荧光显微成像技术在生物医学研究领域的应用
一体化荧光显微成像系统用途
一体化荧光显微成像系统是一种集成了光学、机械、电子和软件技术的高级显微镜系统，主要用于观察、分析和记录荧光标记的生物样本或其他具有荧光性质的物质。
以下是一些该系统的主要用途：
1. 生物医学研究：在生物医学领域，荧光显微成像系统被广泛应用于细胞生物学、分子生物学和神经科学等研究。
通过荧光标记，可以观察和跟踪细胞结构、蛋白质分布、细胞器运动等生物学过程。
2. 药物研发：荧光显微成像系统在药物研发中发挥关键作用，用于研究药物在细胞水平的作用机制、药效评估以及药物释放和分布的动态过程。
3. 医学诊断：荧光显微成像系统可用于医学诊断，例如通过观察组织标本中的荧光信号来检测癌症细胞或其他病理性变化，提高诊断的准确性。
4. 材料科学：在材料科学领域，荧光显微成像系统可以用于研究材料表面、结构和性质，尤其是对于荧光标记的纳米材料或生物材料的表征。
5. 环境监测：荧光显微成像系统也可应用于环境监测，例如通过荧光标记来追踪污染物在水体中的传播和分布，提供环境污染状况的实时监测。
6. 教育和培训：荧光显微成像系统在教育领域被广泛用于生物学和医学专业的教学和培训，为学生提供直观的观察和实验体验。
总体而言，一体化荧光显微成像系统在许多科学和应用领域都发挥着重要的作用，为研究人员和专业人士提供了强大的工具来深入理解和研究微观世界。
光学显微成像技术在生物医药领域的应用
光学显微成像技术在生物医药领域的应用随着生物医药领域的不断发展，越来越多的疾病需要从细胞层面进行研究和治疗。
在这个过程中，成像技术起到了重要的作用。
光学显微成像技术是一种非侵入性的成像技术，可以在生物样本的活体条件下进行。
本文将介绍光学显微成像技术在生物医药领域的应用及其发展趋势。
一、荧光成像技术荧光成像技术是通过活体样本内标记的荧光染料，将荧光信号转换成可视化图像的技术。
荧光成像技术可以用于细胞、组织、器官和整个生物体的研究。
其中，基于扩增出的荧光蛋白基因（GFP）和注射标记的荧光染料的技术最为常用。
在生物医药领域，荧光成像技术主要用于活细胞分子动力学和蛋白质互作的研究。
例如，荧光成像技术可以用于实时监测细胞分化、细胞凋亡和细胞移动等过程。
此外，荧光成像技术还可用于碳水化合物代谢通路和细胞信号通路、肿瘤细胞分裂等生物过程的研究。
二、切片显微成像技术切片显微成像技术是一种高分辨率的成像技术，可用于在细胞和组织层面上研究医疗、生物化学、生理学和病理学过程。
在成像期间，光束被聚焦在样本表面，然后通过样品的深度切片收集数据。
此外，它还可以用于从单个细胞到整个生物器官的研究，例如神经元的二元配对、心脏细胞收缩过程和器官发生等。
切片显微成像技术在生物医药领域中的应用有很多。
例如，利用该技术可以研究神经元、活体细胞和组织中的变化、神经元网络中的结构和功能等。
在肿瘤研究方面，切片显微镜成像技术可用于研究癌细胞的生长、扩散及其影响周围细胞的方式。
三、吸收成像技术吸收成像技术通过利用样品对不同波长的光的吸收来成像，这种成像技术主要是基于医学影像技术的回声成像和X射线成像。
在生物医药领域，其主要应用于深层组织和类脑组织成像。
吸收成像技术的应用十分广泛。
例如，可以用于测量生物组织中的氧气饱和度、血流量、血管完整性和生物组织的电磁阻抗等。
此外，吸收成像技术还可以用于实时监测生物体内的血管和血流动态，帮助临床医生实现早期诊断和治疗。
荧光寿命显微成像技术
荧光寿命显微成像技术荧光寿命显微成像技术（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy，简称FLIM）是一种非侵入性的生物成像技术，通过测量物质荧光的寿命来获得关于分子结构、环境和相互作用的信息。
荧光寿命是指荧光分子从激发态退激到基态所需的时间，它受到环境因素和分子相互作用的影响，因此可以作为特征参数用于研究生物分子的动力学过程。
