治疗性单抗及其在皮肤科的应用
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1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（12/14） ）
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（3/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
常用骨髓瘤细胞系：SP2／0、NS1、P3.653 。 融合时骨髓瘤细胞的选择： a.处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高 于95％ ； b.细胞株保持HGPRT缺陷状态。
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抗体发展三阶段
二、单克隆抗体---细胞工程抗体生成技术 单克隆抗体---细胞工程抗体生成技术 ---细胞工程抗体
1975年 德国学者Kohler和英国学者Milstein利用细 1975年，德国学者Kohler和英国学者Milstein利用细 Kohler和英国学者Milstein 胞融合（杂交瘤） 胞融合（杂交瘤）技术首次成功制备出第二代抗体 ----单克隆抗体 细胞工程抗体）， 单克隆抗体（ ），开创了抗体技 ----单克隆抗体（细胞工程抗体），开创了抗体技 术的新时代 新时代。 术的新时代。 新时代。 新时代。
淋巴细胞可以通过主要和次要合成途径合成，在 在HAT培养基中，A阻断了主要合成途径，因此 只能通过次要合成途径合成。
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
骨髓瘤细胞因为HGPRT-，只能由主要合成途径 合成，但在HAT培养基中，A阻断了主要合成途 径，最后导致骨髓瘤细胞死亡。
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体药物市场快速增长
1997年全球抗体药物销售额仅3.1亿美元，，2008年已超 1997年全球抗体药物销售额仅3.1亿美元，，2008年已超 年全球抗体药物销售额仅3.1亿美元，，2008 400亿美元 亿美元， 1997年到现在增长了100多倍 1997年时 年到现在增长了100多倍。 年时， 过400亿美元，从1997年到现在增长了100多倍。1997年时， 市场份额为千分之一；2008年市场份额提升至5.2%。 年市场份额提升至5.2% 市场份额为千分之一；2008年市场份额提升至5.2%。在 这十一年中，抗体药物年销售额复合增速高达56% 56%， 这十一年中，抗体药物年销售额复合增速高达56%，是总 药品销售增速的6 药品销售增速的6倍。
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（13/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
1、动物体内诱生
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
2、体外细胞培养
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（1/14） ）
1、致敏淋巴细胞的准备 2、骨髓瘤细胞的准备 3、饲养层细胞的准备 4、细胞融合 5、选择性培养 6、特异性抗体的检测 7、杂交瘤细胞的克隆化 8、杂交瘤细胞的冻存与复苏 9、单克隆抗体的大量制取 10、单克隆抗体的纯化
杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选， 杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分 泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来， 泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通 常也称为抗体检测。 常也称为抗体检测。
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞， 细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞， 既具有瘤细胞的无限分裂的能力， 既具有瘤细胞的无限分裂的能力，又具有产 生特异性抗体的B细胞的能力。 生特异性抗体的B细胞的能力。将这种克隆 化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠腹水内 即可获得大量的高效、单一的特异性抗体。 即可获得大量的高效、单一的特异性抗体。
对检测方法的要求： 灵敏度高 特异性强 简便快速 常用检测方法：ELISA
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（10/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞， 从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或多个杂交 瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的。 瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质 的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化。 的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化。
抗体的基本结构和功能
四、与FC受体结合发挥调理作用 与FC受体结合发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体的基本结构和功能
抗体 是对其抗原有极强专一性 的 其抗原有极强专 极强专一性 巡弋飞弹 魔弹 或 巡弋飞弹
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
概 述
常用饲养细胞：小鼠腹腔巨噬细胞，小鼠脾细胞，小 鼠或大鼠胸腺细胞等。 饲养细胞主要作用：可能在培养液中释放某种生长刺 激因子；满足新生细胞对细胞密度的依赖性；减少聚苯 乙烯培养板孔对新生细胞的毒性等。
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
概 述
