蛋白质免疫印迹技术及常见问题
免疫印迹实验注意事项
免疫印迹实验注意事项一、实验概述免疫印迹（Western blot）是一种重要的蛋白质检测技术，在生物医学研究中被广泛应用。
该实验通过将蛋白质样品经电泳分离，并将其转移到膜上，最终使用特异性抗体探测目标蛋白质。
然而，为了确保实验结果的准确性和可靠性，实验过程中需要注意以下事项。
二、实验仪器和试剂准备在进行免疫印迹实验之前，需要准备合适的仪器和试剂。
以下是一些注意事项：1. 仪器准备•确保电泳仪、转印仪和成像仪等仪器的功能正常，并进行必要的校准和测试。
•清洁仪器，避免污染和干扰实验结果。
2. 试剂准备•使用优质的试剂，并根据说明书正确配制试剂溶液。
•为避免批次差异，建议每次实验使用同一批试剂。
•试剂保存在适当的温度和条件下，以保证其稳定性。
3. 溶液准备•使用无菌、纯净的水和试剂配制实验所需的溶液。
•确保溶液的 pH 值正确，并进行必要的调整。
•溶液保存在适当的温度和条件下，避免污染和变质。
三、实验操作注意事项在进行免疫印迹实验时，需要注意以下操作事项：1. 样品处理•样品的制备和处理应严格按照实验要求进行，以确保样品的完整性和稳定性。
•样品处理过程中应尽量避免使用可能影响蛋白质结构和功能的试剂和条件。
2. 蛋白质的电泳分离•样品电泳前，必须对电泳胶进行适当的处理和准备，确保其质量和性能。
•样品电泳条件的选择要考虑样品性质和目标蛋白质的分子量等因素。
•电泳过程中，要严格控制电流和电压，避免产生异常结果。
3. 转膜过程•使用合适的滤纸和膜材料，并按照正确的方法和条件进行转膜操作。
•转膜时间和电压的选择要根据蛋白质的分子量和转膜效率进行调整。
4. 抗体探测和成像•使用具有较高亲和力和特异性的抗体进行探测，以提高结果的准确性和可靠性。
•抗体的浓度和反应时间应根据需要进行调整，避免产生过度或不足的信号。
•成像过程中，要确保暗室环境的光线充足、胶片或成像仪的参数设置正确。
5. 数据分析和结果解读•在进行数据分析和结果解读时，应使用合适的软件和方法，确保结果的准确性和可靠性。
蛋白质免疫印迹技术
将蛋白质免疫印迹技术与基因测序技术相结合，有助于解析基因表达与蛋白质功能之间的关联，为精准医学和个性化 治疗提供有力支持。
与单细胞测序技术结合
通过将蛋白质免疫印迹技术与单细胞测序技术相结合，可以在单细胞水平上研究蛋白质的表达和功能， 揭示细胞异质性和疾病发生发展机制。
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改进方向
优化样品处理方法 简化样品制备过程，提高处理效 率，降低对实验技能的要求。
提高检测灵敏度和特异性 通过改进技术和方法，提高蛋白 质免疫印迹技术的检测灵敏度和 特异性，进一步减少背景干扰和 假阳性结果。
缩短实验周期 通过改进技术和方法，减少实验 步骤和时间，提高实验效率。
降低成本 寻找更经济实惠的抗体、显影剂 和其他试剂，降低实验成本。
研发自动化、智能化的蛋白质免 疫印迹系统，简化操作流程，减 少人为误差，提高实验效率和准 确性。
定量分析能力
发展蛋白质免疫印迹技术的定量 分析能力，实现蛋白质表达水平 的准确测量，为深入研究生物过 程和疾病机制提供有力支持。
应用领域的拓展
临床诊断
将蛋白质免疫印迹技术应用于临床诊断，为疾病诊断、病情监测和 预后评估提供可靠的蛋白质标志物检测手段。
转膜
选择合适的转移膜
根据实验需求，选择适当的转移 膜，如硝酸纤维素膜或聚偏二氟
乙烯膜。
预处理转移膜
将转移膜在缓冲液中浸泡，使其充 分湿润。
转膜
将凝胶上的蛋白质条带转移到预处 理的转移膜上，完成转膜过程。
抗体孵育与显色
01
一抗孵育
将特异性抗体与转印到膜上的蛋 白质进行孵育，使抗体与目标蛋 白质结合。
原理
基于抗原-抗体反应的特异性，通过将蛋白质样品电泳分离后转印至固相支持物 上，再与特异性抗体进行反应，通过显色反应检测目标蛋白质的存在、表达量 及修饰状态等信息。
蛋白Western blot电泳——试验中常见问题及解答
蛋白质电泳与western blot1Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。
（1）原理（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题 3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题 9. 条件的摸索10. 方法的介绍 11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
（3）主要试剂1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
western blotting(蛋白免疫印迹)
7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分
子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开 二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解 聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结 合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。 ③ 蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量 ，而与其形状及所带电荷的性质无关。
电泳缓冲液：pH8.3 Tris- 甘氨酸系统
12
PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，简称PAG): 单体 丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂 过硫酸铵 三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有 一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质， 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电 泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)。
