第九节 肉毒梭菌
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肉毒梭菌
4.2.7
肉毒梭菌
制作：白俊强
本节主要内容：
肉毒梭菌的主要特征 肉毒梭菌致病机理 肉毒梭菌的检验
一、生物学特性：
1.形态及染色
肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，革兰氏染色阳性(老龄菌 是阴性），约为4×1μm的大杆菌， 多单在，偶见成双或短链， 两侧平行，两端钝园，直杆状或稍弯曲，芽胞为卵圆形，大于 菌体宽度，位于次极端，使菌体呈匙形或网球拍状，偶有位于 中央，常见很多游离芽胞。 有4~8根周生鞭毛，运动迟缓，无荚 膜。
酸盐缓冲液。
试剂：肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶（活力 1:250）、革兰氏染色液。
实验动物：小白鼠
检验程序
①报告(一)：检样中有无肉毒毒素以
及有何型肉毒毒素。(如仅为了肉毒中 毒诊断，即可结束检验) ②报告(二)：对增菌产毒培养物，一
毒素检测
检 样
增菌、产毒培养 30℃，5 d
方面做生长特性观察，同时检测肉毒
（1）毒素检测：试验方法同上。 （2）培养特性检查：接种卵黄琼脂平板，分成两份 ，分别在35℃的需氧和厌氧条件下培养48 h，观察生 长情况及菌落形态。肉毒梭菌只在厌氧条件下生长而 在需氧条件下不生长。
肉毒梭菌的检出（增菌产毒培养试验）
取庖肉培养基三支，煮沸10min～15min，做如下处理： 第一支：急速冷却，接种检样均质液1 mL～2 mL； 第二支：冷却至60℃，接种检样，继续于60℃ 保温10 min，急速冷却；
抵抗力：
A型毒素经60℃2分钟加热，差不多能被完全破坏，而B、 E二型毒素要经70℃2分钟才能被破坏；C、D二型毒素 对热的抵抗更大些；C型毒素要经过90℃2分钟加热才 能完全破坏，不论如何，只要煮沸1分钟或75℃加热 5~10分钟，毒素都能被完全破坏。肉毒毒素对酸性反 应比较稳定，对碱性反应比较敏感。某些型的肉毒毒 素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。
肉毒梭菌
制作：白俊强
本节主要内容：
肉毒梭菌的主要特征 肉毒梭菌致病机理 肉毒梭菌的检验
一、生物学特性：
1.形态及染色
肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，革兰氏染色阳性(老龄菌 是阴性），约为4×1μm的大杆菌， 多单在，偶见成双或短链， 两侧平行，两端钝园，直杆状或稍弯曲，芽胞为卵圆形，大于 菌体宽度，位于次极端，使菌体呈匙形或网球拍状，偶有位于 中央，常见很多游离芽胞。 有4~8根周生鞭毛，运动迟缓，无荚 膜。
酸盐缓冲液。
试剂：肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶（活力 1:250）、革兰氏染色液。
实验动物：小白鼠
检验程序
①报告(一)：检样中有无肉毒毒素以
及有何型肉毒毒素。(如仅为了肉毒中 毒诊断，即可结束检验) ②报告(二)：对增菌产毒培养物，一
毒素检测
检 样
增菌、产毒培养 30℃，5 d
方面做生长特性观察，同时检测肉毒
（1）毒素检测：试验方法同上。 （2）培养特性检查：接种卵黄琼脂平板，分成两份 ，分别在35℃的需氧和厌氧条件下培养48 h，观察生 长情况及菌落形态。肉毒梭菌只在厌氧条件下生长而 在需氧条件下不生长。
肉毒梭菌的检出（增菌产毒培养试验）
取庖肉培养基三支，煮沸10min～15min，做如下处理： 第一支：急速冷却，接种检样均质液1 mL～2 mL； 第二支：冷却至60℃，接种检样，继续于60℃ 保温10 min，急速冷却；
抵抗力：
A型毒素经60℃2分钟加热，差不多能被完全破坏，而B、 E二型毒素要经70℃2分钟才能被破坏；C、D二型毒素 对热的抵抗更大些；C型毒素要经过90℃2分钟加热才 能完全破坏，不论如何，只要煮沸1分钟或75℃加热 5~10分钟，毒素都能被完全破坏。肉毒毒素对酸性反 应比较稳定，对碱性反应比较敏感。某些型的肉毒毒 素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。
肉毒梭菌——精选推荐
学院：集美大学诚毅学院专业：食品科学与工程年级：2010级班级：1091学号：**********姓名：***肉毒梭菌【摘要】：肉毒神经毒素是迄今为止所发现的生物毒素中毒性最强的物质,能引起人和动物以松弛性麻痹为主症的肉毒中毒,同时也是最重要的生物毒素战剂和生物恐怖剂之一。
研究和建立检测与鉴定方法具有十分重要的军事和医学意义。
【关键词】：肉毒梭菌检测食物中毒控制Abstract：Botulinum neurotoxin,which is produced by anaerobic bacterium Clostridium botulinum, is the most toxic substance known. It could also be used as biological warfare and biothreat agents. Hence, it is necessary to develop technologies for detecting and identifying BoNT in both military and medical sciences. This review covers reported detection assays of BoNT.Key words：Clostridium botulinum Detection Food poisoning Control1.肉毒梭菌简介1.1肉毒梭菌——基本概述肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，具有该菌的基本特性，即厌氧性的杆状菌，形成芽胞，芽胞比繁殖体宽，呈梭状，新鲜培养基的革兰氏染色为阳性，产生剧烈细菌外毒素，即肉毒毒素。