荧光寿命显微成像技术与传统的荧光显微镜相比，具有许多优势。
首先，荧光寿命不受荧光强度的影响，因此可以准确地测量弱荧光信号。
其次，荧光寿命可以提供关于分子的额外信息，例如分子的构象、聚集状态和与其他分子的相互作用等。
此外，荧光寿命显微成像技术还可以通过使用不同的荧光探针来标记不同的分子，实现多重标记和多通道成像，从而提高研究的信息量。
荧光寿命显微成像技术的原理是基于荧光分子的激发态寿命和退激过程。
当荧光分子受到激发光的照射时，部分荧光分子会被激发到激发态，然后在一定的时间内退激到基态并发射荧光。
荧光寿命的测量可以通过激光脉冲的时间分辨，或者使用连续激发光和时间分辨单光子计数器来实现。
通过对样品进行扫描，可以获得每个像素点的荧光寿命信息，从而构建出样品的寿命图像。
荧光寿命显微成像技术在生物医学研究中有广泛的应用。
例如，在细胞生物学研究中，荧光寿命显微成像技术可以用于研究细胞内分子的动力学过程，如钙离子的浓度变化、离子通道的活性调控等。
在分子生物学研究中，荧光寿命显微成像技术可以用于研究蛋白质的结构和功能，如蛋白质的折叠和聚集状态。
此外，荧光寿命显微成像技术还可以应用于药物筛选、细胞分化、肿瘤诊断和治疗等领域。
荧光寿命显微成像技术的发展还面临一些挑战和局限性。
首先，荧光寿命的测量需要高时间分辨率，因此需要使用高速激光和高灵敏度的探测器，这增加了设备的复杂性和成本。
其次，在实际应用中，荧光分子的寿命受到许多因素的影响，如温度、pH值、离子浓度等，因此需要对这些因素进行校正和控制。
荧光显微镜在细胞研究中的应用
荧光显微镜在细胞研究中的应用近年来，随着微生物学、生物学的不断发展，荧光显微镜在研究细胞方面的应用越来越广泛。
荧光显微镜是一种运用荧光效应观察红外线或紫外线激发后物体的发光情况的显微镜。
在细胞研究中，荧光显微镜有着突出的作用。
本文将就荧光显微镜在生物学、医学领域中的应用及未来发展方向进行探讨。
一、荧光显微镜在细胞生物学中的应用荧光显微技术是最早在生物领域中应用的显微技术之一，从20世纪60年代开始被用于细胞和分子生物学中。
荧光显微镜不仅可以非常准确地进行影像观察，而且对于不同标记物质的检测、标定和管理能力更胜一筹。
荧光显微镜有助于观察组织或细胞中某些特定的结构或分子，因为这些特定结构或分子被染色成荧光色。
例如，细胞骨架主要由微管和细胞质纤维支撑，并与细胞核、细胞质中的分子结合和交互作用相绕不解。
通过在这些骨架组分中标记荧光物质，荧光显微镜可以轻松地观察细胞骨架的运动和蛋白质聚集。
此外，荧光显微镜还能够研究细胞内酶的轨道、分泌囊泡、核酸、染色体和基因等结构，以及其他的细胞生物学和分子生物学组分。
二、荧光显微镜在医学领域中的应用随着生物技术的不断发展，荧光显微镜在医学领域的应用也不断创新。
在医学领域中，荧光显微镜广泛应用于各种诊断和治疗程序，如癌症检查、神经学研究、病毒学、药物研制等。
荧光显微镜可以用于研究癌症、识别肿瘤和追踪癌细胞的运动。
例如，科学家们使用荧光显微镜跟踪癌细胞的运动，以研究癌症是如何迁移和转化的。
荧光显微镜还可以用于研究感染性疾病，如HIV和艾滋病的传播。
通过荧光显微镜观察这些病原体能够有更深刻地了解病毒和病菌对宿主的感染方式和影响。
此外，荧光显微镜还可以用于研究新药物和药物能力，使药物研制过程更精确和有效。
三、荧光显微镜的未来发展趋势随着技术不断改进，未来荧光显微技术亦将发生一系列的进步。
有以下几个方面：1. 改进精度：高清晰度和分辨率是荧光显微镜的重要特性，尤其当涉及到细胞和分子的成像。
荧光显微镜技术在生物学中的应用
荧光显微镜技术在生物学中的应用荧光显微镜是一种基于荧光现象的显微技术，它能够将激发物质发出的荧光信号转化为图像。
这一技术的应用之一就是在生物学研究中，它已经成为了一项重要的工具。