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体的基本结构和功能 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗 原特异性结合的免疫球蛋白。
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体的基本结构和功能
重链与 重链与轻链 可变区与恒定区 可变区与 高变区（HVR）与骨架区（FR） 变区（HVR）与骨架区（FR） 在V区内，某些区域氨基酸组成及序 区内，某些区域氨基酸组成及序 列变化较其它区域更易变化， 列变化较其它区域更易变化，称为高 较其它区域更易变化 变区或互补决定区（CDR） 变区或互补决定区（CDR）。超变区 或互补决定区 之外的部位称为骨架区。 之外的部位称为骨架区。
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（5/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
目的
防止污染及变异 避免染色体丢失 防止细胞密度过高而死亡 方法 冻存： 冻存：慢冻 复苏： 复苏：快融
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体的基本结构和功能
一、中和毒素
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体的基本结构和功能Hale Waihona Puke Baidu
二、中和病毒
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体的基本结构和功能
三、激活补体产生细胞溶解作用（CDC） 激活补体产生细胞溶解作用（CDC）
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（14/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
1、辛酸硫酸铵沉淀法 2、亲和层析法
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
6、特异性抗体 的检测
HAT
胸腺嘧啶核 苷（T）
7、杂交瘤细胞 的克隆化
核苷酸
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
DNA
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（7/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（4/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体发展三阶段
三、基因工程抗体 二、单克隆抗体 (细胞工程抗体) 一、多克隆抗体 （抗血清） 抗血清）
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体发展三阶段
一、多克隆抗体-整体水平抗体生成技术 多克隆抗体-
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体发展三阶段
三、基因工程抗体 二、单克隆抗体 (细胞工程抗体 细胞工程抗体) 细胞工程抗体 一、多克隆抗体 （抗血清）
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单抗制备过程（ 单抗制备过程（2/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备
用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B 用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞
2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体发展三阶段
二、单克隆抗体---细胞工程抗体生成技术 单克隆抗体---细胞工程抗体生成技术 ---细胞工程抗体
1982年 Levy等制备了针对一位B 1982年，Levy等制备了针对一位B淋巴细胞瘤患者瘤 等制备了针对一位 细胞的单抗，患者经此抗体治疗后。病情缓解， 细胞的单抗，患者经此抗体治疗后。病情缓解，瘤体 消失。此次临床治疗的成功，使治疗性单抗成为生物 消失。此次临床治疗的成功， 医学的研究热点， 医学的研究热点，许多以单抗为研究对象的公司也随 之相继成立。 之相继成立。
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（8/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备
随机融合后的细胞类型
细胞组合 淋巴细胞 + 骨髓瘤 淋巴细胞 + 淋巴细胞 骨髓瘤 + 骨髓瘤 未融合淋巴细胞 未融合骨髓瘤 HGPRT + + + 生长状态 长期生长 短期生长 不能生长 短期生长 不能生长
3、饲养层细胞 的准备
目的：建立单一细胞克隆 方法：有限稀释法，显微操作法，软琼脂培养法
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（11/14） ）
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（6/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
HAT选择培养原理
3、饲养层细胞 的准备
核苷酸主要合成途径
4、细胞融合
核苷酸补救合成途径
次黄嘌 呤（H）
5、选择性培养
氨基碟呤 （A）
2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（9/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单克隆抗体技术原理 单克隆抗体技术原理
单抗定义
由一个识别单一抗原决定簇的B细胞克隆所产生的同源抗体。 由一个识别单一抗原决定簇的 细胞克隆所产生的同源抗体。 细胞克隆所产生的同源抗体
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单克隆抗体技术原理 单克隆抗体技术原理
骨髓瘤细胞在 体外培养能大 量无限增殖， 量无限增殖， 但不能分泌特 异性抗体 B细胞在抗原刺激 细胞在抗原刺激 有产生和分 下，有产生和分 泌特异性抗体的 能力。 能力。但不能在 体外无限增殖。 体外无限增殖。