肉毒梭菌生长时，可形成一种强力的毒素抑制呼吸导致死亡，这是迄今为止所知的最毒的自然生成的毒素之一。
1.2肉毒梭菌——类型一种是蛋白分解型（就是分解蛋白质的类型），另一种是非蛋白分解型（就是不能分解蛋白质的类型）。
肉毒梭菌与肉毒素及其临床应用
A、B型——分布最广，广泛分布于自然界 C、D型——一般多存在于动物的尸体或在腐尸附近的 土壤中
E型——存在于海洋的沉积物、水产品的肠道内 F型——适应于深水的低温，在海洋地区分布广泛 G型——分布较少
Page 7
二、肉毒毒素
Botulinum Toxin
Page 8
Generation
肉毒梭状芽胞杆菌产生的外毒素（蛋白质毒素） 先在肉毒杆菌细胞内产生无毒的前体毒素 在肉毒杆菌死亡自溶后前体毒素游离出来 经肠道中的胰蛋白酶或细菌产生的蛋白酶激活后
Page 23
Mechanism of Action （BTX-A ）
阻断（Blocking）：A型肉毒毒素通过裂解SNAP-25而阻止乙
酰胆碱的释放。
SNAP-25是一种在细胞膜上促使神经末梢内囊泡与突触前膜顺利融合 并释放乙酰胆碱的必须蛋白质。这一过程阻止肌肉收缩，但并不影响 神经递质的分泌和储存，也不影响电信号沿神经纤维的传导。
Page 3
Fundamental Characteristics
革兰氏阳性菌 专性厌氧 梭状芽胞杆菌 典型的腐物寄生菌 低温生长产毒 分布广泛
主要存在于土壤及海洋沉淀物中，偶尔存在 于动物的粪便中
Page 4
Form & Structure
多形态细菌 约为4×1μm的大杆菌，两侧平行，两端钝园，直杆
肉毒梭菌与肉毒素及其临床应用
Clostridium Botulinum & Botulinum Toxin & Its Clinical Application
1
肉毒梭菌
2
肉毒毒素
3
肉毒毒素的临床应用
4
E型——存在于海洋的沉积物、水产品的肠道内 F型——适应于深水的低温，在海洋地区分布广泛 G型——分布较少
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二、肉毒毒素
Botulinum Toxin
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Generation
肉毒梭状芽胞杆菌产生的外毒素（蛋白质毒素） 先在肉毒杆菌细胞内产生无毒的前体毒素 在肉毒杆菌死亡自溶后前体毒素游离出来 经肠道中的胰蛋白酶或细菌产生的蛋白酶激活后
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Mechanism of Action （BTX-A ）
阻断（Blocking）：A型肉毒毒素通过裂解SNAP-25而阻止乙
酰胆碱的释放。
SNAP-25是一种在细胞膜上促使神经末梢内囊泡与突触前膜顺利融合 并释放乙酰胆碱的必须蛋白质。这一过程阻止肌肉收缩，但并不影响 神经递质的分泌和储存，也不影响电信号沿神经纤维的传导。
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Fundamental Characteristics
革兰氏阳性菌 专性厌氧 梭状芽胞杆菌 典型的腐物寄生菌 低温生长产毒 分布广泛
主要存在于土壤及海洋沉淀物中，偶尔存在 于动物的粪便中
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Form & Structure
多形态细菌 约为4×1μm的大杆菌，两侧平行，两端钝园，直杆
肉毒梭菌与肉毒素及其临床应用
Clostridium Botulinum & Botulinum Toxin & Its Clinical Application
1
肉毒梭菌
2
肉毒毒素
3
肉毒毒素的临床应用
4
肉毒梭菌医学课件课件
这个成功案例表明，肉毒梭菌疫苗可以有 效地预防肉毒梭菌感染，并且接种疫苗是 预防肉毒梭菌中毒的有效方法之一。
06
相关词汇解释和参考 文献
相关词汇解释
肉毒梭菌
一种革兰氏阳性梭菌，属于厌氧菌，广 泛分布于自然界，是引起食物中毒和肉
毒症的主要病原菌。
厌氧菌
指在无氧环境下生长繁殖的细菌，包 括革兰氏阳性梭菌、芽孢杆菌等。
肉毒梭菌的疫苗接种
目前没有针对肉毒梭菌的特异性疫苗，但可以通过接种针对其他梭状芽胞杆菌的 疫苗，如炭疽疫苗和气荚膜梭菌疫苗，以增强机体对肉毒梭菌的抵抗力。
对于存在肉毒梭菌感染高风险的人群，如从事肉类加工、食品加工等行业的人员 ，可以接种炭疽疫苗以预防感染。
03
肉毒梭菌的流行病学 和公共卫生意义
肉毒梭菌的流行病学研究
肉毒毒素
由肉毒梭菌产生的一种外毒素，是引 起食物中毒和肉毒症的主要致病因子 。
细菌毒素
由细菌产生的一种有毒物质，可引起 机体一系列病理生理变化。
参考文献
[1] 王陇德. 肉毒梭菌中毒诊断标准及处 理原则[J]. 中华流行病学杂志, 1997, 18(4):299-302.
