外泌体提取 ppt课件
外泌体提取
Nanosight（NTA） 测粒径大小
电镜
测颗粒形态
有风险！
因为标本各异，提 取出外泌体进行电 镜检测可能无法得 到典型的图片
2. 血浆样品(不能用肝素抗凝) 1) 用采血针和抗凝管（含 EDTA）抽取全血，混匀； 2) 4 度下静置 3~4 小时（也可放置 4 度冰箱过夜），5000 rpm，4 度离心 5min，取上清即为血浆； 3) 可将血浆分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上
外泌体提取
Exosome 分离需知注意： 分离 exosome 前的样品不能加入任何 RNA 保护剂（如 Trizol，RNA later）；已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察， 只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。 1. 血清样品（不能加抗凝剂） （1）干燥管采血后，轻轻将全血滴入洁净的 EP 管或者离心管； （2）4 度下静置 3~4 小时，可见血块析出（也可放置 4 度冰箱过夜）； （3）5000 rpm，4 度离心 10min，可见淡黄色血清，取出上清后可再 3000rpm 4度离心 10min，以最大程度保证血清质量。 （4）将血清分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上
3. 细胞上清需要提前预备的实验材料：去除 exosome 的血清（自己制备或购买） 1) 培养皿的细胞汇合率达到 80%~90% 2) 把原有培养基吸掉，加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行）进行消化； 3) 细胞变圆后加入等体积的含正常血清培养基终止消化； 4) 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来； 5) 1100rpm，离心 5 分钟； 6) 吸掉上清液，用无 exosome 血清的培养基清洗细胞一次； 7) 1100rpm，离心 5 分钟； 8) 吸掉上清液，加入无 exosome 血清的培养基，悬浮细胞； 9) 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中（ 收集上清时细胞汇合率为60%~80%），继续培养； 10) 培养 48h~72h 后，收集细胞上清； 11) 2000 rpm，离心 10min，然后 10000 rpm, 30min, 去除细胞或者细胞碎片，取上清即可。
外泌体研究ppt课件
胞膜融合, 由细胞主动分泌释放到细胞外的腔
泌
内囊泡 (intraluminal vesicles, ILVs)。
体
直径约为30-150nm，具有“杯状”或 “碟状”形态, 外侧含有脂质双分子层。
的 携带母体细胞特征性生物信息分子，如蛋白质、脂质、脱氧核糖核酸(DNA)、信使 RNA(mRNA)、微小RNA（miRNA）以及非编码RNA（Non-codingRNA）等。
“货物”释放进入胞质内，并重新形成多
泌
不同来
泡体。
源的外
体
泌体进
外泌体直接与受体细胞膜融合，将携
入受体
带的“货物”释放进入受体细胞胞质。
的
细胞的 方式
外泌体上的配体与受体细胞膜上特殊
特
受体结合，既能起到信号传导作用，也能 通过内吞作用，将“货物”运入胞内。
征
.
8
外
泌
鉴 定
体 的 分
分
特 点
离 方 法
大部分内容物在外泌体的保 护下能够存在较长时间不被降解 并保持活性，具有较长的半衰期，
药肿
物 载
的
瘤 治
体疗
并且能作用于体内大部分器官，甚至于中枢 神经系统。普通药物会因为血脑屏障的存在 而被拒之脑外，无法发挥其药物活性，而外 泌体作为一种脂质囊泡则能够通行自由，对 于靶向脑部的药物有非常大的发展空间。
试剂盒
近年来各种商业化的外泌体提取试剂 盒逐渐得以推广。
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9
研究生科研汇报
外 泌 鉴 体的 透射电子显微镜 定 (transmission electron microscopy, TEM) 分 观察外泌体的大小、 形态，测量直径 离 与
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一种细胞分泌的小囊泡，它们在细胞间传递信息，参与调控细胞的生理活动，对于细胞间的相互作用和信号传导起着重要的作用。
因此，外泌体的提取方法对于细胞生物学和临床医学研究具有重要意义。
