[精华]鲎试剂试验方法
鲎试验实验报告
一、实验目的1. 了解鲎试验的原理和方法。
2. 掌握鲎试验在微生物检测中的应用。
3. 提高微生物学实验技能。
二、实验原理鲎试验是一种检测微生物内毒素的试验方法。
鲎血中含有一种特殊的凝固蛋白，当鲎血接触到细菌内毒素时，凝固蛋白会立即凝固，从而产生凝胶。
根据凝胶形成的时间，可以判断样品中内毒素的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鲎试剂- 标准菌液- 待测样品- 生理盐水- 移液器- 培养皿- 灭菌棉签- 酒精灯- 镊子2. 实验仪器：- 恒温水浴箱- 移液器- 移液管- 培养皿- 镊子四、实验步骤1. 准备工作：- 将鲎试剂置于37℃恒温水浴箱中预热。
- 将待测样品和标准菌液分别用生理盐水进行稀释。
2. 制备样品：- 取适量鲎试剂加入培养皿中，加入适量的生理盐水，混匀。
- 分别加入标准菌液和待测样品，混匀。
3. 观察结果：- 将培养皿置于37℃恒温水浴箱中，观察凝胶形成的时间。
- 记录标准菌液和待测样品的凝胶形成时间。
4. 结果分析：- 根据凝胶形成的时间，判断样品中内毒素的含量。
五、实验结果与分析1. 标准菌液凝胶形成时间为5分钟，说明标准菌液内毒素含量较高。
2. 待测样品凝胶形成时间为8分钟，说明待测样品内毒素含量较高。
3. 根据凝胶形成的时间，判断待测样品内毒素含量为中等。
六、实验讨论1. 鲎试验是一种简单、快速、灵敏的检测微生物内毒素的方法。
2. 在实验过程中，应注意操作规范，避免污染。
3. 实验结果与实际情况可能存在一定的误差，需结合其他实验方法进行综合判断。
七、实验总结通过本次实验，我们了解了鲎试验的原理和方法，掌握了鲎试验在微生物检测中的应用，提高了微生物学实验技能。
在实验过程中，我们应注意操作规范，保证实验结果的准确性。
同时，我们应不断总结经验，提高实验技能，为微生物学领域的研究贡献力量。
美国USP鲎试剂检测方法
USP这一章节的部分内容已与欧洲药典和日本药典协调一致，不一致的部分以符号*标出。
本章阐述了关于检查和定量供试品内毒素的方法。
本法利用鲎（Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus）血细胞提取物制备的用于内毒素检测的鲎试剂（LAL）检定内毒素。
*1该检查包括两种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；另一种为光度测定法，该法利用鲎试剂与内毒素反应过程中的光学变化来实现内毒素的测定，这种方法又可分为浊度法（基于形成凝胶的过程中，溶菌液的浊度变化）和显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。
检测时，可用其中任一种方法进行试验。
当测定结果可疑或有争议时，除非各论中另有规定，以凝胶法测定结果为准。
直接比较供试品溶液与标准内毒素溶液，判断凝胶法的反应终点。
内毒素含量以USP内毒素单位（USP-EU）表示。
[注-1USP EU相当于1个内毒素单位。
]LAL试剂专用于浊度检查法或显色法，因此，使用这两种方法进行检定时，必须符合它们各自的要求。
两种检查法都要求建立标准曲线，以检定供试品的内毒素含量。
主要的实验步骤有：在预定的时间内将内毒素和对照品分别与LAL试剂保温培养；读取相应波长处的吸光度等。
使用终点浊度法时，应在孵育时间结束时马上读数；对终点显色法，则要在孵育终止时添加酶反应-终止制剂，反应停止后，方可读数。
动态浊度法和动态显色法分析整个反应时间内吸光度的变化，并通过这些读数计算比值。
仪器所有玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。
*2去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。
若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。
[注-本章内，“管”也包括任何其他反应容器，如微孔板的孔等。
]内毒素储备标准溶液和内毒素标准溶液的制备USP内毒素RS的效价规定为10000 USP内毒素单位（EU）/西林瓶。
鲎试剂灵敏度复核试验
鲎试剂灵敏度复核试验
一.试验目的
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
二.试验步骤
1.根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ）,将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟, 然后制成2λ、1λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。
2.取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管各加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
3.将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的适宜恒温器中，保温60分钟±2分钟。
三.结果分析
1.将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，若管内形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或形成凝胶但倒转180°后从管壁滑脱者为阴性。
2.若最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。
计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc），计算方法见中国药典。
3.反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性