[2] 何剑峰, 梁秀丽, 王惠榕. 肉毒梭菌 及其毒素的研究进展[J]. 中国食品卫生
结局
经过及时治疗，患者的症状逐 渐减轻，并在1周后康复出院 。
案例三：肉毒梭菌疫苗接种的成功案例
患者
接种
一位20岁的男性，因即将前往肉毒梭菌高 发区域生活而接种肉毒梭菌疫苗。
患者在接种疫苗后接受了全剂量的免疫接 种，并在规定时间内完成了所有接种程序 。
保护效果
结论
患者在接种后接受了抗体检测，结果显示 抗体水平升高，并且没有出现任何不良反 应或疾病症状。
肉毒杆菌 ppt课件
ppt课件 27
• 全身中毒性毒剂 这是一类破坏人体组织细胞氧化功能，引起组织急性缺 氧的毒剂，主要代表物有氢氰酸、氯化氢等。 • 刺激性毒剂 这是一类刺激眼睛和上呼吸道的毒剂。按毒性作用分为 催泪性和喷嚏性毒剂两类。催泪性毒剂主要有氯苯乙酮、 西埃斯。喷嚏性毒剂主要有亚当氏气。 • 失能性毒剂 • 这是一类暂时使人的思维和运动机能发生障碍从而丧 失战斗力的化学毒剂。其中主要代表物是1962年美国研制 的毕兹(二苯基羟乙酸-3-奎宁环酯)。
ppt课件 29
•
不仅如此，肉毒杆菌的存在极广，尤其是土壤 和海洋沉积物中。病菌经常存在于水果、蔬菜和 海鲜中。在这种状况下，它们是无害的。只有当 它们开始生长时，毒素才会生成。人类接触这种 毒素的主要方式，是误食带菌的食物。比如，储 存不当的食物的温度和环境往往为肉毒杆菌孢子 繁殖提供良好条件。严重的外伤和婴儿的消化道 也是类似的环境。
ppt课件
31
• 有些国家，特别是美国和俄罗斯，已经在 大力研究以食品作物为目标的疾病，甚至 昆虫。现代农业重视大规模生产单一作物 的现状，使虫害和饥荒变得更容易。
• 稻瘟病并不能像天花或肉毒杆菌那样杀人 。但它可以引起贫穷国家的严重饥荒以及 经济困难，和其他重大问题。
ppt课件
32
生化武器 生化武器是指以细菌、病毒、毒素等使人、 动物、植物致病或死亡的物质材料制成的武 器。它包括生物武器和化学武器。 生物武器是生物战剂及其施放装置的总称， 它的杀伤破坏作用靠的是生物战剂。 生物战剂是军事行动中用以杀死人、牲畜 和破坏农作物的致命微生物、毒素和其他生 物活性物质的统称。
ppt课件 22
Fish product Lightly preserved Process used smoked fermented Semi-preserved salted No. of outbreaks 10 eserved
• 全身中毒性毒剂 这是一类破坏人体组织细胞氧化功能，引起组织急性缺 氧的毒剂，主要代表物有氢氰酸、氯化氢等。 • 刺激性毒剂 这是一类刺激眼睛和上呼吸道的毒剂。按毒性作用分为 催泪性和喷嚏性毒剂两类。催泪性毒剂主要有氯苯乙酮、 西埃斯。喷嚏性毒剂主要有亚当氏气。 • 失能性毒剂 • 这是一类暂时使人的思维和运动机能发生障碍从而丧 失战斗力的化学毒剂。其中主要代表物是1962年美国研制 的毕兹(二苯基羟乙酸-3-奎宁环酯)。
ppt课件 29
•
不仅如此，肉毒杆菌的存在极广，尤其是土壤 和海洋沉积物中。病菌经常存在于水果、蔬菜和 海鲜中。在这种状况下，它们是无害的。只有当 它们开始生长时，毒素才会生成。人类接触这种 毒素的主要方式，是误食带菌的食物。比如，储 存不当的食物的温度和环境往往为肉毒杆菌孢子 繁殖提供良好条件。严重的外伤和婴儿的消化道 也是类似的环境。
ppt课件
31
• 有些国家，特别是美国和俄罗斯，已经在 大力研究以食品作物为目标的疾病，甚至 昆虫。现代农业重视大规模生产单一作物 的现状，使虫害和饥荒变得更容易。
• 稻瘟病并不能像天花或肉毒杆菌那样杀人 。但它可以引起贫穷国家的严重饥荒以及 经济困难，和其他重大问题。
ppt课件
32
生化武器 生化武器是指以细菌、病毒、毒素等使人、 动物、植物致病或死亡的物质材料制成的武 器。它包括生物武器和化学武器。 生物武器是生物战剂及其施放装置的总称， 它的杀伤破坏作用靠的是生物战剂。 生物战剂是军事行动中用以杀死人、牲畜 和破坏农作物的致命微生物、毒素和其他生 物活性物质的统称。
ppt课件 22
Fish product Lightly preserved Process used smoked fermented Semi-preserved salted No. of outbreaks 10 eserved
食品安全——肉毒梭菌PPT课件
食品安全——肉毒杆菌
11/26/2019
.