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（12/14） ）
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（3/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
常用骨髓瘤细胞系：SP2／0、NS1、P3.653 。 融合时骨髓瘤细胞的选择： a.处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高 于95％ ； b.细胞株保持HGPRT缺陷状态。
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体发展三阶段
二、单克隆抗体---细胞工程抗体生成技术 单克隆抗体---细胞工程抗体生成技术 ---细胞工程抗体
1975年 德国学者Kohler和英国学者Milstein利用细 1975年，德国学者Kohler和英国学者Milstein利用细 Kohler和英国学者Milstein 胞融合（杂交瘤） 胞融合（杂交瘤）技术首次成功制备出第二代抗体 ----单克隆抗体 细胞工程抗体）， 单克隆抗体（ ），开创了抗体技 ----单克隆抗体（细胞工程抗体），开创了抗体技 术的新时代 新时代。 术的新时代。 新时代。 新时代。
淋巴细胞可以通过主要和次要合成途径合成，在 在HAT培养基中，A阻断了主要合成途径，因此 只能通过次要合成途径合成。
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
骨髓瘤细胞因为HGPRT-，只能由主要合成途径 合成，但在HAT培养基中，A阻断了主要合成途 径，最后导致骨髓瘤细胞死亡。
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体药物市场快速增长
1997年全球抗体药物销售额仅3.1亿美元，，2008年已超 1997年全球抗体药物销售额仅3.1亿美元，，2008年已超 年全球抗体药物销售额仅3.1亿美元，，2008 400亿美元 亿美元， 1997年到现在增长了100多倍 1997年时 年到现在增长了100多倍。 年时， 过400亿美元，从1997年到现在增长了100多倍。1997年时， 市场份额为千分之一；2008年市场份额提升至5.2%。 年市场份额提升至5.2% 市场份额为千分之一；2008年市场份额提升至5.2%。在 这十一年中，抗体药物年销售额复合增速高达56% 56%， 这十一年中，抗体药物年销售额复合增速高达56%，是总 药品销售增速的6 药品销售增速的6倍。
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（13/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
1、动物体内诱生
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
2、体外细胞培养
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（1/14） ）
1、致敏淋巴细胞的准备 2、骨髓瘤细胞的准备 3、饲养层细胞的准备 4、细胞融合 5、选择性培养 6、特异性抗体的检测 7、杂交瘤细胞的克隆化 8、杂交瘤细胞的冻存与复苏 9、单克隆抗体的大量制取 10、单克隆抗体的纯化
杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选， 杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分 泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来， 泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通 常也称为抗体检测。 常也称为抗体检测。
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞， 细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞， 既具有瘤细胞的无限分裂的能力， 既具有瘤细胞的无限分裂的能力，又具有产 生特异性抗体的B细胞的能力。 生特异性抗体的B细胞的能力。将这种克隆 化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠腹水内 即可获得大量的高效、单一的特异性抗体。 即可获得大量的高效、单一的特异性抗体。
对检测方法的要求： 灵敏度高 特异性强 简便快速 常用检测方法：ELISA
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（10/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞， 从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或多个杂交 瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的。 瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质 的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化。 的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化。
抗体的基本结构和功能
四、与FC受体结合发挥调理作用 与FC受体结合发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体的基本结构和功能
抗体 是对其抗原有极强专一性 的 其抗原有极强专 极强专一性 巡弋飞弹 魔弹 或 巡弋飞弹
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
概 述
常用饲养细胞：小鼠腹腔巨噬细胞，小鼠脾细胞，小 鼠或大鼠胸腺细胞等。 饲养细胞主要作用：可能在培养液中释放某种生长刺 激因子；满足新生细胞对细胞密度的依赖性；减少聚苯 乙烯培养板孔对新生细胞的毒性等。
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
概 述
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体的基本结构和功能 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗 原特异性结合的免疫球蛋白。
