神经网络模型的线性B细胞表位预测工具，该系统检验了源于Bcipep数据库的700个非冗余B细胞表位和源于Swiss-Prot 数据库的700个长度为10~20个氨基酸的随机选择多肽，准确率近66%。
Bepipred 结合隐马尔科夫模型和亲水性参数评分预测线性B细胞表位，AROC评分达到0.671。
将两种预测方法得到的预测结果进行比较，其共有的预测表位是真正B细胞表位的几率更大，如果能进一步结合蛋白质二级结构预测结果，就可以选出可信度更高的B细胞表位。
如何选择有效的B细胞表位是能否实现无完整蛋白质抗原条件下抗体制备的关键。
2、对于B细胞表位的选择，对于已有空间结构信息的蛋白质抗原，直接选择蛋白分子表面的loop区或无规卷曲区域的小肽序列作为候选B细胞表位；对于缺乏空间结构信息的蛋白质抗原，需要根据蛋白质抗原的特点具体分析。
若蛋白质抗原C末端的序列亲水性好，可以选择C末端的6～10个氨基酸的序列作为候选B细胞表位，并且最好该序列为该蛋白质所特有；也可采用B细胞表位预测程序进行分析，选择不同程序预测的共有B细胞表位；对于同源性很高的家族蛋白，根据序列比对结果选择差异较大的区域，并且所选序列应该符合B细胞表位的特征。
基于以上原则，本实验选择了10个蛋白的14个表位，并对其中的12个表位进行了验证。
3、对于B细胞表位的选择，（1）对于空间结构已知的蛋白质，直接选择蛋白分子表面的loop区或无规卷曲区域的小肽序列。
（2）对于空间结构未知的蛋白质，可采用以下策略进行选择：A：若蛋白质C末端序列的亲水性好，可以选择C末端的6～10氨基酸的序列作为候选B细胞表位，最好该序列为该蛋白质所特有。
可采用SIB BLASTNetwork Service （http://www.expasy.ch/tools/blast/）的BLAST软件进行比对，数据库选择homo sapiens；B：采用B细胞表位预测程序ABCpred和BepiPred等进行表位预测，选择不同程序预测的共有B细胞表位；C：对于同源性很高的蛋白质，首先根据序列比对结果选择差异较大的区段，并且所选序列应该符合B细胞表位的特征。
4、二级结构预测分别应用EX-PASY服务器(http: //www. expasy. org/tools)上的GOR4[4>、HNN (Hierarchical Neural Network meth-od)、SOPMA、nnPredict[University ofCalifornia atSanFrancisco (UCSF)>等方法。
亲水性、柔韧性、表面可能性和抗原表位预测应用DNAstar软件的子程序Protean,采用Hopp-Woods和Kyte-Doolittle方案预测氨基酸的亲水性[5, 6>,采用Karplus-Schultz和Emini方案预测柔韧性及表面可能性[7, 8>,采用Jameson-Wolf方案[9>和吴氏抗原指数法[10>预测潜在的B细胞抗原表位。
5、对获取序列的生物信息学处理分析使用DNASTAR软件分析获取的序列,结合NCBI上的BLAST寻找最匹配的短序列。
用全部和部分肽序列查询各国专利数据库:http: //appft1. uspto. gov/netahtml/PTO/search-adv. ht/http: //www. freepatentsonline. com /5194592. htm /http: //www. stcsm. gov. cn/resource/data/zhuanl.i asp#1使用蛋白质在线分析工具分析多肽的疏水性、PI值、稳定性:http: //www. expasy. org/http: //www. rcsb. org/pdb/cgi/explore. cg?i pdbId=1fi6http: //www. rcsb. org/pdb/search/searchSequence. dohttp: //www. expasy. org/sitemap. htmlhttp: //www. expasy. org/tools/#translatehttp: //www. expasy. org/tools/blast/常用数据库和预测工具：名称网址说明ABCpred http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred人工神经网络线性B 