结果的浓度。
4.当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
四.注意事项
1.保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
2.安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，千万不能用镊子敲击，防止碎玻屑掉入安瓿。
细菌内毒素试验(鲎试验)要点及控制方法
细菌内毒素试验（鲎试验）要点及控制方法一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素(Exotoxin)；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。
产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。
如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。
另一类为内毒素(Endotoxin)，是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物。
细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A 成分。
和热原的关系热原(pyrogen)系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。
它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。
热原是否就是内毒素？细菌内毒素是热原的一种，即细菌性热原。
细菌内毒素被认为是热原的本质，此事在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。
但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。
热原反应：含有热原的注射剂注入人体可引起发热反应，使人体产生发冷、寒战、体温升高、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。
来源和控制方法1、细菌内毒素的特性2、去除细菌内毒素的方法(1)吸附法此法是利用活性炭对热原的吸附作用达到去除作用的方法。
常用的吸附剂中，活性炭对热原的吸附作用最强，一般用量为总容量的0.1%-0.5% ，将溶液加热到70℃左右保温一定时间效果更好。
使用的活性炭应符合药典规定要求。
(2)蒸馏法此法是利用热原具有不挥发性而达到去除目的。
因此，凡适于蒸馏的药品均可用蒸馏法除去热原。
(3)热破坏法此法是利用热高温能破坏热原质达到去除目的。
因此，凡适用于高温处理的如热原检查试验中接触药液的容器，可用180℃干烤3小时，或250℃干烤30min以上。
(4)强酸强碱处理法此法利用强酸强碱能破坏热原而达到去除的目的。
(5)其他，也可以采用过滤等方法去除热原。
鲎试剂凝胶法
遮光，在冷处保存。
【包装】
(1)1ml 安瓿；(2)2ml 安瓿；(3)5ml 安瓿；(4)7ml 抗生素瓶；(5)10ml 抗生素瓶 【有效期】
稀释内毒素标准品时应按其使用说明用漩涡混合器混合适当的时间。 2.2 检品稀释 当检品需要控制的内毒素限值大于鲎试剂的灵敏度值时，需要用检查用水对检品进行稀释，计算公式如下：
MVD：检品的最大有效稀释倍数 L：检品需控制的内毒素限值（Eu/ml） λ：鲎试剂灵敏度值（Eu/ml） [举例]：某检品需要控制的内毒素限值为 5Eu/ml，使用灵敏度 λ=0.25Eu/ml 的鲎试剂作细菌内毒素检查。
二年
【批准文号】
(94)卫药准字 SJ-01 【生产企业】
企业名称：湛江安度斯生物有限公司
地 址：广东省湛江市人民大道中 38 号 邮政编码：524022 电 话：（0759）3380672 传 真：（0759）3391072
E-mail:zacb@ 网 址：
若阳性对照管为阴性表明鲎试剂或标准内毒素已失效或鲎试剂的灵敏度及标准内毒素的效价标示不准确或标准内毒素的稀释有误
鲎试剂说明书
【名称】 通用名：鲎试剂 英文名：Tachypleus Amebocyte Lysate (TAL) 汉语拼音：Hou Shi Ji 【性状】 本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水中易溶。 【原理】 本品为鲎科动物东方鲎（Tachypleus Tridentatus, Leach）的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品，内含能被 微量细菌内毒素激活的凝固酶原（Proclotting enzyme）和凝固蛋白原（Coagulogen）。在适宜的条件下（温 度，pH 值及无干扰物质），细菌内毒素激活鲎试剂中的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。凝胶法鲎试 剂是根据反应所形成凝胶的程度来限量检测细菌内毒素。 【用途】 用于细菌内毒素检查。 【使用方法】 1. 实验准备 1.1 选择所需规格及灵敏度的鲎试剂，细菌内毒素标准品以及细菌内毒素检查用水。 1.2 10×75mm 反应试管（若使用 0.1ml 规格的鲎试剂无需准备此试管）和大口径稀释试管若干支，以及移液器具。 实验所用器皿须经 250℃干烤至少 1 小时或其它适宜的方法除去可能存在的外源性热原。 1.3 水浴恒温器或干热恒温器，漩涡混合器，试管架，计时器。实验开始前应把恒温器温度调到 37±1℃。 2. 实验操作 2.1 内毒素标准品稀释 取内毒素标准品（冻干品）1 支，开启，按使用说明加入检查用水溶解后分步稀释至所需浓度备用。 如下稀释方法供参考：
鲎试验法检验某些抗生素原料药及其注射液等细菌...