1
目录
1 肉毒杆菌中毒案例 5 肉毒中毒判断依据
2 肉毒杆菌简介
6 肉毒中毒治疗措施
3 判断食物中毒理由 7 肉毒中毒预防
4 接诊处理应对措施 8 肉毒中毒调查处理
11/26/案例 5 肉毒中毒判断依据
2 肉毒杆菌简介
6 肉毒中毒治疗措施
肉毒毒素中毒症状
11/26/2019
.
10
目录
1 肉毒杆菌中毒案例 5 肉毒中毒判断依据
2 肉毒杆菌简介
6 肉毒中毒治疗措施
3 判断食物中毒理由 7 肉毒中毒预防
4 接诊处理应对措施 8 肉毒中毒调查处理
11/26/2019
.
11
接诊——判断食物中毒
中毒途径 消化、呼吸、 皮肤、注射
中毒活动 农药、咬 伤、食物、
• [6] 王馨,祁军.肉毒杆菌毒素中毒[J].口岸卫生控制,2008(05):62.
11/26/2019
.
29
谢谢！
11/26/2019
.
30
11/26/2019
.
15
处理
11/26/2019
.
16
食物中毒处理原则——细菌性诊断标准
11/26/2019
.
17
确诊
•按相关规范操作 •厌氧培养，检出毒素并定型 •实验室诊断——肉毒免疫胶体金快速检测
肉毒毒素(A/B/E/F 型)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)
11/26/2019
.
18
目录
未充分加热和杀灭芽胞
病死率 30%
肉毒 梭菌
G+细菌
缺氧
11/26/2019
.
1
目录
1 肉毒杆菌中毒案例 5 肉毒中毒判断依据
2 肉毒杆菌简介
6 肉毒中毒治疗措施
3 判断食物中毒理由 7 肉毒中毒预防
4 接诊处理应对措施 8 肉毒中毒调查处理
11/26/案例 5 肉毒中毒判断依据
2 肉毒杆菌简介
6 肉毒中毒治疗措施
肉毒毒素中毒症状
11/26/2019
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10
目录
1 肉毒杆菌中毒案例 5 肉毒中毒判断依据
2 肉毒杆菌简介
6 肉毒中毒治疗措施
3 判断食物中毒理由 7 肉毒中毒预防
4 接诊处理应对措施 8 肉毒中毒调查处理
11/26/2019
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接诊——判断食物中毒
中毒途径 消化、呼吸、 皮肤、注射
中毒活动 农药、咬 伤、食物、
• [6] 王馨,祁军.肉毒杆菌毒素中毒[J].口岸卫生控制,2008(05):62.
11/26/2019
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29
谢谢！
11/26/2019
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30
11/26/2019
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15
处理
11/26/2019
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16
食物中毒处理原则——细菌性诊断标准
11/26/2019
.