荧光显微镜技术的发展，不仅解决了传统显微镜不能达到的任务，同时也使得很多原本不能检测的生物学现象得到了揭示。
荧光显微镜技术的应用荧光显微镜技术在生物学领域的应用主要包括以下几个方面：1. 活细胞观察由于传统显微镜观测需要对样本进行固定处理，因此观察过程中无法观察到活细胞的现象。
使用荧光显微镜，由于它不需要使用化学固定剂，因此可以观察到细胞内部的动态变化，如细胞分裂、细胞核运动等现象。
2. 瞬时生化反应荧光显微镜技术可以标记生化反应或细胞内物质，使其发出荧光信号，并在实时观察到这一过程。
这项技术可以大大缩短生化反应的运行时间，可以监测蛋白质、DNA和RNA等的合成，以及离子和分子等化学现象。
3. 染色体和DNA研究荧光染色体或质体是一种标记生物大分子的技术。
荧光染色体和DNA标记技术可以用于检测DNA复制、DNA拆解和DNA修复等活动。
DNA标记技术也可用于评估遗传变异，这有助于检测不良遗传信息和基因突变。
4. 免疫荧光荧光显微镜技术可以用于免疫荧光标记。
在这项技术中，荧光标记的抗原与细胞内特定蛋白结合，呈现荧光信号。
这项技术可用于检测蛋白质的具体位置以及其在细胞中的分布情况与移动轨迹。
荧光显微镜技术广泛应用于细胞内分子动力学研究、免疫荧光技术、荧光共振能量转移、荧光蛋白研究、单分子力学测量、3D显微成像等多个领域，成为现代生物学研究的必备技术手段。
未来发展趋势正如其他许多生物技术一样，荧光显微镜技术取得了许多突破，但仍有困难需要解决。
解决这些问题的方法是不断研究和创新。
荧光显微镜技术的未来发展趋势在于进一步减少噪声和提高显微镜解析度。
在生物学研究中，我们将看到更清晰、更准确的图像，并且我们将能够识别其所显示的微观结构和化合物。
荧光探针及成像技术在生物医学中的应用
荧光探针及成像技术在生物医学中的应用简介荧光探针即利用荧光效应展现出的分子自身物理和化学特性研究生命体系的一种技术，它在生物医学、分子生物学、细胞生物学等领域有广泛的应用。
荧光成像技术则是一种实现荧光探针在特定领域，对特定对象进行体内或体外成像的技术，近年来随着光学成像技术的不断发展和成熟，特别是单分子成像和系统生物学迅速发展，荧光成像技术成为一个研究生物分子的理想工具。
本文将会具体介绍荧光探针和荧光成像技术在生物医学领域的应用。
荧光探针在生物医学中的应用荧光探针在生物医学中的应用非常广泛，这里只介绍其中的部分。
1.分子诊断荧光探针用于分子诊断是其最主要的应用之一。
这里最为典型的例子，就是利用荧光探针来诊断艾滋病和乙肝病毒。
荧光探针作为一种高灵敏、高特异性的分子诊断技术，已经在临床应用中得到了广泛应用，并得到了良好的结果。
2.分子生物学荧光探针在分子生物学中有着重要应用。
通过荧光探针的染色，可以使目标分子产生荧光发射，进而能够对该分子进行定量和定位。
同时，荧光探针也可以直接探查细胞或者组织中的生物分子，其用途包括蛋白质定位、细胞信号、细胞分化和生物分子交互作用的定量研究。
3.分子显微成像分子显微成像是一种最新的分子生物学研究技术。
荧光探针作为其中的一种非常关键的工具，通常用来标记特定分子的位置，从而在细胞或组织水平上揭示分子生物学过程和机制。
通过分子显微成像，科学家们可以深入了解组织和细胞中的各种细节，研究细胞的信号通路，解析组织因子在生长、重组、变异和破坏中所扮演的角色，实现对组织和细胞的深度分析。
荧光探针的成像技术在生物医学中的应用荧光探针的成像技术是荧光技术的高端应用，通常被用于生命医学研究中，并在细胞、组织、动物等方面有广泛的应用。
1.荧光显微成像荧光显微成像是目前最为常用的荧光成像技术之一，在研究生物分子和机制等方面具有重要作用。
它可以通过用荧光探针标记细胞或组织来实现成像，进而探寻分子合成、细胞分化、细胞运动等生物学过程。
生物医学分子成像技术的发展及应用
生物医学分子成像技术的发展及应用随着科技的不断发展，生物医学领域的成像技术也在不断更新和改进，其中最重要的领域就是生物医学分子成像技术。
