碱性磷酸酶的提取PPT演示课件
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a ) 蛋 白 质 ＋ C u2+ 碱性 Cu+ BCA试剂 紫色化合物 b）利用分光光度计测吸光度 c）设计标准曲线计算蛋白质含量
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Байду номын сангаас
使用BCA法测定蛋白含量的原因
a) 对酶的比活力测定中蛋白定量发现BCA法在本样品体系 中灵敏度高、抗干扰能力强，适合采用此法进行蛋白含 量测定。
b ） 与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试 剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。 与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
碱性磷酸酶的提取及其分离纯化
制作人：周晓玲
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碱性磷酸酶 介绍以及应用
碱 性 磷 酸 酶 ( Alkaline phosphatase, 简 称 A K P ) , 是一种有广泛使用价值的生化试剂, 可专一性
地水解磷酸单酯化合物而释放无机磷。主要用 于核酸研究, 分析、测定核苷酸顺序及其基因 的重组、分离, 也是酶标免疫测定技术的常用 工具酶之一, 药用化妆品中添加AKP有益于皮 肤细胞的再生和新陈代谢, 还可用于核苷酸脱 磷生产核苷等。
混匀后离心（2000 转/分）5分钟
提取操作流程 c）
上清液(V2)
沉淀
混匀后离心（2000转 /分）5分钟
加入冷95%乙醇
X2ml(X2=0.857V2),使乙 醇最终浓度达60%
加入0.1ml pH8.8Tris缓冲液
加0.5M醋酸镁
（-20°冰箱保存） 充分溶解
沉淀
上清液
8
AKP纯化程度鉴定
F
e1 e2
r2
AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中 则形成沉淀。通过离心可以使AKP和其他蛋白分离，从而得到
纯化。反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。
4
碱性磷酸酶的提取方法——有机溶剂沉淀法
常用的有机溶剂：
乙醇:沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核 酸、多糖等生物大分子的沉析.
2
碱性磷酸酶的制备来源
a) AKP多数是从动物如小牛(或猪、鸡)肠粘膜、牛脾等动 物脏器中提取制备，一般商品化的AKP都是从小牛肠道 中分离得到。
b) AKP很少很少从微生物中分离，因为如果用原核表达， 很可能造成折叠有问题，不一定有正确的酶活力。
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碱性磷酸酶的提取方法——有机溶剂沉淀法
原理：乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂可以通过降低介质的介电常数 及对酶蛋白的脱水作用而降低酶的溶解度。
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研究与讨论
a ) 可 以 结合SDS PAGE法检测纯化结果。 b）可以使用等电聚焦电泳来检验酶样品的均一度。 c ） 可 以 结 合 使 用 其 他 检 测 方 法 ， 如 可 以 使 用 福林-酚试剂显 色法用来测定蛋白质浓度。用盐分级沉淀法来进行分离纯化等。
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b) 原理：在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷 酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原 经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。测定红色衍生物的吸光 度就可以计算酶活性的大小。
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② AKP的蛋白含量测定—BCA法
原理：BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混 合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质 将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合 物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
a) 纯化程度用酶的比活性反映。 b）酶比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。
AKP比活性（U/mg）=
每ml制剂中AKP活性单位数（U）① 每ml制剂中蛋白质含量（mg）②
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①APK的活性测定—磷酸苯二钠为底物的金氏法
a) 酶活力单位定义:1mLO.lmol/L的碳酸盐缓冲液(PH值10.0), 加入1ml0.01mol/L的磷酸苯二钠,37℃预热5min,然后加人0. 1ml酶液,混匀后于37℃保温15min, 再加人3ml铁氢化钾, 最 后在510mm波长下测定,产生1umol酚的酶量为一个活力单位 ( U )。
丙酮:沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广. 正丁醇:能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解在溶液 中.