17
确诊
•按相关规范操作 •厌氧培养，检出毒素并定型 •实验室诊断——肉毒免疫胶体金快速检测
肉毒毒素(A/B/E/F 型)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)
11/26/2019
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18
目录
未充分加热和杀灭芽胞
病死率 30%
肉毒 梭菌
G+细菌
缺氧
肉毒梭菌的主要特征
度不完全相同。C、D型温度高些为宜，35℃
培养3d即可，而E型菌低温度长时间培养效果
较好。
4.对营养要求不高 ：在普通培养基上都能生长。
2、培养特性
5.在含有肉渣的液体或者半流动培养基中，肉毒梭菌生 长旺w盛elc且om产e生to大us量e t气he体se，PoAw、erBPo、inFt三tem型p表lat面es,浑N浊ew，C底on部tent 有粉d状esi和gn颗, 1粒0 y状ea沉rs淀ex，pe并rie能nc消e 化肉块，变黑有臭味；而 C、D、E三型表明清亮，絮片状生长，粘贴于管壁。 6.在葡萄糖鲜血琼脂平板上，菌落较小，扁平，颗粒状。 中央低落，边缘不规则，有的菌落还有大的溶血环。 7.在卵黄琼脂平板上生长，菌落及其培养基周围表面覆 盖着特有的彩虹样薄层，但G型没有
葡萄糖鲜血琼脂（A型） （C型）
3．生化特性 肉毒梭菌能分解葡萄糖，麦芽糖及果糖，产酸产气
，能液化明胶，缓慢液化凝固血清，使牛乳消化，产生 H2S，但不能使硝酸盐还原为亚硝酸盐。肉毒梭菌的生 化性状很不规律，即使同型，也常见到株间的差异。
分类： 4.抵抗力
肉毒梭菌能产生外毒素即肉毒毒素（大分子蛋
白），根据毒素的抗原特异性将其分为A、B、
C （1、2） 、D、E、F、G七个型别。
抵抗力：
A型毒素经60℃2分钟加热，差不多能被完全破坏，而B、 E二型毒素要经70℃2分钟才能被破坏；C、D二型毒素 对热的抵抗更大些；C型毒素要经过90℃2分钟加热才 能完全破坏，不论如何，只要煮沸1分钟或75℃加热 5~10分钟，毒素都能被完全破坏。肉毒毒素对酸性反 应比较稳定，对碱性反应比较敏感。某些型的肉毒毒 素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。
2、培养特性
培养3d即可，而E型菌低温度长时间培养效果
较好。
4.对营养要求不高 ：在普通培养基上都能生长。
2、培养特性
5.在含有肉渣的液体或者半流动培养基中，肉毒梭菌生 长旺w盛elc且om产e生to大us量e t气he体se，PoAw、erBPo、inFt三tem型p表lat面es,浑N浊ew，C底on部tent 有粉d状esi和gn颗, 1粒0 y状ea沉rs淀ex，pe并rie能nc消e 化肉块，变黑有臭味；而 C、D、E三型表明清亮，絮片状生长，粘贴于管壁。 6.在葡萄糖鲜血琼脂平板上，菌落较小，扁平，颗粒状。 中央低落，边缘不规则，有的菌落还有大的溶血环。 7.在卵黄琼脂平板上生长，菌落及其培养基周围表面覆 盖着特有的彩虹样薄层，但G型没有
葡萄糖鲜血琼脂（A型） （C型）
3．生化特性 肉毒梭菌能分解葡萄糖，麦芽糖及果糖，产酸产气
，能液化明胶，缓慢液化凝固血清，使牛乳消化，产生 H2S，但不能使硝酸盐还原为亚硝酸盐。肉毒梭菌的生 化性状很不规律，即使同型，也常见到株间的差异。
分类： 4.抵抗力
肉毒梭菌能产生外毒素即肉毒毒素（大分子蛋
白），根据毒素的抗原特异性将其分为A、B、
C （1、2） 、D、E、F、G七个型别。
抵抗力：
A型毒素经60℃2分钟加热，差不多能被完全破坏，而B、 E二型毒素要经70℃2分钟才能被破坏；C、D二型毒素 对热的抵抗更大些；C型毒素要经过90℃2分钟加热才 能完全破坏，不论如何，只要煮沸1分钟或75℃加热 5~10分钟，毒素都能被完全破坏。肉毒毒素对酸性反 应比较稳定，对碱性反应比较敏感。某些型的肉毒毒 素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。
2、培养特性
肉毒梭菌及其毒素检验
肉毒梭菌及其毒素检验
检验方法（GB4789.12）
肉毒毒素 检验
肉毒梭菌 检出
分离 培养
结果 报告
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
肉毒梭菌及其毒素检验
（一）肉毒毒素检验
1
样品的处理
2
检出试验
3
确证试验
4
毒力测定
5
定型试验
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
肉毒梭菌及其毒素检验
1.样品的处理
液体检样可直接离心，固体或半流动检样须加适量（例 如等量、倍量或5倍量、10倍量）明胶磷酸盐缓冲液，浸 泡、研碎，然后，取上清液进行检测。
血液琼脂：菌落周围有溶血区。
血液琼脂
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
肉毒梭菌及其毒素检验