这种技术可以让我们在分子层面上观察和研究生物体，从而更好地了解生物学和医学的基本运作方式，以及如何针对特定的疾病进行治疗。
本文将简要介绍生物医学分子成像技术的发展历程、主要应用场景和最新发展趋势。
一、发展历程生物医学分子成像技术是在西方国家比较普及的技术，在中国目前研究还相对较少。
主要有以下几个发展历程：1.荧光成像技术荧光成像技术最早在20世纪初成为生物学研究的一部分，尤其是荧光显微镜成像技术，对于研究细胞结构和功能非常有用。
然而，荧光成像技术最初只能在细胞水平上进行观察和研究，无法深入到分子层面上。
2.生物医学成像技术20世纪50年代，X射线成像技术开始广泛应用于医学影像学，可以被用于诊断各种疾病。
然而，这种技术无法直接观察或研究分子的变化和动态过程。
3.核磁共振成像技术核磁共振成像技术（NMR）最早起源于20世纪60年代，它使用具有相同自旋的原子核作为探针，并测量它们发射的辐射。
NMR技术因此可以用于研究体内分子的运动和结构。
4.分子成像技术分子成像技术是一种新型医学成像技术，在核磁共振（MRI）、X射线计算机断层成像（CT）和正电子发射断层成像（PET）等技术的基础上，加入新的成像材料，使疾病更加准确可视化。
二、主要应用场景生物医学分子成像技术主要应用于以下场景：1.肿瘤诊断和治疗肿瘤的早诊、早治是治疗成功的关键。
传统的肿瘤诊断方法大多基于影像学诊疗，但在初期肿瘤的检测敏感度低。
而分子成像技术则可以精准依据肿瘤的微观特征诊断肿瘤类型和位置，并且在手术前进行同时进行荧光引导手术，最大程度地保留患者的组织和功能。
一些肿瘤标志物如ESC和PSMA也可以用于针对性的成像。
2.神经科学研究神经科学研究涉及到许多不同的技术和分子，由于神经元数量之多和互相复杂的联系，使得现有的技术难以对神经功能进行更深层次的研究。
细胞荧光成像技术在生物医学中的应用
细胞荧光成像技术在生物医学中的应用细胞荧光成像技术是一种通过荧光显微镜对细胞进行高分辨率成像的技术。
这项技术通过植入特定的荧光蛋白在细胞内部标记细胞器、蛋白质，从而实现细胞的三维成像和动态观察。
该技术的应用范围非常广泛，在医学研究领域中也发挥着重要的作用。
细胞荧光成像技术主要应用于生命科学研究中的以下三个方面:1. 结构学探测细胞荧光成像技术可以用于标记已知的蛋白质，在细胞中得到精细的信息，进而掌握细胞中蛋白质的分布情况、形态和结构。
而对于新的蛋白质，可以通过分子克隆的方法，将荧光蛋白与要研究的蛋白质进行融合。
进一步探测细胞中的信号通路和各个蛋白质在信号通路中的位置分布和相互作用，以达到进一步理解和研究细胞过程和信号传递的目的。
例如，绿色荧光蛋白在神经元中融合，可以实现神经元中硬膜和轴突分化的显示，为研究神经元的生化过程做出贡献。
2. 生理学探测细胞荧光成像技术可以应用在对一些生理学进行探测，帮助研究人员保持细胞健康。
例如，研究员可以在显微镜下观察细胞内部的离子交换和钙离子流量。
细胞荧光成像技术还被应用于研究细胞极性、细胞形态变化、细胞周期等生理学特征。
例如，先开发出一种融合荧光蛋白的标记糖分子的技术，使细胞膜的分子移动可视化；在细胞中标记一个类似钙离子的荧光蛋白，可以在细胞中观察到钙离子的移动和浓度的变化。
3. 生化学探测为了研究细胞内不同蛋白质、酶和其他生化分子之间的相互作用和通信，细胞荧光成像技术也被开发出来。
这些通信可以通过荧光显微镜监测，并跟踪不同蛋白质的位置和行为。
荧光显微成像还可被用于观测蛋白质的活性，即一个蛋白质如何结合到另一个蛋白质，并在某个特定时刻启动一个生化过程。
例如，在癌细胞中通过荧光显微镜标记一种叫做Bcr-Abl的蛋白质，在荧光显微下人们可以观察到Bcr-Abl与其他重要的蛋白质相互作用的过程。
这一数据可以使科学家更好地理解这个蛋白质是如何驱动癌细胞生长和扩散的。