下面将介绍几种常用的外泌体提取方法。
1. 超速离心法。
超速离心法是目前常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养液进行低速离心，去除细胞残渣和细胞碎片，然后将上清液进行高速离心，将外泌体沉淀下来。
最后，用洗涤液洗涤沉淀物，得到纯净的外泌体。
这种方法操作简单，提取效率高，适用于大规模提取外泌体。
2. 超滤法。
超滤法是利用超滤膜对细胞培养液进行过滤，将外泌体从培养液中分离出来。
这种方法不需要离心步骤，操作简便，适用于小规模外泌体提取。
但是需要注意的是，选择合适的超滤膜孔径和分子量截留率，以确保外泌体能够有效地被提取出来。
3. 密度梯度离心法。
密度梯度离心法是利用不同密度的梯度液体将外泌体与其他细胞成分分离开来。
首先，将细胞培养液加入密度梯度离心管中，然后进行超速离心，外泌体会沉淀在不同密度的梯度液体中。
通过调整离心参数，可以将外泌体从其他细胞成分中有效地提取出来。
这种方法提取的外泌体纯度较高，适用于对外泌体纯度要求较高的实验。
4. 免疫亲和法。
免疫亲和法是利用外泌体表面蛋白与特定抗体的结合来提取外泌体。
首先，将抗体固定在亲和树脂上，然后将细胞培养液与亲和树脂进行免疫反应，外泌体会与抗体结合，然后通过洗涤等步骤将外泌体从亲和树脂上提取出来。
这种方法可以选择特定的外泌体蛋白进行提取，适用于对外泌体特定蛋白的研究。
总结。
外泌体的提取方法多种多样，可以根据实验的需要选择合适的方法。
在进行外泌体提取时，需要注意操作规范，避免外泌体的污染和损失。
同时，根据实验要求选择合适的提取方法，可以提高外泌体的提取效率和纯度，为后续的实验研究提供可靠的样品。
希望以上介绍的外泌体提取方法能够对您的研究工作有所帮助。
细胞生物学-外泌体-文献汇报ppt课件
离
验
及
培
养
统
计
Matrigel体内
学
成血管实验
处
理
HUVEC网状 结构形成实验
PKH26荧光标记 外泌体观察与 HUVEC间相互作 用
Matrigel：基底膜基质
HUVEC. ：人脐带静脉内皮细胞
骨髓间充质干细胞的分离及培养 无菌抽取
正常献髓者骨髓 约5ml
密度梯度离心法
骨髓单个核细胞
DF12完全培养液
• MSC可以抑制淋巴细胞产生和分泌IFN-γ，我们实验结果也证明在培养 PBMNC时，加入BM-MSC分泌的外泌体能抑制其产生IFN-γ，这说明外泌体 可能是其中一个作用机制。miR．301a为NF—KB通路关键分子，与肿瘤迁移 、炎症反应有关。
• BM—MSC外泌体可以促进HUVEC向血管结构形成，这在临床上有重要应用 价值，如对缺血损伤性疾病等等。
人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体特性研究
• 本研究旨在探讨正常人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC)分泌的外泌体(exosome)免疫调节功能及支持血管 形成能力。
• 结论：BMMSC分泌外泌体具有免疫调节功能与支持血管形成作用。
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背景知识
图4
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图5
在两者共培养时BMMSC外泌体明显促进HUVEC网状结构的形成，对照组为(4579． 00±358．38)，实验组为(9149．67±470．70)，结果有统计学意义(P<0．01)(图5)。
在裸鼠体内实验中，在外泌体组 可明显见到血管生成，对照组无肉眼 可见血管生成(图6)。
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图6
讨论
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一种外泌体的提取方法及其应用与流程
一种外泌体的提取方法及其应用与流程一、引言外泌体是一种存在于细胞外液中的小颗粒，其直径一般在30-150纳米之间。
外泌体中富含蛋白质、核酸、脂质等生物分子，具有广泛的生物学功能。
近年来，外泌体的提取方法及其应用得到了广泛关注。
本文将介绍一种常用的外泌体提取方法，并探讨其在生物医学研究中的应用与流程。
二、外泌体提取方法目前常用的外泌体提取方法主要包括超速离心法、滤膜法、沉淀法和免疫亲和法等。
其中，超速离心法是最常用的方法之一。
其主要步骤如下：1. 收集细胞培养上清液或生物体体液，如血浆、尿液等。
2. 进行一系列离心步骤，以去除细胞碎片和大颗粒物质。
一般先进行低速离心，去除大颗粒物质，然后再进行高速离心，沉淀外泌体。