培养特性： 普通琼脂：形成灰白色、半透明、边缘不整齐。呈绒毛网
状、向外扩散的菌落。直径约为3～5mm。 肉渣肉汤：呈均匀混浊生长，肉渣可被A、B和F型菌消化溶
解成烂泥状，并发黑，产生腐败恶臭味，从第三天起，菌体 下沉，肉汤变清。在肉渣培养基和半固体培养基，大量产气。
肉毒梭菌产生的毒素是一种神经毒素，是目前已知的化学毒物与生物毒素中毒性 最强的一种，对人的致死量为10-9mg/Kg体重。其毒力比氰化钾还要大一万倍。
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
肉毒梭菌及其毒素检验
二、致病性
肉毒毒素是一种与神经亲和力较强的毒素，肉毒毒素经肠道吸收后， 作用于外周神经肌肉接头，植物神经末梢以及颅脑神经核，毒素能阻 止乙酰胆碱的释放，导致肌肉麻痹和神经功能不全。在临床上表现以 中枢神经系统中毒症状为主，肉毒毒素中毒潜伏期长短不一，短者2小 时，长者可达数天，一般为12～24小时。中毒症状，早期为瞳孔放大 、明显无力、虚弱、晕眩，继而出现视觉不清和雾视，愈来愈感到说 话和吞噬困难，通常还可见到呼吸困难，体温一般正常，胃肠道症状 不明显。病程一般为2～3天，也有的长达2周之久。肉毒中毒死亡率较 高，据报导可达30%～50%，死亡主要是由于呼吸麻痹及心肌痪瘫。如 早期使用型特异或多价抗血清治疗，死亡率可降至10%～15%。
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确证试验 毒力测定 定型试验
（2）、肉毒梭菌的检出（增菌产毒培养试验）
取庖肉培养基三支，煮沸10min～15min，做如下处理： ➢ 第一支：急速冷却，接种检样均质液1 mL～2 mL； ➢ 第二支：冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温10 min，急速冷却； ➢ 第三支：接种检样，继续煮沸加热10 min，急速冷却。
在固体培养基表面上，形成类圆形， 边缘不整齐，约3毫米左右的菌落。菌落 半透明，表面一般比较光滑也有的呈颗粒 状，界线不明显，向外扩散。呈绒毛网状， 常常扩散成菌苔。
肉毒梭状芽孢杆菌菌落
2、培养特性
➢在含有肉渣的液体或者半流动培养基中，肉毒梭菌生长旺盛且产生大 量气体，A、B、F三型表面浑浊，底部有粉状和颗粒状沉淀，并能消化 肉块，变黑有臭味；而C、D、E三型表明清亮，絮片状生长，粘贴于管 壁。
第九节、肉毒梭状芽孢杆菌检验
一、肉毒梭状芽孢杆菌的生物学特性 1、形态与染色
肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，革兰氏染色阳性 (老龄菌是阴性），约为4×1μm的大杆菌， 多单在，偶见成 双或短链，两侧平行，两端钝园，直杆状或稍弯曲，芽胞为 卵圆形，大于菌体宽度，位于次极端，使菌体呈匙形或网球 拍状，偶有位于中央，常见很多游离芽胞。 有4~8根周生鞭毛， 运动迟缓，无荚膜。
二、肉毒梭菌的致病性
肉毒梭菌能产生外毒素即肉毒毒素（大分子蛋白），根据 毒素的抗原特异性将其分为A、B、C （1、2） 、D、E、F、 G七个型别。与毒素型别相对应，肉毒梭菌也分为同样的七个 型别。其中A、B、E、F四型毒素对人有不同程度的致病性。
A型毒素经60℃2分钟加热，差不多能被完全破坏，而B、E 二型毒素要经70℃2分钟才能被破坏；C、D二型毒素对热的抵 抗更大些；C型毒素要经过90℃2分钟加热才能完全破坏，不论 如何，只要煮沸1分钟或75℃加热5~10分钟，毒素都能被完全 破坏。肉毒毒素对酸性反应比较稳定，对碱性反应比较敏感。 某些型的肉毒毒素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。
2、培养特性
➢最严格的厌氧菌 ➢生长最适温度：28 ℃ ～37 ℃ ：pH为6.8~7.6，产毒的最适pH为7.8 ~8.2。 ➢产毒培养温度：不同菌型产毒的最适培养温度不完全相同。C、D型 温度高些为宜，35℃ 培养3d即可，而E型菌低温度长时间培养效果较好。 ➢对营养要求不高 ：在普通培养基上都能生长。
根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，于30℃ 培养5d，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。
（1）毒素检测：试验方法同上。 （2）培养特性检查：接种卵黄琼脂平板 ，分成两份，分别在35℃的需氧和厌氧 条件下培养48 h，观察生长情况及菌落 形态。肉毒梭菌只在厌氧条件下生长而 在需氧条件下不生长。
毒素检测 报告
（一）
毒素检测
增菌、产毒培养 30℃，5 d
毒素检测 报告（二）
观察生长性状， 染色镜检
分离培养
增菌产毒培养 30℃，5 d
观察菌落性状 染色镜检培养检查报告（来自）（1）、肉毒毒素检测
液态或固体（明胶磷酸盐缓冲液）样品经过适当处理后离心，取上清液实验 上清液及其胰酶激活处理液