总之，细胞荧光成像技术在生物医学领域中的应用非常广泛，尤其在癌症研究等急需开发新治疗方法的领域。
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姓名：何青学号：1224143003 专业：生物医学信息技术荧光显微成像技术在生物医学研究领域的应用随着光电子技术，尤其是激光技术的发展，越来越多的现代显微技术迅速发展起来。
目前，通过激光光源以激发被测物体的荧光或者非线性光学现象从而获得高分辨率的成像的技术就有：激光共聚焦显微技术、双光子荧光显微技术、二次谐波显微成像技术以及拉曼光谱成像技术等。
通过能量密度比普通光源高数十乃至数百倍的激光可以激发被测物的各种非线性光学现象，而被测物内部不同组织、不同成分的部分将显示不同的光学性质（如激发光的强度或者波长不一样），从而将这些不同部分区分开来，提高了显微系统的分辨率。
荧光显微成像技术在生物医学研究领域的应用日益广泛，技术发展也突飞猛进，成为热门的研究领域，并发展了突破衍射极限的超高分辨率荧光显微成像系统[1]。
现就目前应用比较广泛的激光扫描共焦显微镜和多光子激光扫描显微镜进行介绍。
1 激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜是近年来发展较为迅速的无创诊断技术。
它以光学系统的共焦成像为基础，利用光扫描技术对样品进行无创动态测量，目前已经发展成为生物学和医学研究诊断的重要工具，在生物医学的各方面得到了广泛的应用。
1.1 激光共聚焦扫描显微镜基本原理如图1所示，激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作扫描光源，采用双针孔的结构以形成物像共轭。
激光通过透镜聚焦在焦平面上针孔形成点光源，并在物镜焦平面对样品逐点扫描,样品上的每个照射点在像焦平面的探测孔处成像。
进行点扫描时，扫描点以外的点不会成像。
，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。
由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。
系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。
调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像。
逐点、逐行、逐面快速扫描成像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
图1激光共聚焦扫描显微镜基本原理示意图1.2激光共聚焦显微镜的应用领域激光扫描共聚焦显微镜是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。
既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。
目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等领域得到广泛应用。
激光共聚焦显微镜的具体应用领域包括：多重荧光影像 ( Multi-Color Fluorescence Imaging )3D 立体影像重建 ( 3D Reconstruction )3D 动态影像获取与分析 ( Dynamic 3D imaging )神经立体分布影像 ( 3D Neuron imaging )形态与动态分析 ( Morphology )次微米单晶荧光影像技术 ( Nano-crystal )多重荧光蛋白影像技术 ( Multi-Color GFP Imaging )细胞离子流定量分析 ( Cellular Ion Concentration and Ratio Imaging )长时间影像记录 ( Time-Lapse