3. 分离外泌体。
将高速离心上清液转移到新离心管中，再次进行超高速离心，将外泌体沉淀下来。
4. 去除上清液，将外泌体沉淀悬浮于适当的缓冲液中。
三、外泌体的应用与流程外泌体作为一种新型的细胞间通讯介质，具有广泛的应用前景。
下面将介绍其在生物医学研究中的应用与流程。
1. 生物标志物的发现与应用外泌体中含有丰富的蛋白质和核酸等生物分子，这些分子的组成和含量可以反映细胞的生理状态和病理变化。
因此，外泌体被广泛应用于生物标志物的发现与应用。
研究人员可以通过分析外泌体中的蛋白质和核酸的组成，来寻找与特定疾病相关的生物标志物，从而实现早期诊断和治疗监测。
2. 药物传递系统的研究与应用外泌体具有天然的包裹和传递生物分子的能力，因此被广泛应用于药物传递系统的研究。
研究人员可以将药物封装在外泌体中，并通过改变外泌体的表面性质，实现药物的靶向输送和释放。
这种外泌体作为药物传递系统的方法具有较高的稳定性和生物相容性，对于治疗肿瘤等疾病具有潜在的应用价值。
3. 疾病机制的研究与探索外泌体中富含的生物分子可以提供重要的疾病机制信息。
通过分析外泌体中的蛋白质和核酸的组成，研究人员可以了解疾病发生发展的分子机制，从而为疾病的治疗和预防提供新的思路和靶点。
外泌体提取
外泌体提取
Exosome 分离需知注意： 分离 exosome 前的样品不能加入任何 RNA 保护剂（如 Trizol，RNA later）；已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察， 只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。 1. 血清样品（不能加抗凝剂） （1）干燥管采血后，轻轻将全血滴入洁净的 EP 管或者离心管； （2）4 度下静置 3~4 小时，可见血块析出（也可放置 4 度冰箱过夜）； （3）5000 rpm，4 度离心 10min，可见淡黄色血清，取出上清后可再 3000rpm 4度离心 10min，以最大程度保证血清质量。 （4）将血清分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上 2. 血浆样品(不能用肝素抗凝) 1) 用采血针和抗凝管（含 EDTA）抽取全血，混匀； 2) 4 度下静置 3~4 小时（也可放置 4 度冰箱过夜），5000 rpm，4 度离心 5min，取上清即为血浆； 3) 可将血浆分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上 3. 细胞上清需要提前预备的实验材料：去除 exosome 的血清（自己制备或购买） 1) 培养皿的细胞汇合率达到 80%~90%时； 2) 把原有培养基吸掉，加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行）进行消化； 3) 细胞变圆后加入等体积的含正常血清培养基终止消化； 4) 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来； 5) 1100rpm，离心 5 分钟； 6) 吸掉上清液，用无 exosome 血清的培养基清洗细胞一次； 7) 1100rpm，离心 5 分钟； 8) 吸掉上清液，加入无 exosome 血清的培养基，悬浮细胞； 9) 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中（ 收集上清时细胞汇合率为60%~80%），继续培养； 10) 培养 48h~72h 后，收集细胞上清； 11) 2000 rpm，离心 10min，然后 10000 rpm, 离心 30min, 去除细胞或者细胞碎片，取上清即可。
干货外泌体的提取储存、临床应用和给药途径
干货外泌体的提取储存、临床应用和给药途径摘要：外泌体是细胞分泌的纳米级细胞外小囊泡，携带核酸、蛋白质、脂质等生物活性物质，在机体的生理病理过程中发挥作用。
与脂质体、纳米颗粒等合成载体相比，外泌体的内源性和异质性使其在疾病诊断和治疗领域具有广泛而独特的优势。
直径约 40-100nm 的外泌体是由细胞分泌的生物纳米级球形脂质双层囊泡，以 1.13-1.19 g ∙ mL-1 的密度漂浮在梯度溶液中。
1981 年，科学家Trams 等将质膜来源的囊泡统称为外泌体，并首次提出了“外泌体”的概念，将其视为具有5'-核苷酸酶活性的膜囊泡，可能具有生理功能，起源于各种细胞系培养物的分泌物。
外泌体 Exosomes目前定义的外泌体（40-100nm）于1983年首次在绵羊网织红细胞中发现，科学家Johnstone 等人追踪了网织红细胞成熟过程中的转铁蛋白受体，发现外泌体的形成是成熟红细胞中转铁蛋白受体丢失的机制细胞。