对 策
5. 抗体浓度过高
35
Thanks！
36
压太高。转膜过程注意降温
34
四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 2. 3. 4. 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉 反应
1. 转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
蛋白质免疫印迹技术详解
1
主要内容
一、Western Blot 简介 二、Western Blot 一般流程
WB实验常见问题与解决方案讲座
含SDS 不含SDS
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗的种属来源： 一般市面上主要的一抗来源是鼠和兔，一抗的选择 应与你现有的二抗相匹配，例如：
如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选 ，
抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）； 如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体或者兔 单抗，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗属于哪个类或亚类：
针对单克隆抗体，除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需 与一抗的类别或亚类相匹配。
单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述， 如果您的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM抗体。如果 单克隆一抗是小鼠 IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么 几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者您也可选择专门针对这一亚类 的二抗，例如，如果您的一抗是小鼠IgG1，那么您可以选择抗IgG1的二抗 ，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
抑制剂名称
作用
PMSF
抑制丝氨酸蛋白酶
EDTA
抑制金属蛋白水解酶
Cocktail(蛋白酶抑 根据混合物的成为不同，抑制各种蛋白酶的作用 制剂混合物) （一般包括PMSF ，EDTA ，胃蛋白酶抑制剂 ， 亮抑蛋白肽酶 等蛋白酶抑制剂混合物）
Na3VO4
激活的矾酸钠具有抑制去磷酸化的作用
（原矾酸钠）
NaF （氟化钠）
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
抗体的交叉反应： 交叉反应：有时一种抗体可以与分子结构并不完全相同 但具有类似抗原决定簇的不同抗原起反应。
例如：你想做人和大鼠的实验，那么就希望买的抗 体可以同时针对人和大鼠，相反如果有人只做一个种属 的试验，那么可能就希望抗体的特异性更高点，那么就 和其他种属的交叉反应越少越好
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
western blot实验技术及常见问题探讨-珍藏版
6 反应显色
•辣根过氧化物酶法（HRP）
•碱性磷酸酶法（AP）
•化学发光显色法(HRP)
A液
B液
ECL工作 混合 液
暗室操作！
1
:
1
膜
在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶 或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的 底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的 产物；而辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物， 将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯 萘酚氧化成蓝色产物。
膜的选择：
最常用于Western Blot的转移膜主要是 硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚 偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维 素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似, 主要用于核酸杂交。
几种膜的对比
3
目的蛋白 与其它蛋白 的互作
2
目的蛋 白的表达 量分析
4
二 Western Blot技术流程
蛋白样品的制备
•SDS-PAGE •转膜
•封闭
•一抗杂交
•二抗杂交 •底物显色
1.蛋白样品的制备
通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白
水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白
质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性
一般封闭条件为：室温或者 37℃缓慢摇荡 1～2h，特殊情况也可 4℃过夜，根据结果情况 调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 BSA 比 脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗 体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背 景。封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合 的封闭试剂。洗涤液使用TBST 或者PBST。