Recording )Z轴扫描与测量 ( Z-section and measurement )基因影像分析 ( Genetic FISH imaging and quantification ) 染色体多重荧光原色表现 ( Chromosome spectral analysis )活体胚胎研究 ( Embryo, Zebrafish / Drosophila embryo )穿透光影像 / 反射光影像材料表面分析 ( Surface and roughness analysis )材料显微硬度分析 ( Micro-Hardness analysis )晶园分析 ( Wafer analysis )薄膜分析 ( Thin layer analysis )2 多光子激光扫描荧光显微镜近年来，光学显微镜技术中的一个最引人注目的成就是双光子激发现象(two-photon excitation，简称TPE)在共焦激光扫描显微镜(confocal laserscanning microscopy，简称CLSM)中的广泛应用⋯．随着飞秒激光技术和光学显微镜技术的发展，现在人们已经能够比较容易地制造并使用双光子共焦激光扫描显微镜(two—photon laser scanning microscopy，简称TPLSM)，对样品在双光子激发后发出的荧光进行观察和三维成像．目前, 以双光子技术为代表的多光子技术已经在生物及医学成像、单分子探测、三维信息存储、微加工等领域得到广泛应用, 为开拓新学科和促进科学研究领域向更高层次发展起到了非常重要的作用．利用双光子共焦激光扫描显微镜的特点揭示了许多新现象和新规律，展示了广阔的发展前景。
2.1多光子激光扫描荧光显微镜基本原理多光子激光扫描荧光显微镜在激光照射下，基态荧光分子或原子吸收一个光子后成为激发态，随后又弛豫到某一基态，同时以光子形式释放能量而发出荧光．这一过程就是通常的单光子激发情况．1931年，Maria G6ppert—Mayer预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中，同时吸收两个光子而成激发态，这种情况就是双光子激发过程．1961年，Kaiser等在CaF2：Eu”晶体中首次观察到了这种双光子激发现象．比如在单光子激发情形，NADH酶在350nm 的光激发下产生450nm的荧光，而在双光子激发情形，NADH酶则需同时吸收两个700nm 的光子才能产生450rim的荧光．这就是说，双光子技术可以使我们无需使用紫外光源就能达到检测紫外荧光探针的目的，由于双光子激发所产生的荧光强度与激发光的光强平方成正比，因而与单光子激发的线性过程相比，双光子激发就需要很强的激发光强，这就使双光子激发具有很高的空间局域特点[2]。
图2 光子激发示意图2.2 多光子激光扫描荧光显微镜的应用领域多光子共焦激光扫描显微镜已延伸到各个研究和应用领域. 它能对处在自然状态下的样品进行三维无损观察,并能提高系统的分辨率和信噪比.利用多光子激发后材料性质的变化,还可以实现三维高度数据存储和三维任意方向的微细加工,具有很高的应用价值. 可以相信,随着与多光子共焦显微镜相关的机械、材料、激光技术等的进一步发展多光子共焦激光扫描显微镜将得到更大的发展和更广泛的应用.3 激光扫描共焦显微镜和多光子激光扫描显微镜的比较激光共聚焦显微镜是80 年代随着光学、视频、计算机等技术的飞速发展而诞生的新一代显微镜。
自从1957 年马文·闵斯基在他的美国专利上首次阐明扫描共聚焦显微镜技术的某些基本原理, 激光显微镜技术得到逐步发展。
1970年牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型的扫描共聚焦显微镜, 它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或激光激发荧光探针。