为了将它们与其他类型的细胞外囊泡(EV) 区分开来，它们被命名为外泌体。
然而，值得注意的是，根据ISEV 2018 指南，“外泌体”一词即使被广泛使用，也被建议替换为“小细胞外囊泡(sEVs)”一词，由于分离方法上的困难。
研究发现，外泌体含有核酸、蛋白质、脂质、细胞因子、转录因子受体等生物活性物质。
其中，外泌体蛋白成分主要分为两类，一类是公共成分，参与这一过程囊泡的形成和分泌，即外泌体无处不在，包括膜转运和融合相关蛋白（如Rab、GTPases）、热休克蛋白（如HSP70、HSP90）、四跨膜蛋白超家族（如CD63、CD81）、 ESCRT 复合物相关蛋白（如 Tsg101、Alix）、整合素等；另一种是特异性成分，与其祖细胞密切相关，即细胞特异性，如抗原呈递细胞来源的CD45和MHC-II。
随着外泌体研究的深入，其应用越来越广泛。
外泌体可以在生理和病理过程中发挥作用，充当细胞间通讯和物质交换的介质。
外泌体研究演示课件
被认为是细胞间分子交换和信息传递的生物纳米颗粒。
6
研究生科研汇报
外
人体中大约有1014个外泌体，近乎于平均每个细胞产生 1000-10000个。
泌
正常细胞及肿瘤细胞均分泌外泌体，恶性肿瘤细胞较非
体
恶性细胞能分泌更多外泌体。通过分析外泌体可以直接获得
癌细胞的基本信息。
的
特
被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液及乳汁等体
体
体在与一种包含多肽的囊泡结合后, 囊泡与
的
细胞膜分离, 分泌到上清, 这是人类首次观测 到游离于细胞外存在的囊泡。
发
现 与
1987年, 他们发现这些囊泡中含有在网织红细胞成熟过程中丢失的一些成分（乙酰 胆碱酯酶、葡萄糖转运蛋白、核苷转运蛋白和转铁蛋白受体等），同时, 他们发现这些 囊泡膜具有网织红细胞细胞膜的特征, 比如也有极高的鞘磷脂含量, 显示了其区别于细胞
纳米粒子跟踪分析 (nanoparticle tracking analysis, NTA)
测量外泌体的直径
Western-blot （ WB ） 法 或 磁 珠 分选的免疫学方法等可清楚地 分析外泌体表面存在标志蛋白
流式细胞技术
(flow cytometry, FACS) 分离外泌体并分析其纯度
Байду номын сангаас
10
的 特 征
携带母体细胞特征性生物信息分子，如蛋白质、脂质、脱氧核糖核酸(DNA)、信使 RNA(mRNA)、微小RNA（miRNA）以及非编码RNA（Non-codingRNA）等。
表面标记蛋白主要有 Alix，TSG101，CD63，CD9，CD81和 HSP70。主要含有以下几种 物质：MHC I 类和/或 II 类分子、热休克蛋白（hsp）、四跨膜蛋白、整合素、细胞骨架 蛋白以及一些生物酶类。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一种细胞外囊泡，其在细胞间传递信号、调节免疫应答、参与细胞间通讯等方面发挥着重要作用。
因此，外泌体的提取方法对于研究细胞间通讯、疾病诊断和治疗等具有重要意义。
本文将介绍几种常用的外泌体提取方法，希望能够对相关研究工作提供一定的参考价值。
1. 超速离心法。
超速离心法是目前常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养上清液收集起来，并经过一系列离心步骤，逐渐提取出外泌体。
这种方法操作简单，提取效率较高，适用于大量样本的处理。
但是，超速离心法需要专业的离心设备，并且在操作过程中需要严格控制离心参数，以确保外泌体的完整性和纯度。
2. 超滤法。
超滤法是利用超滤膜的选择性透过性，将外泌体从细胞培养上清液中分离出来的方法。
这种方法操作简便，无需离心设备，适用于小样本的处理。
但是，超滤法对超滤膜的选择和使用要求较高，需要根据外泌体的大小和特性选择合适的超滤膜，以确保提取的外泌体具有较高的纯度和完整性。
3. 免疫磁珠法。
免疫磁珠法是利用特定抗体与外泌体表面标记物的结合，通过磁珠的作用将外泌体从细胞培养上清液中提取出来的方法。
这种方法操作简便，提取效率高，适用于特定标记物的外泌体的提取。
但是，免疫磁珠法需要具有高特异性和亲和性的抗体，且对于不同类型的外泌体需要选择不同的抗体，因此在实际操作中需要进行充分的前期筛选和验证工作。
4. 超声法。
超声法是利用超声波对细胞培养上清液进行处理，破碎细胞膜，将外泌体释放出来的方法。
这种方法操作简便，无需昂贵的设备，适用于小样本的处理。
但是，超声法对超声处理的参数和时间需要进行严格控制，以避免外泌体的损伤和降解。
综上所述，外泌体提取方法各有特点，选择合适的方法需要根据具体实验要求和条件来确定。