细胞表位预测工具AgAbDb http://202.4 1.70.51:8080/agabdb2/ 抗原-抗体共结晶结构的分子相互作用数据库AntiJen /AntiJen B 细胞表位定量结合数据库Bcipep http://www.imtech.res.in/raghava/bcipep/ B 细胞表位数据库Bepipred http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred基于序列的线性表位预测工具CEP http://bioinfo.ernet.in/cep.htm基于结构的连续性和非连续性表位预测工具DiscoTope http://www.cbs.dtu.dk/services/DiscoTope基于序列/结构的非连续性表位预测工具Epitome /services/epitome抗原-抗体相互作用残基数据库HIV database /content/immunology HIV免疫表位数据库IEDB T细胞和B细胞表位数据库含阴性数据IEDB B-cell /tools/bcell/iedb_input基于序列的线性表位预测工具epitope tools6、B细胞表位预测的方法及应用线性表位的预测方法B细胞表位的预测方法主要集中于线性表位，在二十世纪七、八十年代发展起来的大量的预测B细胞表位的算法都是基于蛋白质序列。
这些算法包括：⑴蛋白质的亲水性算法(Hydrophilicity)：认为蛋白质各氨基酸残基可分为亲水残基和疏水残基两类。
在机体内，疏水性残基一般被埋在蛋白内部，而亲水性残基位于蛋白质表面，因此，蛋白的亲水部位与蛋白抗原表位有着密切的联系。
Hopp-Woods(Hoop TP et al.,1981)算法为最常用的。
⑵可及性算法(Accessibility)：常用的有Janin可及性参数，即指蛋白质抗原中氨基酸残基被溶剂分子接触的可能性(Rudolph R et al.,1990)。
它反映了蛋白质抗原各个氨基酸残基的分布情况。
⑶蛋白质可塑性算法(Flexibility)：此算法认为蛋白质抗原构象的多肽链骨架具有一定程度的活动性，活动性强的氨基酸残基即可塑性大，易形成抗原表位(Karplus PA et al.,1985)。
⑷蛋白质二级结构预测算法(Secondary structure)：该算法认为蛋白质二级结构与蛋白质表位的分布关系密切。
α螺旋、β折叠化学键键能比较高，形态固定，常处于蛋白质内部，难以与抗体嵌合，而β转角和无规则卷曲多处于蛋白质的表面，结构松散，易展示在蛋白质表面，有利于与抗体嵌合，成为抗原表位的可能性大(来鲁华,1993)。
⑸蛋白质抗原性算法(Antigenicity)：Welling(Welling GW.,1985)通过对20个已研究得很透的蛋白质的69个连续位点的606个氨基酸统计分析，用各氨基酸残基在已知B细胞表位中出现的百分率与其通常在蛋白质中出现的百分率比值的对数建立了抗原性刻度，并以此计算蛋白中各亚序列的抗原性。
这些方法的代表软件有PEOPLE(Alix AJ et al.,1999)、PREDITOP(Pellequer JL et al.,1993)、BEPITOPE(Odorico M et al.,2003)、Bcepred(Saha S et al.,2004)等。
但是最近Blythe及Flower(Blythe MJ et al.,2005)对氨基酸的性质与线性表位的关系做了一个评估，结果表明基于氨基酸序列信息来预测线性表位，即使很好的结合了氨基酸的各种性质，其预测结果仅略强于随机预测。
近年来，一些应用隐形马尔可夫模型(HMM)、人工神经网络(ANN)、支持向量机算法(SVM)及其他技术的机器研究方法(Ponomarenko JV et al.,2007)已经被引入来预测B细胞表位，取得了较好的结果。
代表软件有ABCpred(Saha S et al.,2006)、BepiPred(Larsen JEet al.,2006)、APP(Chen J et al.,2007)等。
ABCpred采用人工神经网络来预测线性表位，从Bcipep和SwissProt数据库中提取非冗余的表位肽和非表位肽作为训练集，采用5-折交叉验证，预测敏感性约为67%，特异性约为64%。