分别进行小白鼠腹腔注射，各3只，每只0.5 mL，观察4 d 注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24 h内发病、死亡。
在葡萄糖鲜血琼脂平板上，菌落较小，扁平，颗粒状。中央低 落，边缘不规则，有的菌落还有大的溶血环。
在卵黄琼脂平板上生长，菌落及其培养基周围表面覆盖着特有 的彩虹样薄层，但G型没有。
肉毒梭状芽孢杆菌菌落
3、肉毒梭菌的生化特性
肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同型，也常见到株 间的差异。
表1 各型肉毒梭菌的生化反应
4、结果报告
报告(一)：检样含有某型肉毒毒素。 报告(二)：检样含有某型肉毒梭菌。 报告(三)：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌。
肉毒梭菌检验目标主要是毒素，不论食品中的肉毒毒素 检验还是肉毒梭菌检验，均以毒素的检测及定型试验为判定 的主要依据。
致病机理
肉毒毒素是一种神经麻痹毒素，主要抑制神经末梢释放乙 酰胆碱，引起肌肉松弛麻痹，特别是呼吸肌麻痹导致死亡。
������ 肉毒毒素的毒性极强，是目前已知在天然毒素和合成毒剂 中毒性最强的生物毒素，据称，精制毒素1克能杀死400万吨小 白鼠，一个人的致死量大概1微克左右。
肉毒中毒一年四季均可发生。美国以罐头发生中毒较多， 日本以水产品较多；我国以发酵食品（如：臭豆腐、豆瓣酱、 豆豉等）发生中毒较多。
三、检验方法
1、检验标准：GB 4789.12-2003 2、培养基和试剂 培养基： 庖肉培养基、卵黄琼脂培养基、明胶磷酸盐缓冲液。 试剂：
肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶（活力1:250）、革兰 氏染色液。 另需实验动物（小白鼠）。
3、检验程序
检样
①报告(一)：检样中有无肉毒毒素以 及有何型肉毒毒素。(如仅为了肉毒中 毒诊断，即可结束检验) ②报告(二)：对增菌产毒培养物，一 方面做生长特性观察，同时检测肉毒 毒素。报告检样中有无肉毒梭菌以及 有何型肉毒梭菌。（有些样品如土壤、 泥沙等基本上不可能含有毒素，则应 从培养着手） ③报告(三)：欲获纯菌株，可用增菌 产毒培养物进行分离培养，对所得纯 菌株进行形态、培养特性等观察及毒 素检测，其结果可证明所得纯菌为何 型肉毒梭菌。（一般情况下，没有必 要从检样中分离纯的菌株，但研究或 特殊需要例外）
以上3支试管于30℃厌氧培养5d，若无生长，可再培养10d。培养到期， 若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同上，阳性 结果证明检样中有肉毒梭菌存在。
（3）、分离培养
选取证实含有肉毒毒素的增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜 的加热处理）接种卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养48 h。肉毒梭菌在卵黄 琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样(或珍珠 层样)薄层，但G型菌无此现象。
（2）、肉毒梭菌的检出（增菌产毒培养试验）
取庖肉培养基三支，煮沸10min～15min，做如下处理： ➢ 第一支：急速冷却，接种检样均质液1 mL～2 mL； ➢ 第二支：冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温10 min，急速冷却； ➢ 第三支：接种检样，继续煮沸加热10 min，急速冷却。
在固体培养基表面上，形成类圆形， 边缘不整齐，约3毫米左右的菌落。菌落 半透明，表面一般比较光滑也有的呈颗粒 状，界线不明显，向外扩散。呈绒毛网状， 常常扩散成菌苔。
肉毒梭状芽孢杆菌菌落
2、培养特性
➢在含有肉渣的液体或者半流动培养基中，肉毒梭菌生长旺盛且产生大 量气体，A、B、F三型表面浑浊，底部有粉状和颗粒状沉淀，并能消化 肉块，变黑有臭味；而C、D、E三型表明清亮，絮片状生长，粘贴于管 壁。
第九节、肉毒梭状芽孢杆菌检验
一、肉毒梭状芽孢杆菌的生物学特性 1、形态与染色
肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，革兰氏染色阳性 (老龄菌是阴性），约为4×1μm的大杆菌， 多单在，偶见成 双或短链，两侧平行，两端钝园，直杆状或稍弯曲，芽胞为 卵圆形，大于菌体宽度，位于次极端，使菌体呈匙形或网球 拍状，偶有位于中央，常见很多游离芽胞。 有4~8根周生鞭毛， 运动迟缓，无荚膜。
二、肉毒梭菌的致病性
肉毒梭菌能产生外毒素即肉毒毒素（大分子蛋白），根据 毒素的抗原特异性将其分为A、B、C （1、2） 、D、E、F、 G七个型别。与毒素型别相对应，肉毒梭菌也分为同样的七个 型别。其中A、B、E、F四型毒素对人有不同程度的致病性。
