表面等离子共振技术

表面等离子共振技术

北京大学力学系生物医学工程专业2003级，郭瑾

摘要：表面等离子共振技术自80年代发展起来后，目前在生物医学领域已有了广泛应用，发挥着重要作用。本文就表面等离子共振技术的原理和其在蛋白质组学、抗原－抗体研究和药物筛选中的应用做了简要阐述。

关键词：表面等离子共振，隐失波，蛋白质组学，抗原－抗体相互作用，药物筛选

表面等离子共振技术（surface plamon resonace technology,SPR 技术）是上个世纪80年代发展起来的以生物传感芯片（biosensor chip）为中心的一种新技术，由Biacore AB公司开发。此后人们开始研究用各种方法改进SPR的性能、简化仪器系统，并试图用SPR技术测量不同的生化物质，如DNA-DNA间的生物特异性相互作用【1】，蛋白质折叠机制的研究【2】，微生物细胞的检测【3】，抗体－抗原分子相互作用的研究【4】等。本文对于表面等离子共振技术的原理和其在生物医学领域的应用作了简要的综述。

一、表面等离子共振技术的原理

全内反射是一种普遍存在的光学现象。考虑一束平面光波从介质1表面进入到介质2中。入射光在介质1表面上一部分发生反射，另一部分则透射进介质2。入射角和透射角之间满足关系式：

n1sinθ1=n2sinθ2

这里n1是介质1的折射率，n2是介质2的折射率。当入射角增大，增大到临界角θc 时,这时的透射角为90°；当入射角继续增大到大于临界角时，光不再透射进介质2，也就是发生了全反射。由snell定律可知：

θ2=90°

θc=sin-1(n2/n1)

由上式可知，当n2

在表面等离子共振仪中，最核心的结构是芯片，芯片的结构见图1。在玻璃表面附有一层金箔，一种待检分子（ligand）连在金箔上，入射光在金和玻璃表面发生全反射，并产生SPR，这时的入射角为I。当有另一种分子（analyte）与ligand相互作用时，使金箔的折射率发生变化，这时以原来的入射角（I）入射就不能发生SPR，而以入射角（II）入射才能发生SPR【6】。用楔形的入射光入射保证了入射角在一定范围能，并能实时检测。

图1

图2

在analyte与ligand相互作用后，以缓冲液流过芯片表面，使analyte和ligand相分离，从而芯片得到再生，可以重复使用（如图2）。

二、表面等离子共振仪的组成

表面等离子共振仪主要由五部分组成：芯片、光学系统、液体处理系统、控温系统和计算机软件。液体处理系统是一个多通道的微流池，可以控制不同液体流过芯片表面。另外由于折射率、反应动力学、溶液中分子转移至芯片上等等均对温度很敏感，所以控温系统对于仪器测量的准确度也很重要。

这里具体介绍一下芯片和光学系统的组成【7】：

芯片主要由玻璃基底、金箔和表面基质组成。芯片上的金属膜对于产生SPR信号很关键。金膜产生SPR时的反射角和波长易于得到，且对于生物溶液具有化学惰性。

图3

金膜表面通过交联剂共价结合了表面基质，将靶生物分子固定。表面基质主要有四个作用：（1）共价固定生物分子，且不同芯片用来检测不同物质。（2）可通过增加表面固定生物分子的结合力提高芯片的灵敏度。如：常用的CM5芯片上的表面由羧甲基葡聚糖组成，这种基质为生物分子相互作用提供了稳定的环境，它固定ligand的量为1－5ng/mm2至50ng/mm2。（3）为大多数生物反应提供亲水环境。（4）使表面的非特异性结合强度低。

基质表面的线性葡聚糖使生物分子充分暴露在表面上。如果没有处理金箔表面由于空间位阻分子会被表面分子和相邻分子阻碍。

葡聚糖层厚100纳米左右，由无交联的线性葡聚糖组成，PH和离子强度影响葡聚糖分子的舒展。例如：PH为7时，每个羧基带一个负电，由于静电排斥葡聚糖高度舒展，在PH为3时，只有10％的羧基带电，舒展度降低。当PH值固定时，离子强度越低静电排斥越大。当芯片上固定生物分子后，会影响基质的物理性质。在固定生物分子后，基质仍带有负电。固定PH值，通过应用高离子强度的缓冲液，可使固定生物分子间的静电力及基质中羧基间的静电作用达到最低。所以在一系列测量中应保持缓冲液条件不变，在比较不同条件测定的结果时应考虑到缓冲液的问题。

以CM5芯片为例，葡聚糖是葡萄糖的线性多聚物，对生物分子的非特意性吸附性很低。芯片上的葡聚糖被羧甲基化（大约每个葡萄糖分子带有一个羧甲基），有以下目的：（1）为共价固定生物分子提过位点。（2）使得葡聚糖在生理PH值下形成负电网，在低离子强度下，带正电的生物分子（例如PH值低于PI值时的蛋白质）由于静电吸附作用而聚集在葡聚糖上。这样即使在反应液浓度较低的情况下也可使生物分子有效的共价固定在葡聚糖上。（3）羧基增加葡聚糖基质的亲水性。CM5芯片对大多数生物分子所用的缓冲液都很稳定，并可在短时间内暴露在极高或极低的PH值下不降解。但芯片应避免接触氧化剂（高碘酸盐、过氧化物、溴或碘化物）和可水解糖甘键的酶。

表面基质固定生物分子主要依靠以下几种途径（见图4）：

图4

表面等离子共振仪用发射二级管发射楔形近红外电磁波，此电磁波为单一波长的偏振光，偏振平面为入射平面。电磁波聚焦在芯片的玻璃/金界面上发生全反射，反射光由另一侧一列光敏二级管检测，而后由计算机分析SPR角。固定光源、芯片和检测器，应用楔形入射光和固定的一列检测器使我们可以实时检测反射角。

三、表面等离子共振技术在生物医学领域的应用：

1．蛋白质组学

蛋白质是生命活动的直接执行者，人类基因组序列中的遗传信息最终要靠在不同时空、受严格调控并具有自身特有活动规律的蛋白质的表达来体现。然而，蛋白质的种类和数量又是处于一个新陈代谢的动态变化之中，蛋白质的修饰、构象的变化也与生命活动密切相关。所以在人类基因组测序完成，基因功能的研究蓬勃发展之时，蛋白质组学凸现而出成为研究的重点。

生物分子相互作用分析质谱（BIA－MS)是SPR－BIA技术与传统的蛋白鉴定技术MALDI－TOF －MS（基质辅助的激光解吸离子化时间飞行质谱）有机结合形成的一种新的研究手段。BIA－MS 分为两步：第一步，SPR检测自身环境中的生物分子；第二步，MALDI－TOF－MS鉴定结合在SPR 传感器表面的分析物。这种方法综合了SPR-BIA和MALDI-TOF-MS两种技术的优势，实现了定量与