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体的基本结构和功能
重链与 重链与轻链 可变区与恒定区 可变区与 高变区（HVR）与骨架区（FR） 变区（HVR）与骨架区（FR） 在V区内，某些区域氨基酸组成及序 区内，某些区域氨基酸组成及序 列变化较其它区域更易变化， 列变化较其它区域更易变化，称为高 较其它区域更易变化 变区或互补决定区（CDR） 变区或互补决定区（CDR）。超变区 或互补决定区 之外的部位称为骨架区。 之外的部位称为骨架区。
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（5/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
目的
防止污染及变异 避免染色体丢失 防止细胞密度过高而死亡 方法 冻存： 冻存：慢冻 复苏： 复苏：快融
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体的基本结构和功能
一、中和毒素
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体的基本结构和功能Hale Waihona Puke Baidu
二、中和病毒
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体的基本结构和功能
三、激活补体产生细胞溶解作用（CDC） 激活补体产生细胞溶解作用（CDC）
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（14/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
1、辛酸硫酸铵沉淀法 2、亲和层析法
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
6、特异性抗体 的检测
HAT
胸腺嘧啶核 苷（T）
7、杂交瘤细胞 的克隆化
核苷酸
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
DNA
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（7/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（4/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体发展三阶段
三、基因工程抗体 二、单克隆抗体 (细胞工程抗体) 一、多克隆抗体 （抗血清） 抗血清）
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体发展三阶段
一、多克隆抗体-整体水平抗体生成技术 多克隆抗体-
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体发展三阶段
三、基因工程抗体 二、单克隆抗体 (细胞工程抗体 细胞工程抗体) 细胞工程抗体 一、多克隆抗体 （抗血清）
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（2/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备
用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B 用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞
2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
抗体发展三阶段
二、单克隆抗体---细胞工程抗体生成技术 单克隆抗体---细胞工程抗体生成技术 ---细胞工程抗体
1982年 Levy等制备了针对一位B 1982年，Levy等制备了针对一位B淋巴细胞瘤患者瘤 等制备了针对一位 细胞的单抗，患者经此抗体治疗后。病情缓解， 细胞的单抗，患者经此抗体治疗后。病情缓解，瘤体 消失。此次临床治疗的成功，使治疗性单抗成为生物 消失。此次临床治疗的成功， 医学的研究热点， 医学的研究热点，许多以单抗为研究对象的公司也随 之相继成立。 之相继成立。
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（8/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备
随机融合后的细胞类型
细胞组合 淋巴细胞 + 骨髓瘤 淋巴细胞 + 淋巴细胞 骨髓瘤 + 骨髓瘤 未融合淋巴细胞 未融合骨髓瘤 HGPRT + + + 生长状态 长期生长 短期生长 不能生长 短期生长 不能生长
3、饲养层细胞 的准备
目的：建立单一细胞克隆 方法：有限稀释法，显微操作法，软琼脂培养法
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（11/14） ）
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（6/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
HAT选择培养原理
3、饲养层细胞 的准备
核苷酸主要合成途径
4、细胞融合
核苷酸补救合成途径
次黄嘌 呤（H）
5、选择性培养
氨基碟呤 （A）
2、骨髓瘤细胞 的准备
3、饲养层细胞 的准备
4、细胞融合
5、选择性培养
6、特异性抗体 的检测
7、杂交瘤细胞 的克隆化
8、杂交瘤细胞 的冻存与复苏
9、单克隆抗体 的大量制取
10、单克隆抗 体的纯化
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单抗制备过程（ 单抗制备过程（9/14） ）
1、致敏淋巴细 胞的准备 2、骨髓瘤细胞 的准备
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单克隆抗体技术原理 单克隆抗体技术原理
单抗定义
由一个识别单一抗原决定簇的B细胞克隆所产生的同源抗体。 由一个识别单一抗原决定簇的 细胞克隆所产生的同源抗体。 细胞克隆所产生的同源抗体
广西医科大学第一附属医院 皮肤性病科
单克隆抗体技术原理 单克隆抗体技术原理
骨髓瘤细胞在 体外培养能大 量无限增殖， 量无限增殖， 但不能分泌特 异性抗体 B细胞在抗原刺激 细胞在抗原刺激 有产生和分 下，有产生和分 泌特异性抗体的 能力。 能力。但不能在 体外无限增殖。 体外无限增殖。