蛋白质印迹技术及实验中常见问题分析
Western blot ：
➢ 把电泳分离的蛋白质转移到固定膜上，并用抗原抗 体反应进行特异性目的蛋白的检测的过程。
➢ 是集电泳、转印和免疫标记为一体的蛋白质分离检 测技术,结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定 的特异敏感等特点，可检测到低至1～5ng（最低可 到10－100pg）的靶蛋白。
Western blot ：
在待分离蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互 作用的缓冲液都可以使用。常见的凝胶电泳缓冲液有两 种： Tris-甘氨酸：分离范围宽，可用于分离分子量
•快速5～15分钟， 颜色稳定； •深浅随不同蛋白质 变化; •标准曲线有轻微的 非线性
•较快40分钟内， •抗干扰能力强
二.SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE电泳，是在PAGE系统中引进SDS（十二烷基硫 酸钠）
同时电泳系统中存在强还原剂（DTT或β-巯基乙醇）能使半 胱氨酸之间的二硫键断裂，使得ＳＤＳ-ＰＡＧＥ的电泳中 的蛋白处于完全变性状态
概论
Sout概her论n blot
The Southern blot is used for DNA analysis and was routinely used for genetic fingerprinting and paternity testing prior to the development of microsatellite markers for this purpose.
考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合呈蓝 色，在波长595nm 吸收峰，在一定的 范围内与蛋白质的 含量呈线性关系
高 （约1～5μg/ml）,
BCA法基于双缩脲 很高 原理，碱性条件下 （0.5-20μg/ml ） 蛋白质将Cu2+还原 成 Cu+ ，BCA螯合 Cu1+ 作为显色剂， 产生兰紫色并在 562 nm有吸收峰
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转膜后的封闭
脱脂奶粉
BSA
Western Blot 膜封闭液
（生物试剂公司提供）
把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤 膜面积以0.1ml/cm2的量加入封闭剂，摇床上平缓摇动，于室 温温育1-2小时。倒掉缓冲液，立即加入一抗溶液与滤膜温育。
一抗、二抗孵育
一抗用量也根据0.1ml/cm2来计算，室温1-2小时。 倒掉一抗溶液，用250ml PBS漂洗液滤膜3次，每次 10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育 1-2小时。
HRP-DAB底物显色试剂 盒免疫组化中的应用
Pro-light HRP 灵敏度检测试验
Pro－Light HRP 化学发光
试剂盒检测结果
TIANGEN BIOTECH（BEIJING）CO., LTD.
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Western blot常见问题—蛋白转膜效率低
1. 2. 3. 4.
蛋白分子量< 10KD 蛋白的等电点=8 SDS浓度不合适 凝胶太厚
1. 蛋白分子量<10KD时，减 少转膜时间；使用小孔径 的膜 2. 更换高pH值Buffer 3. 在阴极buffer中加入 0.005 - 0.01% SDS 可提 高转膜效率 4. 延长转膜时间
4. 温度合适，受热不均匀导致胶
聚合不均匀 5. 两块玻璃板底部要对齐
Western blot常见问题—SDS-PAGE电泳
1. 条带比正常的窄？ 2. “微笑”或“倒微 笑”条带？
1. 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量 混合均匀，动作轻缓 2. 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小 心，以免把上样带扭曲 3. 样品盐浓度过高会挤压其他条带 导致宽窄不一，纯化样品，调整 盐浓度 4. 胶板底部有气泡会影响电泳效果， 应赶走气泡。同时注意电泳槽装 置是否合适
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度 （％）
线性分离范围 （KD)
15 10 7.5
5.0
12-43 16-68 36-94
57-212
转膜
价格便宜 硝酸纤 维素膜
简单快速封闭非特异性抗体结合
膜的选择
封闭非特异性抗体结合麻烦
尼龙膜
价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
（尼龙膜： 480µ g/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µ g/cm2 ）
内容概要 Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
Western blot常见问题—SDS-PAGE电泳
1. 胶板洗刷干净 2. 加入AP和TEMED的量要合适 1. 胶不平？ 2. 凝胶漏液？ 3. 加入试剂后摇匀，使其充分混 合，防止部分胶块聚合不均匀
1. 制备单克隆抗体或者重新选 取合成抗原多肽的位点 2. 设立不加一抗，只加二抗的 平行对照来检测二抗是否有 非特异结合
参照体系
分子量Marker：确定蛋白条带的分子量 已知量标准产物的正对照 空白载体对照：如果是表达蛋白需要做表达前的 内参：看家基因编码表达的蛋白
TIANGEN产品结构—底物显色液
免疫印迹技术的基础-免疫反应
免疫测定(immunoassay) 利用抗原抗体
反应来测定标本中抗原或抗体的方法 检测对象：具体免疫活性的物质 反应特性：高度的特异性和敏感性
内容概要 Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
Western blot常见问题—显色背景高
1. 2. 3. 4.
