蛋白质免疫印迹技术

人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对
RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电
泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法
三、蛋白免疫印迹的应用

免疫印迹法 (immunoblotting test,IBT)，亦称酶联 免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB


抗体的结构
（二）用于免疫的动物

由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物 或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异 免疫应答的强弱是不同的。因此，进行动物免 疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康 动物。 常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一 般为6个月大小的动物。


动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得 抗血清数量。
抗原的提取与制备 1）0.5mg/mL菠萝蛋白酶以0.9%生理盐水溶 解配置（加少量NaOH促溶）（周二上、周五 上）。 2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。 3）1mg/mL酪蛋白以0.9%生理盐水溶解配置 （加少量NaOH促溶） （周四下午）。
苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠
标记部位 头 左前肢 组号 1 2

加强免疫：初级免疫后两周进行。 取1.5mL蛋白与1.5mL不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水 的形态。 加强免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.15mL/只小鼠

（1）用酒精棉球消毒待注射部位
（2）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL。 第二次加强免疫：加强免疫一周后进行。操作相同。 第二次加强免疫后一周，即可采血，收集抗血清。 小鼠取血。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃ 下，析出血清，离心，3000rpm,10min。吸出血清，分装 （0.05～0.2mL），贮于-20℃以下冰箱保存。

目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。

福氏佐剂（Freund adjuvant）, 通常是由羊 毛脂1份、石腊油5份。这是不完全福氏佐剂。
在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成 为完全佐剂。

（六）免疫方法

抗原剂量，首次剂量为10～50μ g，加强免疫的剂量 约为首次剂量的1/4。 首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫 时用不完全佐剂。 每2～3周加强免疫一次。

效价 抗血清的效价，就是指血清中所含 抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用 的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体 均适用。 某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的 抗体，可用双扩散等方法测定。

免疫扩散试验
1－抗原；2－7为不同稀释倍数的抗体
第二部分 Western－blotting 检测抗血清
（三）抗原

抗原是多种多样的，就其化学成分而言，有蛋白 质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。
为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。


不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种 免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性 基团、立体结构等。
（四）免疫途径

免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉



免疫原性（immunogenicity）是指抗原刺激机体引起免疫应 答的能力。 免疫反应性（immunoreactivity）是指抗原与相应免疫应答 产物(即抗体)在体内或体外发生特异性结合反应的能力。

抗原的分类

抗原可以分为完全抗原和半抗原。 完全抗原：具有免疫原性和免疫反应性的抗原称 为完全抗原（complete antigen） 半抗原：只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原 称为半抗原（hapten），也称为不完全抗原 (incomplete antigen)。与蛋白质结合后成为完 全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞 发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂 都属于半抗原。
学习掌握动物抗血清的制备原理及技术 通过实际操作学会动物抗血清的制备 掌握Western－blotting的基本原理 熟悉Western－blotting的实验操作
二、实验原理

第一部分
动物的常规免疫及抗血清的制备

第二部分 Western－blotting 检测抗血清
第一部分
动物的常规免疫及抗血清的制备

因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用 血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应 （serologic reaction）。
二、印迹法（blotting）

印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 （NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段 的方法，称为Southern 印迹法。

收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下， 过夜（切勿冰冻）析出血清，离心， 4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装 （0.05～0.2mL），贮于-80℃以下冰箱，或冻干后 贮存于4℃冰箱保存。
（八）抗血清质量的评价

在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在 不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能 发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血 清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后， 才可使用所取得的抗血清。



抗原抗体反应（antigen-antibody reaction）
是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发 生于体内（in vivo），也可发生于体外（in vitro）。


体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；
体外反应：可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应 及中和反应等各种不同的反应类型。



在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3mL血， 制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需 再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达 到预期水平时，即可放血制备抗血清。

抗体的产生顺序与丰度
（七）抗血清的采集与保存

取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血， 一是颈动脉放血，也可心脏采血。 小鼠取血。
样 品 制 备 电 泳
转 膜
杂 交
探 针 制 备 分 子 杂 交 原 理 及 流 程 图
结 果 显 示
Western Blot原理

将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上； 然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应；


洗涤去除没有结合的特异性抗体后；
加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗 体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合 的标记抗体； 加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等， 观察有无特异性蛋白条带的出现。


免疫印迹的实验包括五个步骤：
⑴ 固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。
⑵ 封闭：保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处 于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。




⑶一抗杂交：初级抗体（第一抗体）是特异性 的。 ⑷二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗 体是特异性结合并作为指示物。

将适当的抗原物质注入动物体内，经过一定时间，动 物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清 称为免疫血清。

优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫 原性，以及动物应答的能力。此外，尚需考虑免疫途 径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因 素。
（一）多克隆抗体的概念

抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。 由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接 受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体 （Monoclone antibody）。 由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种 各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起 就是多克隆抗体。 机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。

如要获得大量的抗体，多采用大动物； 如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物； 如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备 抗体； 如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯 系小鼠制备。


一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应 良好，而且能够提供足够数量的血清。
抗原和免疫原性

抗原（antigens，Ag）是指能够刺激机体免疫活性细 胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特 异性反应的物质。 常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋 白质、核酸、激素等有机物。 抗原具有两方面的特性：免疫原性（immunogenicity） 和免疫反应性（immunoreactivity）。

抗体的种类

抗体（antibodies，Ab)是专门对抗抗原特异 结构的球蛋白，故也称为免疫球蛋白 （immunoglobulins, Ig)。存在于血清、体液 中，是构成机体免疫作用的主要物质。
免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同， 分为五种类型： IgG、 IgA、 IgM、 IgD和 IgE。 人体血清中IgG含量最多， IgA次之， IgM较 少， IgD和IgE微量。
左后肢
背 右前肢 右后肢 左耳朵 右耳朵
3
4 5 6 7 8

初级免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.2mL/只小 鼠 （1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL 完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态
（2）用酒精棉球消毒待注射部位
（3）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL
初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，两 周后进行加强免疫