A型毒素经60℃2分钟加热，差不多能被完全破坏，而B、E 二型毒素要经70℃2分钟才能被破坏；C、D二型毒素对热的抵 抗更大些；C型毒素要经过90℃2分钟加热才能完全破坏，不论 如何，只要煮沸1分钟或75℃加热5~10分钟，毒素都能被完全 破坏。肉毒毒素对酸性反应比较稳定，对碱性反应比较敏感。 某些型的肉毒毒素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。
2、培养特性
➢最严格的厌氧菌 ➢生长最适温度：28 ℃ ～37 ℃ ：pH为6.8~7.6，产毒的最适pH为7.8 ~8.2。 ➢产毒培养温度：不同菌型产毒的最适培养温度不完全相同。C、D型 温度高些为宜，35℃ 培养3d即可，而E型菌低温度长时间培养效果较好。 ➢对营养要求不高 ：在普通培养基上都能生长。
根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，于30℃ 培养5d，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。
（1）毒素检测：试验方法同上。 （2）培养特性检查：接种卵黄琼脂平板 ，分成两份，分别在35℃的需氧和厌氧 条件下培养48 h，观察生长情况及菌落 形态。肉毒梭菌只在厌氧条件下生长而 在需氧条件下不生长。
毒素检测 报告
（一）
毒素检测
增菌、产毒培养 30℃，5 d
毒素检测 报告（二）
观察生长性状， 染色镜检
分离培养
增菌产毒培养 30℃，5 d
观察菌落性状 染色镜检培养检查报告（来自）（1）、肉毒毒素检测
液态或固体（明胶磷酸盐缓冲液）样品经过适当处理后离心，取上清液实验 上清液及其胰酶激活处理液
分别进行小白鼠腹腔注射，各3只，每只0.5 mL，观察4 d 注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24 h内发病、死亡。
在葡萄糖鲜血琼脂平板上，菌落较小，扁平，颗粒状。中央低 落，边缘不规则，有的菌落还有大的溶血环。
在卵黄琼脂平板上生长，菌落及其培养基周围表面覆盖着特有 的彩虹样薄层，但G型没有。
肉毒梭状芽孢杆菌菌落
3、肉毒梭菌的生化特性
肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同型，也常见到株 间的差异。
表1 各型肉毒梭菌的生化反应
4、结果报告
报告(一)：检样含有某型肉毒毒素。 报告(二)：检样含有某型肉毒梭菌。 报告(三)：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌。
肉毒梭菌检验目标主要是毒素，不论食品中的肉毒毒素 检验还是肉毒梭菌检验，均以毒素的检测及定型试验为判定 的主要依据。
致病机理
肉毒毒素是一种神经麻痹毒素，主要抑制神经末梢释放乙 酰胆碱，引起肌肉松弛麻痹，特别是呼吸肌麻痹导致死亡。
������ 肉毒毒素的毒性极强，是目前已知在天然毒素和合成毒剂 中毒性最强的生物毒素，据称，精制毒素1克能杀死400万吨小 白鼠，一个人的致死量大概1微克左右。
肉毒中毒一年四季均可发生。美国以罐头发生中毒较多， 日本以水产品较多；我国以发酵食品（如：臭豆腐、豆瓣酱、 豆豉等）发生中毒较多。
三、检验方法
1、检验标准：GB 4789.12-2003 2、培养基和试剂 培养基： 庖肉培养基、卵黄琼脂培养基、明胶磷酸盐缓冲液。 试剂：
肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶（活力1:250）、革兰 氏染色液。 另需实验动物（小白鼠）。
3、检验程序
检样
①报告(一)：检样中有无肉毒毒素以 及有何型肉毒毒素。(如仅为了肉毒中 毒诊断，即可结束检验) ②报告(二)：对增菌产毒培养物，一 方面做生长特性观察，同时检测肉毒 毒素。报告检样中有无肉毒梭菌以及 有何型肉毒梭菌。（有些样品如土壤、 泥沙等基本上不可能含有毒素，则应 从培养着手） ③报告(三)：欲获纯菌株，可用增菌 产毒培养物进行分离培养，对所得纯 菌株进行形态、培养特性等观察及毒 素检测，其结果可证明所得纯菌为何 型肉毒梭菌。（一般情况下，没有必 要从检样中分离纯的菌株，但研究或 特殊需要例外）
以上3支试管于30℃厌氧培养5d，若无生长，可再培养10d。培养到期， 若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同上，阳性 结果证明检样中有肉毒梭菌存在。
（3）、分离培养
选取证实含有肉毒毒素的增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜 的加热处理）接种卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养48 h。肉毒梭菌在卵黄 琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样(或珍珠 层样)薄层，但G型菌无此现象。