在实际操作中，需要根据样本的特性和实验的目的，选择合适的外泌体提取方法，并进行充分的验证和优化工作，以确保提取的外泌体具有较高的纯度和完整性。
希望本文介绍的外泌体提取方法能够对相关研究工作提供一定的帮助和参考价值。
最常用的外泌体提取方法
最常用的外泌体提取方法外泌体作为近几年来的研究热点，受到了科研工作者的青睐及追捧。
由于外泌体内携带有大量的miRNA, 少量lncRNA,Mrna 以及DNA蛋白质成为液体活检的潜力无限的研究对相。
所以，获得纯度高、内容物完整的外泌体非常之重要，那么，外泌体的提取方法也显得尤为重要。
一、差速离心法差速离心法可以说是最传统最普遍的外泌体提取方法。
原理是：首先低速离心以除去细胞和细胞凋亡碎片；随后，高速离心以去除大囊泡；最后高速离心以沉淀外泌体。
具体步骤是: 以下所有步骤都在4℃下进行，1、300×g 10min，弃沉淀，去除细胞2、2000×g 20min，弃沉淀，去除死细胞3、10,000×g 30min ，弃沉淀，去除细胞碎片等亚细胞成分4、10,000×g 70min，弃上清，沉淀即为外泌体5、PBS（每10ml细胞培养液用30mlPBS重悬）清洗沉淀物，混匀， 10,000×g 70min6、l ml PBS溶解沉淀（外泌体），立即使用或置于-80℃备用。
7、一般超速离心法会结合密度梯度离心，这样得到的外泌体更纯，具体做法第4步后蔗糖梯度离心，10,000×g 70min，以去除密度大于1.21g/ml的颗粒。
优点是：成本低，操作简单，获得的囊泡数较多。
缺点是：耗时耗力（需用时8-30h，并且每次只能处理6个样本），获得的外泌体纯度不是很高，高速及重复离心也会对外泌体产生很大的伤害，并且不适用于如血浆和血清等粘性液体生物样本。
二、密度梯度离心法该方法由于比较繁琐，用的较少。
原理是：像所有的脂质小囊泡一样，外泌体可以悬浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范围1.13g/ml-1.21g/ml，将要分离外泌体的样本液体置于梯度蔗糖介质上，随后通过离心将外泌体分离。
此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时，对离心时间极为敏感。
具体步骤是：收集培养2d的上清液。
外泌体的介绍和进展ppt课件
•种类繁多
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外泌体可以看作细胞的信使，分泌母细胞的缩微 ，以旁分泌和自分泌的形式影响远处细胞从以下 几种方式影响 这也就是为什么主要的研究存在 于肿瘤领域
•免疫 •凋亡 •血管生成 •炎症 •凝结 •----内异症
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外泌体的功能
•外泌体可以携带蛋白，运送RNA，在细胞间物质和 信息转导中起重要作用。外泌体可能通过调控免疫 功能，促进肿瘤血管新生和肿瘤转移，以及直接作 用于肿瘤细胞等途径，影响肿瘤的进展。外泌体可 应用于肿瘤的诊断。本文总结了近年来有关外泌体 在肿瘤发展中作用的研究进展。
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治疗部分
•目前关于其治疗文献研究不多，但其思路是癌细胞和免疫细胞都会释放不同的 Exosome，根据癌细胞释放的exsomes不同，癌症远处转移的器官不同，我们如果 能够block癌症释放的exosomes，加强免疫细胞的exosomes的免疫监视，则能够 治疗癌症
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•Exosomes----the next small thing
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But...
•"I don't think GPC1 CrExos is a cancer-specific biomarker," commented Nicola Schultz, MD, PhD, a consultant surgeon in the Department of Gastrointestinal Surgery and Transplantation at the Rigshospitalet, University of Copenhagen, in Denmark, who was approached by Medscape Medical News for comment.5来自exosomes的应用