能够得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,由于它采用激光作光源, 发射角小, 方向性好, 在发射光检测光路上放置了一个与入射光针孔共轭的检测针孔, 使焦平面的光可以通过检测针孔, 而来自焦平面上、下的光被阻挡在针孔的两边。
因此, 可得到高清晰度的图像。
目前, 激光共聚焦显微镜已发展到拥有12 通道, 0b ~ 360b 旋转扫描,配以微幼步进马达控制载物台的升降, 对样本进行无损伤光学切片, 获得其三维立体结构可在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、pH 值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化, 成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
但激光共聚焦显微镜存在如下问题: ( 1) 要求共聚焦即照明针孔与探测针孔共轭; ( 2)探针对样品深度的干扰; ( 3) 样本遭到光漂白作用和光致毒作用。
多光子激光扫描显微镜的应用使这些问题迎刃而解。
多光子吸收的历史可追溯到1931 年, 当时M1 G1Meier做出了高光强度下多光子吸收会发生的理论预断[ 3] , 1961年在贝尔实验室用脉冲红宝石激光器激发铕离子荧光时首次观察到双光子吸收, 1989 年在美国康奈尔大学W1 Denk、J1H1 Stricker 和W1W1Webb 制成第一台多光子激光显微镜。
此后, 多光子激光显微镜在生物医学领域发挥了重要的作用。
现将两者作简单比较。
（1）多光子激光扫描显微镜采用飞秒激光器, 其惊人的应用之一是敏感的生物结构现象, 它容许的峰值功率密度大于1011WPcm2, 比激光共聚焦扫描显微镜105WPcm2 要高许多。
激光共聚焦扫描显微镜采用可见光激光, 能量连续激发,多光子激光扫描显微镜采用波长较长的红外激光, 能量脉冲式激发, 红外光比可见光在生物组织中的穿透力更强, 因此多光子激光扫描显微镜更能解决生物组织中深层物质的层析成像问题, 扩大了应用范围。
（2）激光共聚焦显微镜是单光子激发, 在整个扫描焦平面以及扫描上下都产生荧光的激发, 采用与照明针孔共轭的探测针孔, 使焦平面以外的点不会在探测针孔处成像, 从而提高了显微镜的分辨率, 但与此同时, 在生物样品的整个扫描面及扫描面上下, 造成荧光大范围的激发, 从而导致整个组织的广泛漂白和光动力学损伤。
多光子激光扫描显微镜采用多光子激发, 这是一个非线性过程, 具有准确的定位特征, 也就是只有在焦点处的光子才能激发荧光分子, 光漂白和光损伤仅局限于焦点附近, 且有利于减少测试样品的自发荧光,这样可以对活细胞进行更长时间的观察。
（3）激光共聚焦扫描显微镜因为有荧光大范围的激发, 所以需要共焦针孔来选择荧光。
多光子激光扫描显微镜的荧光激发只发生在焦点, 不需共焦针孔选择荧光, 因此测量光路更加简单、可靠、有效, 设备简单易携, 故障率低。
（4）多光子激光扫描显微镜比激光共聚焦扫描显微镜具有更准确的定位, 因而保证了更高的三维分辨率, 使背景的干扰相对减少, 进一步提高了图像清晰度。
（5）多光子激光扫描显微镜的荧光波长远离激发光波长, 因此多光子显微镜可实现暗场成像。
（6）激光共聚焦扫描显微镜在生物医学方面经常应用于细胞内游离钙测量, 细胞内pH 测量、荧光原位杂交分析, 免疫组化, 膜的流动性, 胞间通讯等方面。
多光子激光扫描显微镜除具有上述功能外, 在以下方面有着更多的应用:在特制的培养皿上可杀死或移动不需要的细胞, 分离单层贴壁细胞, 在细胞生长表面作微区划分, 长时间观察细胞生长, 建立维护混合细胞体系, 进行肿瘤移植, 控制细胞生长速度,建立稳定的细胞系, 建立细胞原代培养, 进行药物筛选。