鲎试验法检验某些抗生素原料药及其注射液等细菌...孟庆玲;杨锐【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】1992(17)6【摘要】鲎试验法(以下简称鲎法)是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应形成凝胶,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
本法具有快速、灵敏、简易、经济、实用性强等优点,因此受到世界各国科学家们的普遍重视。
目前已被世界科学较发达国家如美,英、欧洲药典所收载。
我国于1988年10月由中华人民共和国卫生部中国药典委员会颁布了《细菌内毒素检查法和鲎试剂标准(试行)》,并仅做为注射用水、氯化钠注射液、5％和10％葡萄糖注射液细菌内毒素的检查方法。
我们参考国内外资料,从1981年开始将此法应用在大输液内毒素的检验,证明该法有实用价值,并把实践中应用的体会写成了《鲎试验检测输液热原的体会》一文载于《辽宁药检通讯》杂志(1987年第一期44页)。
我们所阐述的理论及供试品的稀释公式被后来国内外文献报道所证实,是基本一致的。
然而,有大量的需要做热原检查的品种,还仍用传统的兔法(费时、费力、不经济),这些品种是否可应用快速、灵敏、经济的鲎法来检查,是科学工作者急待解决的问题。
鉴于上述情况,我们从1989年末开始把鲎法应用到抗生素,Vc等注射液的原料药,【总页数】3页(P467-469)【作者】孟庆玲;杨锐【作者单位】不详;不详【正文语种】中文【中图分类】TQ460.72【相关文献】1.鲎试剂检测复方柳安咖注射液中细菌内毒素的可行性研究 [J], 赵祎;张红宇;王莉;李海山2.特异性鲎试剂和非特异性鲎试剂对艾迪注射液中细菌内毒素检测的比较 [J], 施震;尹银嘉;李华3.鲎试剂法检测抗生素类药品的细菌内毒素 [J], 李敏红;汪穗福;刘效昌4.直接药敏试验法和常规药敏试验法在血液细菌检验中的应用研究 [J], 庄浩林5.鲎试剂检测10种注射用抗生素中细菌内毒素的可行性试验 [J], 刘红卫;李向荣;杜文力;王明霞;侯娟;王欣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鲎试剂
光度测定法：显色基质法
• 利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出 的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。 终点显色法：依据反应混合物中内毒素浓度 和其在孵育终止时释放出的有色团 的量之间存在着量化关系来测定内毒 素含量的方法。 动态显色法：是检测反应混合物的色度到达某 一预先设定的吸光度所需要的反应时 间，或是检测色度增长速度的方法。
光度测定法：检査法
• 按“光度测定法的干扰试验” 中的操作步骤进行检测。 • 使用系列溶液C 生成的标准曲线来计算溶液A 的每一个平行管的 内毒素浓度。 • 试验必须符合以下三个条件方为有效： (1 )系列溶液C 的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求； (2 )用溶液B 中的内毒素浓度减去溶液A 中的内毒素浓度后，计算 出的内毒素的回收率要在50%〜200%的范围内； (3) 阴性对照的检测值小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大 于标准曲线最低点的反应时间。
凝胶法:凝胶半定量试验
• 本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中 内毒素的含量。按表3 制备溶液A 、B、C 和D。按鲎 试剂灵敏度复核试验项下操作。 结果判断：若阴性对照溶液D 的平行管均为阴性，供 试品阳性对照溶液B 的平行管均为阳性，系列溶 液C的反应终点浓度的几何平均值在0 .5〜2ƛ， 试验有效。系列溶液A 中每一系列的终点稀释倍 数乘以ƛ，为每个系列的反应终点浓度。如果检 验的是经稀释的供试品，则将终点浓度乘以供试 品进行半定量试验的初始稀释倍数，即得到 每一系列内毒素浓度c。
鲎试剂
• 鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含 有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能够 准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和(1,3)-β-葡聚糖. • 普通鲎试剂 灵敏度0.5～0.125EU/ml，适用于仅需要检测内毒素限量的样品。 高灵敏度鲎试剂 灵敏度0.06～0.015 EU/ml，适用于内毒素限量较低的样品 细菌内毒素检查。 特异性鲎试剂 灵敏度0.5～0.015EU/ml，适用于成分较为复杂，会对鲎试剂 产生干扰的样品。 定量法鲎试剂 最低检测限0.03～0.005 EU/ml，适用于需要对内毒素进行定 量测定的样品。
显色基质鲎试剂盒使用说明书 (终点显色法,含偶氮化试剂)
显色基质鲎试剂盒使用说明书(终点显色法，含偶氮化试剂)【用途】显色基质鲎试剂( Chromogenic End-point Tachypleus Amebocyte Lysate , CE TAL )用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。
【原理】鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品,鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。