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提取操作流程 a）
取动物组织于 研钵中剪碎
加0.01M醋酸镁0.01M醋酸钠
滤液
(V)
弃渣
室温静置20分钟 用滤纸过滤
研磨2-3分钟
转移入刻度 离心管
于离心管中加 入正丁醇，用 玻棒充分搅拌
2分钟左右
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提取操作流程 b）
滤液
(V)
加入等体积冷丙酮，立即 混匀后离心（2000转/分）
5分钟
沉淀
加入0.5M醋酸镁，用玻棒充分 搅拌,记录体积(V1)
上清液
向溶液中缓慢加入95%冷乙醇X1ml (X1=0.46V1)，使乙醇终浓度达30%
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向溶液中缓慢加入95%冷乙醇X1ml (X1=0.46V1)使乙醇终浓度达30%
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Байду номын сангаас
使用BCA法测定蛋白含量的原因
a) 对酶的比活力测定中蛋白定量发现BCA法在本样品体系 中灵敏度高、抗干扰能力强，适合采用此法进行蛋白含 量测定。
b ） 与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试 剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。 与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
碱性磷酸酶的提取及其分离纯化
制作人：周晓玲
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碱性磷酸酶 介绍以及应用
碱 性 磷 酸 酶 ( Alkaline phosphatase, 简 称 A K P ) , 是一种有广泛使用价值的生化试剂, 可专一性
地水解磷酸单酯化合物而释放无机磷。主要用 于核酸研究, 分析、测定核苷酸顺序及其基因 的重组、分离, 也是酶标免疫测定技术的常用 工具酶之一, 药用化妆品中添加AKP有益于皮 肤细胞的再生和新陈代谢, 还可用于核苷酸脱 磷生产核苷等。
混匀后离心（2000 转/分）5分钟
提取操作流程 c）
上清液(V2)
沉淀
混匀后离心（2000转 /分）5分钟
加入冷95%乙醇
X2ml(X2=0.857V2),使乙 醇最终浓度达60%
加入0.1ml pH8.8Tris缓冲液
加0.5M醋酸镁
（-20°冰箱保存） 充分溶解
沉淀
上清液
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AKP纯化程度鉴定
F
e1 e2
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AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中 则形成沉淀。通过离心可以使AKP和其他蛋白分离，从而得到
纯化。反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。
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碱性磷酸酶的提取方法——有机溶剂沉淀法
常用的有机溶剂：
乙醇:沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核 酸、多糖等生物大分子的沉析.
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碱性磷酸酶的制备来源
a) AKP多数是从动物如小牛(或猪、鸡)肠粘膜、牛脾等动 物脏器中提取制备，一般商品化的AKP都是从小牛肠道 中分离得到。
b) AKP很少很少从微生物中分离，因为如果用原核表达， 很可能造成折叠有问题，不一定有正确的酶活力。
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碱性磷酸酶的提取方法——有机溶剂沉淀法
原理：乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂可以通过降低介质的介电常数 及对酶蛋白的脱水作用而降低酶的溶解度。
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研究与讨论
a ) 可 以 结合SDS PAGE法检测纯化结果。 b）可以使用等电聚焦电泳来检验酶样品的均一度。 c ） 可 以 结 合 使 用 其 他 检 测 方 法 ， 如 可 以 使 用 福林-酚试剂显 色法用来测定蛋白质浓度。用盐分级沉淀法来进行分离纯化等。
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b) 原理：在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷 酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原 经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。测定红色衍生物的吸光 度就可以计算酶活性的大小。
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② AKP的蛋白含量测定—BCA法
原理：BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混 合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质 将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合 物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
a) 纯化程度用酶的比活性反映。 b）酶比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。
AKP比活性（U/mg）=
每ml制剂中AKP活性单位数（U）① 每ml制剂中蛋白质含量（mg）②
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①APK的活性测定—磷酸苯二钠为底物的金氏法
a) 酶活力单位定义:1mLO.lmol/L的碳酸盐缓冲液(PH值10.0), 加入1ml0.01mol/L的磷酸苯二钠,37℃预热5min,然后加人0. 1ml酶液,混匀后于37℃保温15min, 再加人3ml铁氢化钾, 最 后在510mm波长下测定,产生1umol酚的酶量为一个活力单位 ( U )。
丙酮:沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广. 正丁醇:能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解在溶液 中.
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提取操作流程 a）
取动物组织于 研钵中剪碎
加0.01M醋酸镁0.01M醋酸钠
滤液
(V)
弃渣
室温静置20分钟 用滤纸过滤
研磨2-3分钟
转移入刻度 离心管
于离心管中加 入正丁醇，用 玻棒充分搅拌
2分钟左右
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提取操作流程 b）
滤液
(V)
加入等体积冷丙酮，立即 混匀后离心（2000转/分）
5分钟
沉淀
加入0.5M醋酸镁，用玻棒充分 搅拌,记录体积(V1)
上清液
向溶液中缓慢加入95%冷乙醇X1ml (X1=0.46V1)，使乙醇终浓度达30%
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向溶液中缓慢加入95%冷乙醇X1ml (X1=0.46V1)使乙醇终浓度达30%