5.
膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交 叉反应 抗体浓度过高
1. 转膜前用100%甲醇将膜 完全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
Western Blot 原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一 种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot 的应用
目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析
内容概要 Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
二抗与底物反应显色
•辣根过氧化物酶法
•碱性磷酸酶法
•化学发光显色法
Anti－His
应用举例：用Western blot检测患者 血清中的HIV病毒抗体
Step1：经电泳将HIV混合抗原按分子量大小分离 Step2：印迹转移已分离的抗原至硝酸纤维膜上，封闭 Step3：加入待检病人血清，漂洗 Step4：加入合适的、标记的二抗（HRP或AP），漂洗 Step5：加入显色底物（或放射自显影），显色检测
Western Blot 流程
转膜 封闭
蛋白样品的制备
一抗杂交
二抗杂交 底物显色
•SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白样品的制备
通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白
水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统水 溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶
剂 。系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时， 不再受蛋白质电荷与形状的影响， 而只取决于蛋白质分子量的大小。
凝胶成分
N,N’-亚甲双丙烯酰胺和丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液
TEMED
过硫酸铵
Tris-甘氨酸电泳缓冲液
Western blot常见问题—转膜及抗体检测
1. 凝胶肿胀或卷曲？ 2. 条带歪斜或漂移？ 3. 单个或多个白点？
4. 转膜缓冲液过热？
1. 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓 冲液中浸泡5-10min 2. 电转仪长期使用导致海绵变薄， “三明治”结构不紧凑导致。可 在两块海绵之间垫上少许普通的 纸片 3. 确保膜和胶块之间没有气泡 4. 缓冲液中离子浓度太低，电流或 电压太高。转膜过程注意降温
HRP底物显色液 HRP-DAB底物显色试剂盒 增强型HRP-DAB底物显色试剂盒 沉淀型单组分TMB底物溶液 AP底物显色试剂 BCIP/NBT底物显色试剂盒
可溶型单组分TMB底物溶液
Pro-light HRP 化学发光检测试剂
HRP-DAB底物显色试剂盒应用
HRP-DAB底物显色试剂 盒Western blot中的应用
Western blot常见问题—杂交信号弱
1. 抗体保存不当 2. 抗原不充足 3. 膜的漂洗过度
1. 抗体长期保存应在－70℃， 使用前做效价检测 2. 增加蛋白上样量，做已知标 准量蛋白的对照 3. 减少漂洗的时间和次数
Western blot常见问题—显现非特异性条带
1. 一抗不是唯一特异的 2. 二抗出现非特异结合
特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱
需要更大的机械强度
转膜方法
湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在 转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。
半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓 冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。
转膜后检测
丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。
有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括 乙醇、丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
蛋白样品的定量
Bradford法
考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓
度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结 合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值， 化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 TIANGEN产品 Bradford蛋白质定量试剂盒