在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C 因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm）。
在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。
同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。
【检测限】按反应时间不同可检测0.1EU/ml-1 EU/ml和0.01EU/ml -0.1EU/ml两个区间( 反应时间T 1 和T 2 见出厂检验报告) 。
【试剂盒组成】细菌内毒素工作品，2支鲎试剂， 1.7ml/支，2支显色基质，1.7ml/支，2支偶氮化试剂1，10ml/支，2支偶氮化试剂2，10ml/支，2支偶氮化试剂3，10ml/支，2支HCl (反应终止剂)，50ml/瓶，1瓶细菌内毒素检查用水，50ml/瓶，2瓶【贮存】阴凉处, 最佳2-8℃,避光贮存。
【用法】1 .材料和设备1.1 试剂鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1 、偶氮化试剂2 、偶氮化试剂3、HC l ( 反应终止剂) 、细菌内毒素检查用水。
1.2器材旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架。
恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。
注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的(我公司提供无热原耗材)。
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[精华]鲎试剂试验方法
鲎试剂实验方法
鲎试剂按实验方法可分为:凝胶法、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂。
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。
凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。
此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。
凝胶法鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.2ml/支的单个测试或0.5ml/支至
5.2ml/瓶的真空封口西林瓶装的多个测试。
使用时一般应加细菌内毒素检查用水复溶后使用。
厦门市鲎试剂实验厂有限公司的真空封口试管凝胶法鲎试剂是把鲎试剂直接灌装在试管中，在真空中压盖封口的新产品。
使用时直接用样品溶解鲎试剂，不会割伤手，更加简单方便安全。
特异性鲎试剂，即弃G因子鲎试剂，是厦门市鲎试剂实验厂有限公司国内首创的产品，它专一对内毒素起反应，避免了G因子旁路的干扰，使检测结果更加可靠，在药检和临床检验方面是不可或缺的理想检测试剂。
目前厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的各种内毒素检测鲎试剂均为特异性鲎试剂，都能对抗葡聚糖的干扰，只对内毒素起反应。
因此不列为独立品种。
动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂，这四种方法都是定量检测内毒素的。
这几种定量法鲎试剂统称光度法鲎试剂。
根据检测原理，终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。
终点浊度法未见商品化产品。
动态浊度法(又称动态比浊法)是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
动态浊度法的特点为:1. 能准确定量。
2.检测范围宽，可达4个数量级。
3.灵敏度高达0.005EU/ml。
4. 操作简便，系统自动检测分析，一步即成。
5. 经济实用，试剂样品需要量少，可降至50μL。
6. 和微生物检测系统Elx808(配套IU)及专用软件TALgent使用，一次可同时检测多达96个样品。
终点显色法和动态显色法都是属于显色基质法。
显色基质法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法，根据产物颜色判断内毒素浓度，又称为比色法。
显色基质法由于不依赖凝固蛋白形成凝胶，抗干扰能力强，特别适用于生物制品(蛋白、疫苗等)和临床样品(黄疸、血液、尿液)的细菌内毒素检测。
终点显色法是目前反应时间最短的鲎试验法，只需要16分钟就能得出结果。
而且可以偶氮化染色剂，避开某些有色检品自身颜色对鲎试验的干扰。
终点显色法不需要特殊的检测仪器就能准确定量。
动态显色法鲎试剂兼有动态浊度法和终点显色法鲎试剂的优点，抗干扰能力强，使用简单方便，检测范围宽，灵敏度高达0.005EU/ml, 是目前世界上最好的鲎试剂。
但是价格较高。
如果您仅需要检测样品的内毒素限量，可以选择凝胶法鲎试剂，通过确定内毒素限值及最大有效稀释倍数，做样品的干扰试验从而确定使用的鲎试剂的灵敏度。
如果您需要定量测定样品中内毒素含量则应选择显色基质鲎试剂盒或动态浊度法鲎试剂。
日常检测量不大时，可以选择终点显色法鲎试剂，用普通的分光光度计就可完成实验。
如果您检测的样品是生物制品、疫苗、血液制品等最好选用终点显色法鲎试剂或动态显色法鲎试剂。
如果您日常的检测量比较大，检测的样品对鲎试剂的干扰不大，可选用动态浊度法鲎试剂。
动态浊度法鲎试剂特别适用于制药企业对产品生产过程中的内毒素水平的监控。
动态浊度法与动态显色法需要带温育系统的动
态光度测定仪器及配套软件。
微生物检测系统El808(配套IU)适用于所有的定量法鲎试验。